全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052785204
紫茎泽兰 cDNA 文库的构建及 RuBP 羧化酶基因的筛选
裴熙祥　郭惠明　程红梅
(中国农业科学院生物技术研究所 ,北京　100081)
摘 　要 :采用 SMART技术首次构建了高质量的紫茎泽兰 cDNA 文库。经过涂平板测定和酶切反应鉴定
表明 ,原始文库的滴度为 1123 ×107 cfuΠml ,重组率达 98 % ,插入片段平均大小在 900 bp 左右 ,采用涂平
板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了 1 ×1012 cfu ,覆盖率达 99 %以上。利用该文库筛选得到了紫茎
泽兰核酮糖二磷酸羧化酶 (RuBP 羧化酶) cDNA 片段。
关键词 :紫茎泽兰 ;cDNA 文库 ;菌落原位杂交
CONSTRUCTION OF cDNA LIBRARY AND RuBP CARBOXYLASE GENE SCREENING OF Eupatorium adenophorum
PEI Xi2xiang 　GUO Hui2ming 　CHENG Hong2mei
( Biotechnology Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081)
Abstract :cDNA library of Eupatorium adenophorum was constructed by using SMART system. According to the evaluation ,
the constructed library had a high titer of 1123 ×107 cfuΠml , an average insert fragments size was about 900bp and 98 %
recombinant percentage. The titer of amplified library was 1 ×1012 cfu by amplification of colonies , the coverage of the library
was more than 99 %. The cDNA fragment of ribulose diphosphatecarboxylase ( RuBP) was obtained by screening this cDNA
library.
Key words : Eupatorium adenophorum ; cDNA library ; colony in situ hybridization
收稿日期 :2009202223 　接受日期 :2009204227
基金项目 :国家自然科学基金 (30771422)国家重点基础研究发展计划 (973 计划) (2009CB119201)
作者简介 :裴熙祥 (19832) ,男 ,黑龙江省牡丹江人 ,硕士研究生 ,研究方向为植物分子生物学。Tel :13426361046 ; Email :peixixiang @163. com
通讯作者 :程红梅 (19672) ,女 ,河南信阳人 ,研究员 ,博士生导师。研究方向为植物分子生物学。Tel : 010282106125 ; Email :chenghm @caas. net . cn
　　紫茎泽兰 ( Eupatorium adenophorum) 是一种世界入
侵性恶性有毒杂草 ,为菊科多年丛生型半灌木草本植
物 ,原产墨西哥。自上世纪 50 年代从中缅、中越边境
传入云南后 ,快速蔓延至我国长江以南地区 ,形势极其
严峻[1 ] 。有研究证明 ,紫茎泽兰对农作物的危害主要
通过其代谢产物来实现[2～5 ] 。因此 ,对代谢相关基因
进行克隆和功能分析 ,以在分子生物学水平上加强对
代谢调控机理的研究 ,进而寻求入侵植物抑制本地植
物生长的机制 ,从而实现治理入侵杂草和保护本地物
种的双重目的。由于紫茎泽兰的遗传背景不清楚 ,基
因层面的研究比较困难 ,通过构建 cDNA 文库的方法
来开展其功能基因组学研究是比较有效的手段。紫茎
泽兰中含酚类、多糖及其他小分子物质较多 ,高质量的
总 RNA 难以提取 ,给 cDNA 文库的构建工作带来了一
定的困难。本试验采用苯酚法提取紫茎泽兰总 RNA ,
采用 SMART 技术构建了高质量的紫茎泽兰 cDNA 文
库 ,进行了 cDNA 文库的质量分析。cDNA 文库的筛选
则是目前最经典、应用最普遍的一种克隆基因的技
术[6 ] 。本试验以拟南芥的 RuBP 羧化酶基因核心序列
作为探针 ,对所构建的 cDNA 文库进行筛选 ,获得了紫
茎泽兰中 RuBP 羧化酶基因片段 ,从而验证了该文库
的有效性。
1 　材料与方法
111 　材料
紫茎泽兰新鲜茎及叶片为云南种群。Creator
SMART cDNA 文库构建试剂盒购自美国 Clontech 公司。
PolyATtract mRNA Isolation Systems 购自美国 Promega 公
司。ElectroMAXTM DH10BTM 感 受 态 细 胞 购 自 美 国
587　核 农 学 报　2009 ,23 (5) :785～788Journal of Nuclear Agricultural Sciences
Invitrongen 公司。DNA 地高辛标记杂交试剂盒购自
Roche 公司。DNA 序列测定由北京三博远志生物技术
有限公司完成。
112 　方法
11211 　总 RNA 提取和 mRNA 的纯化 　由于紫茎泽兰
中含酚类、多糖及其他小分子物质较多 ,而 cDNA 文库
的构建需要较大量的 RNA ,本试验对王关林和方宏
筠[7 ]提取 RNA 的苯酚法进行了改进。将 015 g 低温保
存的样品于液氮中研磨成冻粉 ,分 3 次加入 1 ml RNA
提取缓冲液[50 %Tris2饱和酚 (pH 810) ,50 %Tris2Cl (pH
810) ] 中 , 每次加入样品后迅速涡旋振荡 1 min ,
12000rpm 离心后所得上清经氯仿抽提 2 次 ,酒精沉淀 ,
DEPC H2O 重悬沉淀 ,DNA 酶消化基因组 DNA ,再经过
等体积酚 - 氯仿 (1∶1) 抽提 1 次 ,取上清 ,上清液再经
等体积氯仿抽提 1 次 ,以去除蛋白及小分子杂质 ,酒精
沉淀后 ,所得沉淀用 DEPC H2O 重悬 ,即得到紫茎泽兰
总 RNA。通过紫外分光光度计分别测定其 A260 、A280和
A230值以及经 111 %甲醛变性凝胶电泳后观测其条带
检测 RNA 质量。紫茎泽兰 mRNA 的纯化严格按照
mRNA 分离试剂盒 (Promega 公司)的说明进行。
11212 　双链 cDNA 的合成 　参照 SMARTTM cDNA
Library Construction Kit 的操作说明 ,在 DEPC 处理过的
离心管中依次加入 3μl polyA + RNA、1μl SMART IV
Oligonucleotide、1 μl CDS ⅢΠ3’PCR Primer , 72 ℃水浴
2 min后冰浴 2 min ,向反应液中加入 2μl 5 ×第 1 链缓
冲液、1μl DTT、1μl dNTP Mix、1μl PowerScript 反转录
酶于 42 ℃反应 60 min ,置于冰浴中终止反应 ,向反应液
中加入 1μl Sodium Hydroxide ,68 ℃孵育 30 min 后进行
PCR 扩增 ,反应体系为 11μl 第一链 cDNA、71μl 去离子
水、10μl 10 ×Advantage 2 PCR 缓冲液、2μl 50 ×dNTP、
2μl 5’PCR 引物、2 μl CDSIIIΠ3’PCR 引物、2 μl 50 ×
Advantage 2 聚合酶混合物 ,反应程序为 95 ℃预热 ,72 ℃
10 min ,95 ℃20 s ,95 ℃5 s ,68 ℃8 min ,10 个循环。合成
的双链 cDNA 经 111 %琼脂糖ΠEB 凝胶电泳检测。
11213 　cDNA 的分级分离纯化及文库构建 　合成的双
链 cDNA 经 sfi Ⅰ酶切及柱层析分级 ,共收集 16 管 ,每
管取 4μl 经琼脂糖电泳检测 ,合并能显示亮带的前 3
管 (片段 > 014kb)进行沉淀 ,重悬在去离子水中 ,在 T4
DNA 连接酶作用下与质粒载体 pDNR2LIB (经 sfi Ⅰ酶
处理过)于 16 ℃下连接 16 h。连接产物经电击转化感
受态细胞 (大肠杆菌 DH10 B ) 。
11214 　原始文库质量鉴定和扩增 　取适量原始文库
菌液 ,稀释不同的倍数 (1000、10000 和 20000 倍) 后取
1μl均匀地涂在含 30μgΠml 氯霉素的 LB 平板上 ,每个
倍数设 1 个重复。文库的滴度公式 :cfuΠml = 长出菌落
数 ×稀释倍数 ×103 / 稀释的菌液铺板μl 数 ;文库总库
容量 = 文库滴度 ×总体积数 (ml) 。随机挑取 16 个菌
落克隆 ,提取质粒经 sfi Ⅰ酶切后电泳检测 ,测定其重
组率及重组片段的大小。文库的扩增采用涂平板培养
扩增 ,这相对于在液体中培养繁殖扩增更均匀。取适
量原始文库 (6 ×106 重组子) 均匀地涂在 100 个含 30
μgΠml 氯霉素的直径 150 mm LB 平板上 ,37 ℃倒置培养
16～18 h ,用含有 25 %甘油 LB 培养基 (7mlΠ板) 洗脱所
有的菌落 ,将每板的洗液混合摇匀即得到了扩增文库 ,
检测其滴度 ,分装 ,放置 - 80 ℃保存。
11215 　探针的制备与菌落杂交 　利用网站 NCBI
(http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. gov) 提供的拟南芥中已经发
现的 RuBP 羧化酶基因序列 ,对拟南芥 RuBP 羧化酶氨
基酸保守区设计引物 ,获得了拟南芥 RuBP 羧化酶基
因的核心区片段。按照 DNA 地高辛标记杂交试剂盒
说明书对该核心区片段进行探针标记。杂交中所用滤
膜的制备依照菌落原位杂交中滤膜制备的操作步骤[8 ]
进行 ,杂交方法按照 DNA 地高辛标记杂交试剂盒说明
书进行。
11216 　cDNA 文库筛选所得到的 cDNA 片段的生物信息
学分析 　利用网站 NCBI(http :ΠΠwww1ncbi . nlm. nih. gov)
提供的BLASTn 程序搜索数据库 ,进行相似性比较。
2 　结果与分析
211 　紫茎泽兰总 RNA 的提取及 mRNA 的纯化
试验得到的紫茎泽兰总 RNA 的 111 %琼脂糖凝胶
电泳如图 1 所示 ,由图 1 可见清晰的 28S 和 18S 的条
带。经紫外分光光度计测定 ,OD260ΠOD280 值为 1197 ,
OD260ΠOD230值为 2139 ,表明所得总 RNA 纯度较高 ,完整
性较好 ,无蛋白质污染。取 1 mg 总 RNA 进行 mRNA
纯化 ,得到约 10μg mRNA ,OD260ΠOD280值为 2105 ,OD260Π
OD230值为 2141 ,经电泳检测 (图 2) ,mRNA 质量较高。
可以用于 cDNA 文库的构建。
212 　双链 cDNA 的合成及分级
合成的双链 cDNA 产物经 111 %琼脂糖凝胶电泳 ,
结果显示成一弥散带 ,最大片段超过 10 kb ,主要集中
在 015～215kb (图 3) ,表明合成的 cDNA 比较完整。合
成产物经 sfi Ⅰ完全酶切后过柱分级 ,根据 111 %琼脂
糖凝胶电泳检测结果 ,合并合适大小片段的收集管样
品 ,乙醇沉淀后重悬于去离子水中。
213 　cDNA 连接质粒载体 pDNR2LIB 及转化感受态细胞
687 核　农　学　报 23 卷
图 1 　紫茎泽兰总 RNA 1. 1 %琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 1 　Total RNA of Eupatorium adenophorum appeared
from 1. 1 % agarose gel
1 : MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(上样量 5μl) ;
2 :紫茎泽兰总 RNA(上样量 1μl)
1 :MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(5μl) ;
2 :Total RNA of Eupatorium adenophorum (1μl)
图 2 　紫茎泽兰 mRNA 1. 1 %琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 2 　mRNA of Eupatorium adenophorum appeared
from 1. 1 % agarose gel .
1 : MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(上样量 5μl) ;
2 : MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(上样量 2μl) 。
3 :紫茎泽兰 mRNA(上样量 1μl)
1 :MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(5μl) ;
2 :MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(2μl) ;
3 :mRNA of Eupatorium adenophorum (1μl)
文库构建过程中 cDNA 和载体的连接比例非常重
图 3 　由 mRNA 反转录、扩增得到的双链 cDNA 1. 1 %
琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 3 　ds cDNA appeared from 1. 1 % agarose gel after
reverse transcription and amplification
1 : MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(上样量 5μl) ;
2 :紫茎泽兰双链 DNA(上样量 1μl)
1 :MarkerλDNAΠEcoRI + Hind Ⅲ(5μl) ; 2 :ds cDNA(1μl)
要 ,决定了连接效率 ,为此试验中设计了 3 种比例 , 最
后结果表明比例为 115∶1 时连接效率最高。把所有
cDNA 按最适比例连接 pDNR2LIB 质粒载体后进行电
击转化。在 2000V 下 ,电击转化感受态细胞 ,完成原始
文库的构建。
214 　文库质量的检测及扩增
经过涂平板检测方法得到的结果 ,文库滴度为
1123 ×107 cfuΠml。随机挑取 7 个克隆 ,提取质粒酶切电
泳 ,结果表明重组率为 98 % ,插入片段大小平均为 900
bp (图 4) 。所构建的文库覆盖率达 99 %以上 ,适合以
后的测序及基因功能的研究。扩增文库的总容量达到
1 ×1012 cfu ,适合长期保存。
215 　cDNA 文库的筛选及阳性克隆测序
以标记的拟南芥 RuBP 羧化酶基因的核心区片段
为探针进行菌落原位杂交 (图 5) ,挑取杂交平板上阳
性信号所对应的单克隆菌落进行 sfi Ⅰ酶切鉴定 ,确定
该克隆带有约 800 bp 的插入片段 ,将其进行测序 ,获
得 cDNA 文库筛选所得到的阳性克隆中的 cDNA 序列。
216 　cDNA 片段的生物信息学初步分析
将测序所得到的 cDNA 序列与 NCBI 网站上的
GenBank数据库资料进行核酸序列比对 (BLASTn) 分
析 ,并与已知序列进行同源性比对 ,结果表明 ,该 cDNA
序列与黄顶菊 ( Flaveria pringlei) RuBP 羧化酶基因同源
787　5 期 紫茎泽兰 cDNA 文库的构建及 RuBP 羧化酶基因的筛选
图 4 　随机挑取 7 个克隆扩增插入的片段琼脂糖
凝胶电泳结果
Fig. 4 　Seven clones picked out randomly to amplify the
insert fragments and appeared from 111 % agarose gel
泳道 1 :DNA Ladder Mix ; 泳道 2～8 :cDNA 插入片段。
Line1 : DNA Ladder Mix ;Line2～8 :cDNA insert fragment .
图 5 　利用菌落原位杂交进行 cDNA 文库的筛选
Fig. 5 　Screening of cDNA library by colony
in situ hybridization
性达到 87 % ,从而获得了紫茎泽兰中的 RuBP 羧化酶
cDNA 片段。
3 　讨论
紫茎泽兰细胞具有坚硬的细胞壁 ,含较多的多糖、
脂质、多酚等次生代谢物 ,细胞破碎后 ,这些物质以不
同方式干扰 RNA 的提取 ,严重影响所提取 RNA 的质
量和产量 ,如酚类物质氧化后产生褐变 ,可使 RNA 活
性丧失[10 ] ,多糖可形成难溶胶状物与 RNA 一起沉淀
等[11 ] 。因此 ,本试验采用改进的苯酚法提取 RNA ,并
增加几次抽提纯化步骤 ,使 RNA 的纯度显著提高。
cDNA 文库的质量主要反映在高度代表性方面。
根据 Clarke&Carbon[12 ] 公式 , 为满足筛选到低丰度
mRNA 获取所需克隆的概率为 99 %的要求 ,一般 cDNA
文库的构建要求其总克隆数不少于 1 ×106[6 ] ,本研究
构建的文库滴度为 107 cfuΠml ,重组率达到 98 %以上 ,
插入片段大小平均为 900bp 以上 ,满足了库容要求 ,适
合以后的测序及基因功能研究。
文库的筛选方法主要有菌落杂交和 PCR 快速筛
选法等 ,PCR 快速筛选流程建立较容易 ,但假阳性比率
高 ,且由于所筛选的基因序列未知 ,应用已知的同源基
因设计简并引物存在一定困难。而经典的菌落杂交法
则假阳性比率低 ,与标记的探针具有同源性的基因均
可得到 ,是更加有效的文库筛选手段。本试验应用拟
南芥 RuBP 羧化酶 cDNA 保守区作为探针 ,通过菌落杂
交法筛选得到了紫茎泽兰中的 RuBP 羧化酶基因 ,证
明该方法是从 cDNA 文库中筛选目标基因的有效手
段 ,同时也验证了该文库的有效性。
紫茎泽兰 cDNA 文库的成功构建及基因筛选流程
的建立 ,为紫茎泽兰代谢过程中相关基因功能的研究
提供了较好的技术平台 ,为代谢途径的深入研究奠定
了良好的基础。以期在代谢途径中利用关键酶的正馈
或反馈等调节 ,减少有害代谢产物的产量 ,为控制这种
恶性杂草提供理论基础。
参考文献 :
[ 1 ] 　向业勋. 紫茎泽兰的分布、危害及防除意见[J ] . 杂草科学 , 1991 ,
(4) : 10 - 11
[ 2 ] 　冷欣夫 ,邱星辉. 细胞色素 P450 酶系的结构、功能与应用前景
[M] . 北京 : 中国科学出版社 , 2001 : 3 - 5
[ 3 ] 　强　胜. 世界性恶性杂草 ──紫茎泽兰研究的历史及现状 [J ] .
武汉植物学研究 ,1998 ,16 (4) : 354 - 365
[ 4 ] 　万方浩 ,郑小波 ,郭建英. 重要农林外来入侵物种的生物学与控
制[M] . 北京 : 科学出版社 , 2005 : 650 - 661
[ 5 ] 　Dey S , Sinha B , Kalita J . Effect of Eupatorium adenophorum Spreng ,
leaf extracts on the mustard aphid , Lipaphis erysimi Kalt : a scanning
electron microscope study[J ] . Microsc Res Techniq , 2005 , 66 (1) :31
- 36
[ 6 ] 　毛新国 ,景蕊莲 ,孔秀英 ,赵光耀 ,贾继增. 几种全长 cDNA 文库构
建方法比较[J ] . 遗传 ,2006 , 28 (7) : 865 - 873
[ 7 ] 　王关林 ,方宏筠. 植物基因工程 [ M] . 北京 : 科学出版社 , 2002 :
750 - 751
[ 8 ] 　萨姆布鲁克 , dw 拉塞尔. 分子克隆实验指南 (第三版) [M] . 北京 :
科学出版社 ,2002 : 110 - 114
[ 9 ] 　龙松华 ,陈信波 ,邓　欣 ,高　原. SMART技术构建亚麻韧皮部全
长 cDNA 文库[J ] . 中国麻类科学 ,2008 ,30 (3) : 128 - 130
[10 ] 　王东兰 ,郭建英 ,谢丙炎 ,万方浩 ,何龙飞. 紫茎泽兰 CYP75 基因
cDNA 片段的克隆与鉴定[J ] . 植物保护 ,2005 , 21 (4) :65 - 69
[11 ] 　Sambrook , David W , Russel L. Molecular Cloning : A Laboratory
Mannual ,3rd ed[M] . New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press ,
2002 :549 - 552
[12 ] 　Clarke L , Carbon J . A colony bank containing synthetic Col El hybrid
plasmids representative of the entire E. coli genome [J ] . Cell , 1976 :9
(1) : 91 - 99
887 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (5) :785～788