全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032526204
不同剂量率的紫外线对红细胞及其膜的影响
王俊玲1 ,2 　王卫东1 　徐志昆1 　秦广雍1
(11 郑州大学离子束生物工程重点实验室 ,河南 郑州　450052 ; 21 河南交通职业技术学院 ,河南 郑州　450052)
摘 　要 :用剂量率分别为 2122、3133、4144 和 8188mWΠcm2 的紫外线照射由新鲜猪血制备的红细胞和红细
胞膜 ,通过检测红细胞的溶血度及红细胞、红细胞膜的过氧化程度来研究射线所致的辐射损伤。结果表
明 ,同一剂量下 ,经较低剂量率照射的红细胞溶血度较大 ,且受放置时间的影响很小 ,被辐射红细胞和红
细胞膜的过氧化产物丙二醛 (MDA)的量也显示反剂量率效应。
关键词 :紫外辐射 ;红细胞 ;红细胞膜 ;剂量率
EFFECT OF DOSE RATE ON UV2IRRADIATION INDUCED DAMAGE TO
ERYTHROCYTE AND ERYTHROCYTE MEMBRANE
WANGJun2ling1 ,2 　WANG Wei2dong1 　XU Zhi2kun1 　QIN Guang2yong1
(11 Zhengzhou University Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering , Zhengzhou , Henan 　450052 ;
21 Henan Vocational and Technical College of Communications , Zhengzhou , Henan 　450052)
Abstract :Erythrocyte and erythrocyte membrane made from fresh pig blood were irradiated with UV at dose2rates of 2122 ,
3133 , 4144 , 8188mWΠcm2 , respectively , and the radiation induced hemolysis and peroxidation were measured in order to
investigate the influence of the dose2rate of UV on radiation2induced membrane damage. The results indicated , at the same
dose , the hemolysis of erythrocyte in the low dose rate radiation were larger , and little sufferd by laying time. The peroxidation
products of irradiated erythrocyte and erythrocyte membrane also showed an inverse dose2rate effect .
Key words :UV2radiation ;erythrocyte ;erythrocyte membrane ;dose2rate
收稿日期 :2008210217 　接受日期 :2009202224
基金项目 :国家自然科学基金项目 (10505018)
作者简介 :王俊玲 (19832) ,女 ,河南尉氏人 ,硕士 ,研究方向为紫外辐射效应。Tel :0371265040885 ; E2mail :wangjunling0910 @1261com
通讯作者 :王卫东 (19762) ,男 ,河南正阳人 ,研究方向为辐射生物物理。Tel :0371267767728 ; E2mail :wwd413 @zzu. edu. cn　　对辐射生物学效应而言 ,剂量率是基本因素之一。一般来说 ,剂量率降低 ,照射时间延长 ,生物学效应将降低 ,这被称为正常的剂量率关系。但是 ,在辐射导致突变和肿瘤细胞的转化实验中发现 ,当剂量率降低时 ,生物学效应则上升 ,表现出反剂量率关系。在剂量率方面 ,前人的研究多集中在宏观生物学效应和遗传物质上。在分子水平上 ,脂质体和蛋白质方面的研究也表明存在反剂量率关系[1 ,2 ] 。由于膜系统和遗传物质紧密联系在一起 ,生物膜系统在辐射损伤中的作用往往无法准确定位 ,目前公认的事实是生物膜为辐射损伤中仅次于遗传物质 DNA 的重要靶分子 ,但是对于生 物膜系统辐射损伤中基本辐射作用因子的研究相对较少。由于哺乳类和啮齿类的红细胞膜没有细胞核和内膜体系的影响 ,易于观察辐射损伤后的效果 ,并且红细胞易于获得 ,分离纯化简单 ,容易保存。因此本试验以红细胞和红细胞膜为材料 ,研究了紫外辐射对其的辐射损伤效应的影响。111 　材料新鲜猪血来自鸿发屠宰场 ,与柠檬酸钠抗凝剂的比例为 7∶1。其余所用试剂均为分析纯。仪器设备主要有高速低温离心机 (BECKMAN Allegra X222R 型) 、TU21901 型双光束紫外可见分光光度计等。
625　 核 农 学 报　2009 ,23 (3) :526～529Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
112 　方法
11211 　红细胞的制备 　将抗凝剂处理过的猪血于 4 ℃
827g离心 30min ,弃上清液 ,下层红细胞用等渗的 PBS
缓冲液重复洗涤 3 次 (827g 离心 10min) ,得红细胞。
用 pH为 714 的 PBS 缓冲液稀释得不同浓度的红细胞
溶液。
11212 　红细胞膜的制备 　红细胞膜样品制备参照
Dodge 等[3 ]的方法并略加改进。将上述制备的红细胞
按 1∶40 的比例加入预冷的低渗 Tris2Hcl 缓冲液 ,其中
含有 1nmolΠL 的 EDTA 使膜免受破坏。混匀置于 4 ℃
下 2～3h ,使之完全溶血 ,然后于 4 ℃预冷的高速低温
离心机中 9184g 离心 30min ,重复洗涤 3 次 ,获得乳白
色的红细胞膜样品 ,并溶解在 pH为 714 的 PBS 缓冲液
中。
11213 　样品辐照 　紫外线按照波长可分为 UV2A (400
～320nm) 、UV2B (320～280nm) 和 UV2C (280～180nm) 3
种 ,其中 UV2C 的生物学效应最为明显。本试验采用
UV2C 波长为 254nm、功率为 40W 的紫外灯管。在
Φ3cm 培养皿中加入 1ml 的被测样品溶液 ,溶液的厚度
约为 2mm。调节被测样品与紫外灯管的距离 ,得到不
同的剂量率 (mWΠcm2 ) ,调节照射时间以达不同的剂量
(JΠm2 ) 。
113 　测定
11311 　溶血度的测定 　从血液中分离出红细胞 ,用
019 %的生理盐水洗 4 次 ,每次将淡黄色物质吸去 (最
后一次用 280g 离心 12min) ,再用 019 %的生理盐水将
红细胞稀释 250 倍。取 2ml 悬浮液于小平皿中 4 ℃静
置 2h ,轻摇小平皿 ,然后再加 2ml 019 %的生理盐水。
照射后 ,小心吸出上清液离心 ,留下的红细胞加入 2ml
蒸馏水 ,使之充分溶血 ,然后离心。溶血度的计算公
式 : H ( %) = 100A1Π( A1 + A2 ) [4 ] ,式中 , A1 为上清液中
血红蛋白 Hb 在波长 522nm 处的吸光值 ; A2 为完全溶
血后 Hb 在波长 522nm 处的吸光值。
11312 　过氧化检测 　用硫代巴比妥酸 ( thiobarbituric
acid ,TBA)荧光法检测由照射引起红细胞和红细胞膜
的脂质过氧化 ,参照 Ming2Kuei Shih[5 ] 的方法并加以改
进。在 1ml 照射红细胞膜中加入 1ml 017 %的 TBA 和
1ml 215 %的三氯乙酸 (trichloro acetic acid ,TCA) ,红细
胞中加入 1ml 含 15 % (WΠV) 的 TCA、01375 % (WΠV) 的
TBA 和 0125molΠL HCL 的混合液。于沸水浴中加热
10min。冷却后 13225g 离心 10min ,取上清液在 532nm
处测量过氧化产物丙二醛 (malondialdehyde ,MDA) 的摩
尔吸光值 (MDA 的摩尔消光系数为 1156 ×105LΠmol·
cm) [6 ] 。
3 　结果分析与讨论
311 　不同剂量率的紫外线对红细胞溶血度的影响
图 1 分别为 2122、4144 和 8188mWΠcm2 的紫外线
照射的红细胞在放置 0、1、3 和 4h 后的溶血度。由图
可知 ,剂量较小时 ,红细胞溶血度随放置时间增加很
快 ,而剂量较大时 ,溶血度变化很小。在剂量较大 ( ≥
8JΠcm2 )时 ,红细胞的溶血度在放置 1h 时增加很快 ,而
后缓慢增加 ,但经 2122mWΠcm2 照射的红细胞在 16JΠ
cm
2 下放置 0h 与放置 1、3、4h 的溶血度相差很小 ,即较
大的剂量下 ,经较小剂量率照射的红细胞的溶血度在
照射完成之后就基本稳定 ,而经较大剂量率照射的红
细胞的溶血度在照射完成之后较小。后随放置时间增
加 ,在小剂量 (4JΠcm2 ) 下 ,经 2122 和 4144mWΠcm2 照射
的红细胞溶血度都是在放置 3h 时突然增加 ,之后基本
保持不变。而被 8188mWΠcm2 照射的红细胞溶血度则
呈逐渐增加的趋势 ,并且在剂量和放置时间相同的情
况下 ,经较低剂量率照射的红细胞溶血度较大 ,即紫外
线对红细胞溶血度的影响表现为反剂量率效应。
溶血是红细胞辐射损伤的一个重要形式。红细胞
的氧化损伤是溶血的重要原因 ,脂质过氧化的中间产
物自由基及最终产物丙二醛可以严重损伤膜结构 ,影
响膜的功能。同时 ,辐射使红细胞糖酵解酶和 ATP 酶
活性降低 ,影响红细胞的能量供应 ,从而使红细胞发生
溶血。本试验结果表明 ,红细胞的溶血程度随着剂量
的增加而增加 ;在同一剂量条件下随剂量率的变化呈
现出明显的反剂量率效果 ,即剂量率越小 ,溶血度越
大。
312 　不同剂量率的紫外线对红细胞和红细胞膜造成
的损伤
图 2 是 615 ×106 个Πml 的红细胞溶液和 310 ×107
个Πml 的红细胞膜经不同剂量率紫外线照射后产生的
MDA 量。由图 2 可以看出 615 ×106 个Πml 的红细胞溶
液在剂量较小的情况下 ,每个剂量率照射的红细胞溶
液产生 MDA 的量都保持照射前水平 ,是由于红细胞的
自我修复能力很强 ;当剂量达到 8JΠcm2 时 , 2122mWΠ
cm
2 照射的红细胞产生 MDA 的量急剧增加 ,而后随着
剂量逐渐增加。3133mWΠcm2 照射的红细胞在剂量达
到 12JΠcm2 时产生 MDA 量开始增加。4144mWΠcm2 照
射的红细胞产生MDA 量在剂量达到 16JΠcm2 时开始增
加 ,之后增幅加大。也就是说 ,经剂量率小的紫外线照
射的红细胞在剂量较小时 MDA 的量就开始增加 ,而被
剂量率大的紫外线照射的红细胞在剂量较大时 ,MDA
725　3 期 不同剂量率的紫外线对红细胞及其膜的影响
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　　　　
图 1 　不同剂量率紫外线照射的红细胞放置 0、1、3、4h 后的溶血度
Fig. 1 　The hemolysis of erythrocyte irradiated by different dose rate ultraviolet after laying 0、1、3、4h
a :0h ;b :1h ;c :3h ;d :4h
图 2 　615 ×106 个Πml 的红细胞 (A) 、310 ×107 个Πml 的红细胞膜 (B)经不同剂量率紫外线照射后产生的 MDA 含量
Fig. 2 　Formation of malondialdehyde in 615 ×106 cellsΠml erythrocyte solution、310 ×107 cellsΠml erythrocyte
membrane solution irradiated by different dose rate ultraviolet
的量才开始增加 ,即表现出所谓的反剂量率效应。310
×107 个Πml 的红细胞膜经不同剂量率紫外线照射后 ,
产生 MDA 的量基本呈线性增加 ,而且较低剂量率照射
的红细胞膜产生 MDA 量的增幅较大。
红细胞的溶血及红细胞和红细胞膜的过氧化都是
由细胞内脂质和蛋白质中的·OH 引起的自由基链式
反应的结果。Konings 和 Stank[7 ,8 ] 研究发现 ,在低剂量
率时每个单位时间内几乎没有形成脂质过氧自由基
ROO·,而与相邻完整分子的反应是普遍存在的。这种
情况下 ,链式反应被延长 ,所以低剂量率对细胞产生更
大程度地损伤。相反在 R·和 ROO·的浓度相对较高时
(由更高剂量率造成的) ,自由基间的反应取代了自由
基与完整分子间的反应 ,致使由·OH 引发的链式反应
蔓延过程受到限制 ,而链终止反应变得更普遍。自由
基间的反应将导致新反应形式的产生 ,从而改变膜的
化学属性 ,起到暂时阻止溶血的作用。所以高剂量率
对红细胞的影响小于低剂量率。
825 核　农　学　报 23 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
4 　结论
生物膜是辐射作用的一个重要靶分子 ,其辐射损
伤也一直是研究热点。膜的辐射损伤主要是自由基引
起的过氧化损伤。脂质过氧化产物 MDA 具有细胞毒
性 ,可交联膜蛋白和膜磷脂形成高分子聚合物 ,进而使
细胞出现形态和功能上异常。同时对生物体来说 ,剂
量率是电离辐射中的基本因素。本文初步研究了剂量
率为 2122 ,3133 ,4144 和 8188mWΠcm2 的紫外线对红细
胞的溶血度及红细胞和红细胞膜的脂质过氧化损伤情
况。结果表明 ,从溶血和过氧化程度两个指标来看 ,低
剂量率的紫外线辐照均产生较强的辐射损伤效应 ,呈
现出反剂量率效应。当然辐射在剂量率方面对红细胞
功能的影响需要更进一步深入研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Petkau A ,Chelack W S. Radioprotective effect of superoxide dismutase on
model phospholipid membranes [J ] . Biochim Biophys Acta ,1976 ,433 :
445～456
[ 2 ] 　Koufen P , Brdicka D , et al . Inverse dose2rate effects at the level of
proteins observed in the presence of lipids[J ] . Int J Radiat Biol ,2000 ,
76 :625～631
[ 3 ] 　Dodge J T ,Mitchell C ,et al . The preparation and chemical characteristic
of hemoglobin free ghosts of human erythrocytes [ J ] . Arch Biochem
Biophys ,1963 ,100 :119～130
[ 4 ] 　Mieczyslaw PUCHALA , Zofia2SZWEDA2LEWANDOWSKA , et al . The
Influence of Radiation Quality on Radiation2induced Hemolysis and
Hemoglobin Oxidation of Human Erythrocytes[J ] . J Radiat Res ,2004 ,45
(2) :275～279
[ 5 ] 　Ming2Kuei Shih , Miao2Lin Hu. Relative roles of metal ions and singlet
oxygen in UVA2induce liposomal lipid peroxidation [ J ] . Journal of
Inorganic Biochemistry , 1999 ,77 (3Π4) :225～230
[ 6 ] 　Agnieszka Sujak , Janina Gabrielska , Wojciech Grudzin ski , et al .
AspectsArchives of Biochemistry and Biophysics ,1999 , 371 (2) :301～
307
[ 7 ] 　Konings A W T. Effect of heat and radiation on mammalian cells [J ] .
Radiat Phys Chem ,1987 ,30 (5Π6) :339～349
[ 8 ] 　Stark G. The effect of ionizing radiation on lipid membranes[J ] . Biochim
Biophys ,1991 ,Acta 1071 :103～122
(上接第 525 页)
[ 4 ] 　Srivastava A , Handa A K. Hormonal regulation of tomato fruit
development : a molecular perspective [ J ] . Journal of Plant Growth
Regulation , 2005 , 24 :67～82
[ 5 ] 　Atherton J G, Rudieh J ,郑光华 ,沈征育. 番茄[M] . 北京 :北京农业
大学出版社 ,1989 ,256
[ 6 ] 　Wang Z F , Ying T J , Bao B L , Huang X D. Characteristics of fruit
ripening in tomato mutant epi [ J ] . Journal of Zhejiang University
SCIENCE , 2005 , 6B(6) :502～507
[ 7 ] 　Hart D J , Scott KJ . Development and evaluation of an HPLC method for
the analysis of carotenoids in foods and the measurement of the carotenoid
content of vegetables and fruits commonly consumed in the UK[J ] . Food
Chemisfry , 1995 , 54 :101～111
[ 8 ] 　Olives Barba A I , Cámara Hurtado M , Sánchez Mata M C , Fernández
Ruiz V , López Sáenz de Tejada M. Application of a UV2vis detection2
HPLC method for a rapid determination of lycopene andβ2carotene in
vegetables[J ] . Food Chemistry , 2006 , 95 :328～336
[ 9 ] 　Scott K J , Finglas P M , Scale R , Hart D J , Froidmont2Gortz I.
Interlaboratory studies of HPLC procedures for the analysis of carotenoids
in foods[J ] . Food Chemistry , 1996 , 57 :85～90
[10 ] 　Lelièvre J M , LatchéA , Jones B , Bouzayen M , Pech J C. Ethylene and
fruit ripening[J ] . Physiologia Plantarum , 1997 , 101 : 727～739
[11 ] 　Kollman G E , Staniforth D W. Hormonal aspects of seed dormancy in
Yellow Foxtail [J ] . Weed Science , 1997 , 20 : 472～477
[12 ] 　Skriver K, Olsen F L , Rogers J C , Mundy J . Cis2acting DNA elements
responsive to gibberellin and Its antagonist abscisic acid[J ] . Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America ,
1991 , 88 : 7266～7270
[13 ] 　Saniewski M , Czapski J . The effect of methyl jasmonate on lycopene and
β2carotene accumulation in ripening red tomatoes [ J ] . Cellular and
Molecular Life Sciences , 1983 , 39 : 1373～1374
[14 ] 　Imanishi S , Nagata M. The effect of methyl jasmonate on expression of
the genes involved in ethylene biosynthesis in tomato fruits[J ] . American
Society of Plant Biologists , Plant Biology , 2003 , July 25～July 30
[15 ] 　阮　英 , 生吉萍 , 刘开朗 , 申　琳. 番茄采后成熟过程种子和果
皮中脱落酸与乙烯代谢的关系. 中国农业大学学报 ,2005 ,10 (5) :
15～19
925Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (3) :526～529
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net