全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 0120028205
农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究
汪秀志1 　张红宇2 　汪旭东2 　吴先军2
(11 黑龙江八一农垦大学农学院作物系 ,黑龙江 大庆　163319 ; 21 四川农业大学水稻研究所 ,四川 温江　611130)
摘 　要 :利用农杆菌介导法将分别位于不同质粒上的 gus 基因和 npt Ⅱ基因按照 1∶1 和 1∶3 的浸染浓度混
合共转化粳稻品种鄂宜 105 和中花 12 种子胚诱导的愈伤组织 ,结果从 43 棵经潮霉素反复筛选的再生
植株中获得 21 棵共转化植株。经 PCR 分析表明 ,2 个基因的共转化率分别为 47137 %和 60100 %。
Southern Blot 和 Western Blot 检测发现 , gus 基因已经整合到水稻基因组中并且表达。遗传分析证实外源
基因在 T1 中大多以孟德尔方式进行遗传。本研究分析了影响转化率的几个因素如浸染菌量比例和品
种之间的关系 ,以期进一步提高共转化的效率。
关键词 :水稻 ;共转化 ;农杆菌介导
A PRELIMINARY STUDY ON Agrobacterium Tumefaciens2MEDIATED
CO2TRANSFORMATION OF DOUBLE GENES IN RICE
WANG Xiu2zhi1 　ZHANG Hong2yu2 　WANG Xu2dong2 　WU Xian2jun2
(11 HLJ August First Land Reclamation University , Daqing , Heilongjiang 　163319 ;
21 Rice Research Institute of Sichuan Agricultural University , Wenjiang , Sichuan 　611130)
Abstract : Gus and npt Ⅱgenes were constructed separately with their respective vectors and co2transformed into mature seed2
derived calli of japanica rice cultivars Eyi 105 and Zhonghua 12 with a strain dosage ratio of 1∶1 and 1∶3 respectively through
Agrobacterium tumef aciens2mediated transformation. 21 transgenic plants contained gus gene were gained from 43 regeneration
plants. The results of PCR showed that co2transformation efficiency of these two genes were 47137 % and 60100 % ,
respectively. The results of Southern Blot and Western Blot analysis showed that Gus had been integrated into rice genome.
Genetic analysis confirmed Mendelian segregation was popular among T1 plants in progeny. In this study , some key problems
were discussed such as the relation of transformation rate and strain dos percent , which would be help to support the mutualism
effect .
Key words :rice ;co2transformation ; Agrobacterium tumef aciens2mediated
收稿日期 :2008206220 　接受日期 :2008209226
作者简介 :汪秀志 (19782) ,女 ,辽宁沈阳人 ,硕士 ,从事水稻分子育种研究。E2mail :wangxiuzhi9711 @163. com　　培育高产、优质、抗病虫害和抗逆境等具有多个优良性状的作物品种是作物遗传育种改良学家的共同愿望[1 ] 。随着越来越多的优良基因被克隆[2 ] ,人们试图通过构建多基因或多个表达载体 ,采用一次、多次基因转化或共转化的方法获得多价转基因作物 ,剔除转基因植物中的标记基因[3 ,4 ] ,以实现作物的综合改良 ,近年来已有一些成功的报道[5～7 ] 。水稻作为世界上最主要的粮食作物之一 ,一直是 人们研究的热点。虽然有一些水稻共转化成功的报道[8～12 ] ,但多数都是利用基因枪直接导入法 ,或者将多个基因构建在一个载体中进行转化。基因枪法得到的共转化效率较高 ,但易造成后代中外源目的基因多拷贝 ,影响外源基因在受体植株后代中的稳定遗传和有效表达。共用一个载体利用农杆菌介导法转化多个基因 ,容易使转基因片段发生缺失或者部分目的基因丢失。本研究利用农杆菌介导的双质粒Π双菌株共转化
82　 核 农 学 报　2009 ,23 (1) :28～32Journal of Nuclear Agricultural Sciences
系统成功地将位于不同质粒上的 2 个外源基因 ( gus
基因和 npt Ⅱ基因) 导入 2 个粳稻品种 ,实现了水稻多
基因转化 ,并通过统计分析 ,对愈伤组织诱导、共转化
频率、不同浸染菌量比对共转化的影响及共转化的协
同性等问题进行了探讨。
1 　材料与方法
111 　供试材料
pCAMBIA1301和 pCAMBIA2200 来源于澳大利亚 CAMBIA ;根
癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 由复旦大
学 遗 传 所 提 供 ; 转 化 载 体 pCAMBIA13012gus2HYG 和
pCAMBIA22002 npt Ⅱ2km由复旦大学遗传所构建 ,筛选标记基因
是潮霉素抗性基因 ( hyg) 。
受体材料为粳稻品种鄂宜 105 和中花 12 成熟胚
或幼胚诱导的愈伤组织。
112 　培养基
诱导培养基 (MS2 ) : MS0 + 2 ,4 - D 2mgΠL ;共培养
基 (MSCO) : MS2 + AS (液体培养基 , 不加 phytagel )
100μmolΠL ,pH512 ;选择培养基 (S1 ) :MS2 + Hpt (潮霉素)
30mgΠL + Cef (头孢霉素) 250mgΠL ;选择培养基 ( S2 ) :
MS2 + Hpt 50mgΠL + Cef 250mgΠL ;分化培养基 :MS0 + KT
2mgΠL + NAA 012mgΠL + 6 - BA 2mgΠL + Hpt 30mgΠL ;生
根培养基 :1Π2 MS0 + Hpt 15mgΠL + NAA 015mgΠL。
113 　方法
愈伤组织诱导 ,菌的活化 ,共培养 ,愈伤组织选择、
分化与植株再生等参照张红宇[15 ]的方法进行。
114 　再生植株的 PCR检测
按 Edwavds 等人[16 ] 的方法提取再生植株 DNA 作
PCR 模板 ,以阳性质粒作正对照 ,未转化植株 DNA 作
负对照 ,按常规 PCR 操作对标记基因 hyg 先进行扩
增 ,再对外源基因 gus 和 npt Ⅱ进行扩增 ,引物序列见
表 1 ,产物用 115 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。
115 　Southern blot 分析
按 Boehringer Mannheim 说明书程序对 gus 基因
PCR 阳性转化植株进行 Southern blot 分析。先用
Hind Ⅲ酶切植物总 DNA(约 10 ng 样品) ,37 ℃过夜 ,再
以地高辛 (DIG)标记的 gus 基因片段为探针进行杂交。
116 　Western blot 分析
按照《分子克隆》的方法进行植株总蛋白抽提及蛋
白量的检测 ,SDS2PAGE 胶电泳 ,蛋白质电转移和考马
斯亮兰染色。
印迹膜的免疫检测 :将膜转入培养皿中加入 50ml
表 1 　扩增目的基因的引物序列
Table 1 　The primer sequences of aimed genes
基因名称
gene name
引物序列
primer sequence
hpt hpt21 : 5′2ACTCACCGCGACGTCTGTCG23′
hpt22 : 5′2GATCTCCAATCTGCGGGATC23′
gus gus21 : 5′2CCATACCTGTTCACCGACGA23′
gus22 : 5′2GGAATTGATCAGCGTTGGTG23′
npt Ⅱ npt Ⅱ21 : 5′2GAAGGCGATAGAAGGCGATGC23′
npt Ⅱ22 : 5′2GTCATCTCACCTTGCTCCTGCC23′
封阻液 ,室温轻摇孵育 115 - 2h。然后转入含抗血清
(1∶1000)的 Antiserum Buffer ,室温轻摇孵育 60min。孵
育后将膜用Antiserum Buffer (无抗血清)摇动洗涤 3 次 ,
每次 5min。再在培养皿中加入 10ml 含 AP2anti2Ig 的封
阻液。孵育 60min ,PBST洗 3 次 ,在培养皿中用 2ml 的
显色液避光显色 10min。
2 　结果与分析
211 　品种间转化效率的差异
收集中花 12 和鄂宜 105 在共培养后的抗性愈伤
组织和转化的数据 ,利用 SPSS 统计软件进行分析 ,结
果如表 2 所示。在 3 种不同的转化条件下 ,中花 12 在
抗性愈伤得率和转化频率上都优于鄂宜 105 ,差异较
大。说明转化频率受基因型 (品种) 的影响 ,选择合适
的转基因受体是实现高效转基因的关键。
212 　PCR检测
提取经连续潮霉素筛选后获得的抗性再生植株
T0 代的总 DNA 进行外源基因的 PCR 检测。首先对潮
霉素标记基因进行筛选 ,发现再生植株中都扩增出条
带。再对转化的 gus 和 npt Ⅱ这 2 个目的基因进行扩
增验证 ,结果共获得转单基因 gus 阳性植株 26 株 ,转
双基因中 gus 阳性植株 39 株 ,在这 39 株 gus 阳性植株
中有 21 株同时表现 npt Ⅱ阳性 ,为共转化植株。图 1、
2、3 表明这些外源基因已经整合到受体基因组中。
潮霉素是检验外源基因 gus 和 npt Ⅱ在 T0 代植株
中是否存在的筛选剂 ,将 21 株共转化植株 T0 代的种
子分别在加有潮霉素 100mgΠL 的培养基上进行发苗筛
选 ,对存活的 T1 代植株进行 PCR 扩增 ,检测 gus 和
npt Ⅱ的连锁情况。结果显示 ,有 12 株符合孟德尔的
3∶1的遗传分离定律 ,另外 9 株的遗传分离表现为
15∶1。说明 2 个目的基因都没有丢失 ,能在后代中稳定
遗传。
92　1 期 农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究
表 2 　不同条件下的抗性愈伤得率和转化频率
Table 2 　The frequency of resistant callus and transformation under different conditions
转化条件
transformation
材料
material
第一 组
group 1
第二组
group2
第三组
group 3
选择愈伤
select
callus
抗性愈伤
resistant
callus
阳性植株
positive
plants
选择愈伤
select
callus
抗性愈伤
resistant
callus
阳性植株
positive
plants
选择愈伤
select
callus
抗性愈伤
resistant
callus
阳性植株
positive
plants
抗性愈伤率
resistant
callus( %)
转化率
ttransformation
rate ( %)
gus
鄂宜 105
Eyi105 405 137 6 511 174 8 351 125 5 34140 ±01972 115 ±010709
中花 12
Zhonghua12
111 45 2 164 67 3 114 47 2 40187 ±01344 118 ±010379
gus : npt Ⅱ
= 1∶1
鄂宜 105
Eyi105 137 29 1 169 35 2 41 8 0 20175 ±01850 0186 ±01597
中花 12
Zhnghua12
93 29 2 137 44 3 58 17 1 31125 ±11431 2108 ±01258
gus : npt Ⅱ
= 1∶3
鄂宜 105
Eyi105 32 13 1 63 25 2 44 18 1 40129 ±01642 2188 ±01507
中花 12
Zhnghua12
74 32 2 105 48 4 77 35 2 44192 ±11358 3113 ±01671
图 1 　转 gus 基因再生植株的 PCR 结果
Fig. 1 　The PCR results of the gus gene to the regenerated plants
M:DL2000 ; 阳性 :用阳性质粒为模板 ,所得的扩增片段为 1540bp ; 阴性 :用非转基因植株的 DNA 为模板 ;
1～10 :转 gus 基因的 T0 代植株 ,1、6、7、8 为 PCR 阴性植株。
M: DL2000 ; positive : positive plasmid as a template , the fragment is 1540 bp ;negative : using the DNA of non2transgenic plants as a template ;
1～10 : the T02generation plants with gus gene , NO. 1 ,6 ,7 ,8 are negative plants in PCR analysis
图 2 　转 npt Ⅱ基因再生植株的 PCR 结果
Fig. 2 　The PCR results of the npt Ⅱgene to the regenerated plants
M:DL2000 ; 阳性 :用阳性质粒为模板 ,所得的扩增片段为 470bp ;阴性 :用非转基因植株的 DNA 为模板 ;
1～11 :转 npt Ⅱ基因的 T0 代植株 , 1、8、10 为 PCR 阴性植株
M: DL2000 ; positive : positive plasmid as a template , the fragment is 470 bp ;negative : using the DNA of non2transgenic plants as a template ;
1～11 : the T02generation plants with npt Ⅱgene , NO. 1 ,8 ,10 are negative plants in PCR analysis
214 　Southern blot 分析
由于 PCR 只能证明在转基因植株体内存在外源目
的基因片段 ,而不能确定外源目的基因片段在植物基因
组的拷贝数 ,因此进一步采用 Southern blot 分析验证。
用 EcoR I和 Pst I酶切质粒中的 gus 基因 ,得到 gus
基因片段 ,大小分别为 512kb、417kb、315kb 和 115kb , 充当阳性对照及 marker。取未转化的水稻及独立转化的水稻植株 (单基因和双基因转化) ,抽提总 DNA ,用Hind III(探针中不含此酶切位点)消化总 DNA ,杂交。1至 4 号植株的杂交结果如图 4 所示。未转化的水稻鄂宜 105 无条带 ,而转化阳性植株则出现单拷贝或双拷贝条带 ,证明 gus 基因已整合到受体水稻基因组中。
03 核　农　学　报 23 卷
表 3 　浸染菌量比例对 T0 、T1 代植株共转化效率的影响
Table 3 　Effect of strain dosage percent on the co2transformation rate of callus in T0 ,T12generation plants
处理条件
treatment
材料
material
gus 阳性苗
gus positive
seedling
gus + npt Ⅱ
双阳性苗
gus + npt Ⅱdouble
positive seedling
共转化频率
co2transformation
rate ( %)
T1 转基因按 3∶1
分离的株系数
separation ratio
of T1 transgenic
plants according to 3∶1
T1 转基因按 15∶1
分离的株系数
separation ratio
of T1 transgenic
plants according to 15∶1
gus :
npt Ⅱ= 1∶1
Eyi105
Zhonghua12
6
13
3
6
50100
46115 47137 24 12
gus :
npt Ⅱ= 1∶3
Eyi105
Zhonghua12
6
14
4
8
6617
57114 60100 15 33
图 3 　转基因植株中 hpt 基因的 PCR 结果
Fig. 3 　The PCR results of the hpt gene
to the transgenic plants
M:DL2000 marker ;阳性 :以阳性质粒为模板 ;
阴性 :以非转基因植株的 DNA 为模板 ;
1～5 :转基因 T0 代植株 ,皆为阳性植株。
M: DL2000 marker ; positive : positive plasmid as a template ;
Negative : DNA of a non2transgenic plants as a template ;
1～5 : transgenic plants T0 , are positive plants
215 　Western blot 分析
为了验证目的基因在转基因植株中是否能够顺利
翻译表达 ,需要对部分 PCR 阳性植株进行 Western blot
分析 ,检测 GUS 蛋白的表达情况 (图 5) 。选择 5 株
PCR 阳性植株进行分析 ,结果表明 :2 号和 5 号的植物
总蛋白能够发生抗原抗体反应 ,显示蓝色 ,其他没有显
色的转基因植株说明 gus 基因的蛋白表达率较低 ,不
能顺利验出。Western Blot 分析说明 gus 基因已经整合
到转基因植株中的多个位点 ,而且顺利表达。
216 　浸染比例与共转化结果
利用 SPSS 软件对不同农杆菌浸染比例下相同品
种的转化率差异进行分析 ,结果见表 3。随着系统中
npt Ⅱ基因比例的提高 , gus 基因和 npt Ⅱ基因的共转化
频率显著提高。在共转化过程中 ,不同农杆菌菌株间
存在竞争 ,它们在浸染受体细胞时彼此争夺空间 ,本试
验中 ,这种共转化频率的提高实际上就是 npt Ⅱ基因
竞争力的提高导致的。考虑到在进行后代植株检测时
是以 gus 基因作为优先选择的对象 ,在进行共转化时 ,
一定要将浸染菌比例控制在一个比较协调的范围 ,以
免某一基因占据绝对优势。
图 4 　gus 基因的 Southern blot 分析
Fig. 4 　The Southern blot analysis of gus gene
1 和 2 :单基因转化水稻植株 ; 3 :双基因转化水稻植株 ;
4 :未转化的水稻鄂宜 105 ;5 :阳性对照及 marker
1 and 2 : Transformatic rice plants of single gene ;
3 : Transformatic rice plants of double gene ;
4 : No2transformatic rice Eyi105 ;5 : Positive control and marker
图 5 　gus2PCR 阳性植株的 Western blot 分析
Fig. 5 　Western blot analysis of part
gus2PCR positive plant
1 : 阳性对照 (gus 纯品 100ng) ;2～5 :转基因植株 ; 6 :非转基因植株
1 : positive control (gus pure 100 ng) ;2～5 : transgenic plants
6 : non2transgenic plants
3 　讨论
随着基因工程技术的不断发展和完善 ,多基因转
化成为近年来国内外科研工作者的研究热点 ,它不仅
13　1 期 农杆菌介导的水稻双基因共转化初步研究
有利于培育高产、优质、抗病虫害和抗逆境等具有多个
优良性状的作物品种 ,可以通过后代分离获得无选择
标记 的 转 基 因 植 株 ( Marker2free transgenic plants ,
MFTPS) [4 ,14 ,16 ,17 ] ,克服转基因安全性的问题 ,更为进行
多基因控制的生化代谢途径的研究开辟了新的领域。
本研究利用农杆菌介导法对水稻多基因共转化系
统进行了研究 ,发现利用共培养进行浸染时 ,不同菌株
间存在竞争。转单基因 gus 的试验中 ,鄂宜 105 和中
花 12 的转化率分别为 115 + 010709 % 和 118 +
010379 % ,而在共转化时转化效率却有明显提高 ,在
gus : npt Ⅱ= 1∶1 中的 gus 基因转化率在鄂宜 105 和中
花 12 中分别达到 413 %和 13198 % ,在 gus : npt Ⅱ=
1∶3中则分别达到 18175 %和 18192 % (表 2) 。这个结
果说明 ,共转化具有协同性 ,即一个菌株浸染的成功有
助于第二个菌株的浸染 ,为第二个菌株的浸染打开了
通道 ,这与前人的研究结果相吻合[13 ] 。当植物细胞处
于分裂旺盛期或 DNA 合成很活跃时 ,转化率最高。转
化只发生在细胞分裂的一个较短的时期内 ,可能只有
处于植物细胞分裂周期的 S 期 (DNA 合成期) 时才具
有外源基因的转化能力 ,因为只有当植物的核基因组
DNA 正在复制时才能使外源 DNA 整合。这说明只要
比例协调 ,我们就可以获得较高频率的共转化 ,同时说
明利用共转化的方法实现水稻多基因转化是切实可行
的。
常规的转化系统通常要在培养基里加入筛选剂 ,
以便从大量的非转基因苗中筛选获得转基因植株。利
用共转化的方法可通过两种方式去掉这些选择标记 :
①将筛选标记基因 (如 :抗生素的抗性基因、抗除草剂
基因、抗潮霉素基因等)和目的基因利用共转化的方法
一起转化到植物中 ,然后通过后代的分离 ,可得到有目
的基因而无标记基因的植株。Daley[18 ] 将标记基因和
目的基因分别插入到 2 个载体中 ,50 %的转化体同时
表达 2 个基因。这些共转化植株的后代中有 50 %只
表达目的基因。②利用 creΠlox 定位重组系统 ,将目的
基因与标记基因构建在同一个质粒上 ,其中标记基因
两侧带有同向的 lox 位点 ,在另外一个质粒上构建有
CAMV35S 启动子驱动的 cre 基因的表达载体。可先将
这 2 个质粒载体转入到同一个农杆菌菌株细胞中或分
别将这 2 个质粒载体转化植株后进行有性杂交 ,使上
述两种结构进入同一植株中。在 F1 代植株中 ,cre 重
组酶将删除 lox 位点间的标记基因。李雷[19 ] 等通过该
法转化烟草时 ,删掉标记基因 bar 基因 ,使目的基因
barnase 基因正确表达 ,证实了共转化烟草中位点特异
重组的过程是非常精确和高效的。
本研究还表明 ,共转化在不同受体材料间差异明
显 ,即受基因型影响较大 ,如表 2 中显示的不同品种的
转化率有很大差异。建议通过大规模筛选高愈伤诱导
率、高转化率、高再生力的模式水稻材料进行多基因转
化 ,再通过分子标记辅助选择手段进行转育 ,以实现综
合性状的改良。
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