全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 032242204
米根霉丙烯醇抗性突变株的筛选及其发酵特性
郑　志　姜绍通　罗水忠　李兴江　潘丽军
(合肥工业大学生物与食品工程学院 ,安徽 合肥　230009)
摘 　要 :本研究利用亚硝基胍 (NTG)对米根霉 As313462 进行诱变 ,在含丙烯醇的 YPD 选择培养基上筛选
获得 11 株 ADH活力降低的突变株 ,其中 mut22 突变株发酵液中乙醇含量比原始菌株降低 3512 % ,而乳
酸含量提高了 7916 %。对原始菌株和 mut22 突变菌株在发酵过程中ADH与LDH活力变化分析表明 ,突
变菌株的最大 ADH 活力比原始菌株降低了 6016 % ,而 LDH 活力与原始菌株相比略有提高。研究结果
还表明 , mut22 突变菌株与出发菌株相比 ,其生物量和对还原糖的利用速率均比原始菌株提高。
关键词 :米根霉 ;L2乳酸 ;乙醇 ;ADH
SCREENING AND FERMENTATION CHARACTERIZATION OF RHIZOPUS ORYZAE
ALLYL ALCOHOL RESISTANT MUTANT
ZHENG Zhi 　J IANG Shao2tong 　LUO Shui2zhong 　LI Xing2jiang 　PAN Li2jun
( School of Biotechnology and Food Engineering , Hefei University of Technology , Hefei , Anhuui 　230009)
Abstract : Rhizopus oryzae As313462 was mutated with N2methyl2N’2nitro2N2nitrosoguanidine (NTG) and 11 allyl alcohol
resistant mutants were obtained with selective medium of yeast2peptone2dextrose ( YPD) containing 016 % allyl alcohol (VΠV) .
Among these mutants , mut22 had the highest conversion rate of 7512gΠL to L2lactic acid , increased 7916 % compared with
wild type strain , and conversion rate to ethanol decreased 3512 %. The comparisons of ADH specific activity and lactate
dehydrogenase (LDH) specific activity between the mutant and wild type strain during the fermentation showed that mut22 had
a markedly lower ADH specific activity and an appreciably higher LDH specific activity than wild type strain. The mut22 also
had higher consumption rate of glucose and biomass accumulation than wild type.
Key words : Rhizopus oryzae ; lactic acid ; ethanol ; ADH
收稿日期 :2006212231
基金项目 :教育部博士点基金项目资助 (20040359008)及合肥工业大学科学研究发展基金资助项目 (063001F)
作者简介 :郑志 (19712) ,男 ,安徽合肥人 ,副教授 ,从事农产品加工生物技术研究 ,E2mail :zhengzhi1971 @sina. com
通讯作者 :姜绍通 (19542) ,江苏阜宁人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事农产品生物化工教学与科研工作 ,E2mail :jiangst @hfut . edu. cn　　L2乳酸是一种重要的天然有机酸 ,在食品、医药、生物降解塑料的制造上有广泛应用 [1 ] 。米根霉( Rhizopus oryzae)由于具备好氧发酵、可直接利用淀粉做 C源、发酵产物 L2乳酸光学纯度高、产物易于分离等特点 ,而成为目前制备高光学纯度 L2乳酸的主要菌种[2 ] ,但米根菌发酵周期长、糖转化率低等缺点限制了其在实际生产中的应用[3 ] 。当前 ,国内外很多学者都在进行米根霉高产菌株的诱变选育研究[4～6 ] ,但存在筛选工作量大 ,突变菌株易退化 ,高产机理无法解释等不足。 代谢工程是生化工程的前沿研究领域 , 自从Bailey于 1991 年在《Science》上发表著名文章“Toward aScience of Metabolic Engineering”以来 ,其研究形成热潮[7 ] 。代谢工程的理论中心就是将每个反应当作网络的一个环节而不是单个反应 ,通过对整个代谢网络的优化得到所需代谢物的最大收率 (转化率) 。微生物代谢工程的一般流程是 :通过代谢分析进行设计 ,然后实施代谢改造 :一方面通过改变代谢流阻断或降低无益产物的合成 ;另一方面扩展和构建代谢途径 ,引入外源基因 ,从而延伸原来的代谢途径 ,生产新的末端代谢产
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物[8 ] 。Wright [9 ]采用14 C标记方法建立了米根霉产 L2乳
酸的代谢网络 ,即葡萄糖在胞内通过 EMP 途径生成丙
酮酸 ,在此丙酮酸是碳流分支的结点 :一部分丙酮酸在
乳酸脱氢酶 (LDH) 催化下转化为 L2乳酸 ,还有部分丙
酮酸经由丙酮酸脱羧酶 ( PDC) 、乙醇脱氢酶 (ADH) 生
成乙醇 ,或通过丙酮酸羧化酶 ( PC) 等酶催化形成苹果
酸和富马酸。因此 ,抑制 ADH 活性 ,降低丙酮酸向乙
醇支路的转化 ,可能会提高丙酮酸向乳酸支路的碳流 ,
提高乳酸的转化率。本研究将依据代谢工程原理 ,通
过诱变筛选获得米根霉 ADH 活性降低且乳酸转化率
提高的突变菌株 ,并对突变菌株在通氧条件下的发酵
特性及调控条件进行了研究。
1 　材料与方法
111 　材料
米根霉 As313462 购于广州微生物研究所菌种保
藏中心。
菌种保藏培养基为 PDA 斜面培养基 ;鉴别培养基
为添加了的溴酚兰平板培养基 ,即将上述灭菌后的
PDA 培养基冷却至 60 ℃,在无菌条件下分别加入溴酚
兰和脱氧胆酸钠各 1g ,并混合均匀。孢子活化培养基
为豆芽汁培养基。孢子萌发培养基为液体 YPD 培养
基 ,每升含蛋白胨 5g、酵母浸粉 3g、葡萄糖 20g。ADH
突变株筛选培养基是在每升上述液体 YPD 培养基中
添加丙烯醇 6ml ;发酵培养基 :每升含葡萄糖 120g 、
(NH4 ) 2 SO4 4g、MgSO4·7H2O 0125g、ZnSO4·7H2O 0144g、
KH2 PO4 013g、CaCO3 60g。
112 　方法
11211 　ADH突变株的诱变及筛选 　米根霉 ADH 突变
株的诱变筛选依照 Christopher 描述的方法[10 ] ,做适当
调整 ,其筛选原理是 ,原始菌株的 ADH活力较高 ,可以
将培养基中的丙烯醇转化成对菌体有毒害作用的丙烯
醛 ,导致自身无法生长 ,但 ADH 活力降低的突变菌株
可以在此培养基上生存 ,从而达到筛选的目的。具体
操作步骤如下 :
取活化后的米根霉 As313462 新鲜斜面 ,用生理盐
水洗下孢子 ,接至豆芽汁培养基 ,200 转Πmin 振荡培养
2h ,以诱导其萌发。然后在 4000rΠmin 转速下离心
10min ,弃上清液 ,将孢子用无菌生理盐水洗涤两次 ,再
用 012molΠL 的 pH610 磷酸缓冲液转至小三角瓶中 ,用
玻璃珠振荡打散 ,然后用脱脂棉过滤 ,以获得单孢子悬
液 ,调整孢子浓度约为 107 个Πml 左右。
分别取 415ml 单孢子悬浮液加入 6 支装有 011mgΠ
mL 的 NTG 015ml 的离心管中 ,充分混匀 ,以两支为一
组 ,立即置于 28 ℃水浴振荡 ,诱变处理 30min。离心收
集孢子 ,反复用缓冲溶液大量稀释终止 NTG的诱变作
用。向离心管中加入 5ml 无菌生理盐水 ,摇匀后取出
015ml 孢悬液 ,依次用 415ml 无菌生理盐水按 10 - 2 、
10 - 3 、10 - 4 、10 - 5 、10 - 6 、10 - 7稀释 ,利用平板倾注分离法
进行单菌落分离。
从单菌落平板上分离得到的孢子悬液接种于 PDA
平板 ,并在 34 ℃下进行中间培养 36h。然后用无菌水
将原始菌株孢子、经中间培养后的诱变孢子分别洗下 ,
各取 1ml 接种到含 016 %(vΠv)丙烯醇的 YPD 选择培养
基平板上 ,34 ℃下培养 48h。以原始菌株平板为对照 ,
将生长较好菌落挑出 ,接于 PDA 试管斜面 ,32 ℃培养
到长出孢子并变黑后 ,置于冰柜中保藏 ,即为初筛菌
株。
11212 　发酵实验
取米根霉 As313462 原始菌株、初筛后的诱变菌株
进行初步发酵。用无菌水洗下孢子 ,各取 1ml 孢子悬
液接种于发酵培养基内 ,置摇床 32 ℃,200 转Πmin 培
养 ,发酵 60h 后 ,测乳酸产量。
发酵试验中 ,用无菌水分别将出发菌株和 mut22
突变株的孢子洗下 ,各取 1ml 孢子悬液接于发酵培养
基中 ,装液量 20 % ,32 ℃,200 转Πmin ,摇床培养。每个
发酵条件用 3 个摇瓶平行实验。在发酵时间 12～72 h
中 ,每隔 6 h 取一瓶样。过滤后 ,发酵液用于测定乙醇
和乳酸含量 ;取相同湿重的菌丝体用蒸馏水将 CaCO3
洗净 ,破碎后测定 LDH 和 ADH 的比活力。所有结果
均取 3 次测定的平均值。
113 　分析测定
发酵液中还原糖的测定参照费林氏法[11 ] ;乳酸含
量的测定按 HPLC 法[12 ] ;发酵液中乙醇含量的测定采
用气相色谱法 ,使用 1790 气相色谱仪 ,配有氢火焰离
子化检测器 (安捷伦科技上海分析仪器有限公司) ,
N2000 色谱数据工作站 (浙江大学智达信息工程有限
公司) 。色谱柱采用的是 DB2WAX 毛细管柱 (美国安
捷伦科技公司进口) ,柱长 30m ,内径 0125mm ,液膜厚
度 015 º m。色谱条件 :N2 为载气 ,流速为 15mlΠmin ,进
样器 240 ℃,柱温 220 ℃,检测温度 250 ℃,进样量 1 ºL ,
分流比 1∶100 ,外标法定量。乳酸脱氢酶活力测定采
用紫外分光光度法[13 ] 。蛋白质含量的测定采用考马
斯亮蓝 G2250 染色法。乙醇脱氢酶酶活力的测定参照
乳酸脱氢酶测定方法 ,测定酶活力时用乙醛缓冲液替
代上述丙酮酸钠溶液。
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2 　结果与分析
211 　突变株的筛选及其对发酵产乳酸的影响
对米根霉 As313462 进行诱变处理后 ,在含丙烯醇
的 YPD 筛选平板上共获得 11 株单菌落 ,置试管斜面
保存 ,原始菌株一起进行初步的发酵试验 ,发酵 60h 后
乳酸产量如图 1 所示。
图 1 　ADH突变菌株与原始菌株发酵 60h 后乳酸产量分布
Fig. 1 　Lactic acid concentration of parent strain
and ADH mutants after 60h fermentation
由图 1 可以看到 ,原始菌株发酵 60h 后乳酸产量
为 4216gΠL ,诱变处理后 ,突变株 1、2、3、4、11、12 的乳酸
产量均高于原始菌株 ,分别为 6516、7512、6919、6018、
4513 和 5218gΠL。选取乳酸产量最高的突变菌株 2 ,命
名为 mut22 ,做后续研究。
212 　ADH突变菌株发酵过程中乙醇与乳酸转化
将 mut22 突变菌株与原始菌株接到发酵培养基中
培养 72h ,从 12h 开始 ,每隔 6h 取发酵液 ,测其乙醇与
乳酸含量 ,结果如图 2、3 所示。
图 2 　突变菌株 mut22 和原始菌株发酵产生的乙醇
Fig. 2 　Ethanol fermentated by mut22 and parent strain
由图 2 可以看出 ,原始菌株在发酵 72h 期间 ,发酵
液中乙醇含量一直高于突变菌株。原始菌株发酵到
54h ,其乙醇产量达到最大值 3011gΠL ,而突变菌株发酵
图 3 　突变菌株 mut22 和原始菌株发酵产生的 L - 乳酸
Fig. 3 　L2lactic acid fermentated by mut22 and
parent strain
48h 达到产量最大值为 1913 gΠL ,比原始菌株降低
3512 %。由图 3 可见 , mut22 突变菌株的乳酸产量在整
个发酵过程都显著高于原始菌株 ,发酵结束时比原始
菌株提高了 7916 % ,其原因是由于突变株的 ADH酶活
力较原始菌株下降 ,降低了发酵过程中流向乙醇支路
的碳流量 ,降低了乙醇产量 ,增大了向乳酸支路上的流
量 ,最终增加了乳酸的产量。图 2、3 也说明 ,通过诱变
筛选得到 ADH活力降低的突变株 ,以此来提高乳酸产
量是可行的。
213 　ADH突变菌株发酵过程中 ADH 与 LDH 比活力
变化
将 mut22 突变菌株与出发菌株接到发酵培养基中
培养 72h ,从 12h 开始 ,每隔 6h 取其菌丝体 ,测其 ADH
和LDH比活力 ,结果见图 4、5。
图 4 　发酵过程中 ADH活力变化曲线
Fig. 4 　ADH specific activity curve of mut22
and parent strain during fermentation
从图 4 和 5 可以看出 ,在整个发酵过程中 , mut22
突变株的 ADH 比活力始终都低于原始菌株 ,其最大
ADH 比活力比出发菌株降低了 6016 % ,而LDH比活力
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图 5 　发酵过程中 LDH活力变化曲线
Fig. 5 　LDH specific activity curve of mut22 and
parent strain during fermentation
略高于出发菌株。其中 12～42h 内 ,两菌株的 ADH 比
活力都是单调上升 ,最大值均出现在发酵 42～48h 间。
两菌株的LDH 比活力在 12～36h 都是单调上升 ,36h
后开始下降 ,其最大值均出现于 36h 左右。综合图 4
和 5 可以推测 ,正是由于 ADH 活力下降 ,导致丙酮酸
流向乙醇支路的碳流降低 ,较多的丙酮酸转向乳酸支
路 ,并促使LDH的活力有所增加。
214 　突变菌株的生物量积累及对还原糖的利用
mut22 突变菌株与原始菌株在发酵过程中生物量
的变化及对还原糖的利用情况见图 6 和 7。
图 6 　突变菌株和原始菌株发酵中生物量变化
Fig. 6 　Biomass curve of mut22 and parent
strain during fermentation
从图 6 可以看出 ,在相同条件下发酵 72h , mut22
突变菌株的生物量积累始终高于出发菌株。图 7 则显
示发酵 72h 后 ,原始菌株的糖利用率为 9312 % ,而
mut22 突变株对糖的利用率为 9514 % ,略高于原始菌
株。说明发酵过程中 ,ADH 突变菌株的生长能力有一
定程度的提高 ,其对葡萄糖的转化能力也有加强。
图 7 　突变菌株和原始菌株发酵中还原糖变化
Fig. 7 　Reducing sugar concentration of mut22 and
parent strain during fermentation
3 　结论与讨论
通过代谢途径分析及产物检测 ,找出主要代谢副
产物途径并采取措施阻断或降低其流量可提高目标产
物的转化率。我们通过对米根霉 As313462 菌株碳代
谢产物分析发现 ,发酵液中除 L2乳酸外 ,还含有苹果
酸、富马酸、乙醇等碳代谢产物 ,其中乙醇含量很高 ,是
主要的代谢副产物。所以 ,定向抑制该途径的碳流 ,是
提高目标产物 L2乳酸转化率的有效措施。Skory 采用
NTG诱变米根霉 NRRL395 菌株 ,通过在 YPD 培养基中
添加丙烯醇 ,筛选获得 ADH活力不同程度降低的突变
株 ,研究了突变菌株在限氧条件下 L2乳酸与乙醇的代
谢迁移[10 ] ,但他没筛选出在通氧条件下 L2乳酸转化率
提高的突变菌株 ,采用该筛选方法获得的米根霉
As313462 mut22 突变菌株 ,其最大 ADH 比活力比原始
菌株降低了 6016 % ,对乙醇的转化比原始菌株降低了
3512 % ,而对乳酸的转化比原始菌株提高了 7916 % ,为
通过分析微生物代谢系统、定向选育目标产物的高产
菌株提供了较为成功的案例。
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2250kgΠhm2 左右 ,很难超过 3000kgΠhm2 ,制种农户不愿
意多制种 ,由此影响了应用推广速度。尽管如此 ,仍累
计推广约 5 万 hm2 ,新增社会经济效益 8000 多万元。
1999 年金优 225 定为全市推广的早稻优质米组合
之一。2004 年获郴州市科技进步一等奖。近年来 ,国
家进行粮食直补 ,提高了农户种粮的积极性 ,除了早稻
栽培 ,金优 225 在湘北湖区还作晚稻翻秋栽培 ,7 月 20
日前直播 , 成熟时机械收割 , 一般稻谷产量可达
6000kgΠhm2 以上。
2006 年 ,湖南省内还有 18 个单位在省种子站办理
了金优 225 和威优 225、中优 225 等的种子生产许可
证 ,说明郴 R922225 系列组合还有市场份额。因此 ,本
所申请了郴 R922225 的植物新育种保护 ,并已公告[9 ] 。
3 　结论和讨论
311 　　选择双亲都是强恢复系的亲本杂交 ,在低世代
分离重组中利用辐射提高诱变效率 ,低世代测恢、海南
加代 ,育成了恢复系郴 R922225 ,所配制的组合金优
225 在生产上大面积应用 ,经济、社会、生态效益明显。
312 　郴 R922225 主茎叶片数减少 ,熟期大幅度提前 ,
应是辐射诱变产生的效应[10～13 ] ;其稻米品质发生的变
异对育种也是有利的。由于其原始双亲都是强恢复
系 ,所以易于育成新的强恢复系。
313 　金优 225 组合制种产量水平低 ,一般不超过
3000kgΠhm2 。可能与亲本中的 26 窄早有关 ,因 26 窄早
作父本与 V20A 配制的 V 优 35 制种也难以高产。因
此选择亲本时应充分考虑制种产量的水平因素。
314 　金优 225 作双季早晚连作品种 ,两季合计可以达
到 13500kgΠhm2 的产量水平。该品种的连作是一种良
种加良法的途径。
315 　郴 R922225 已经用于配制新的杂交组合研究 ,可
望育成优于金优 225 的杂交稻新组合。
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