全 文 ：热带亚热带植物学报 2002，】0(】)：46—50
Jo Tropical and s曲 叩 t嘶
菌根真菌感染墨兰与建兰根状茎对呼吸速率和
几种氧化酶活性的影响
潘超美 陈汝民 李 玲
广州中医药大学 中药学院，广东 广州 510407；2华南师范大学生物系，广东 广州 510631)
摘要： 用从野生建兰根部分离的菌根真菌 P】5菌株感染墨兰 rubidium xiaenxe和建兰 mbidlum
n t的根状茎后，使寄主的呼吸速率 ．细胞色素 C氧化酶 、过氧化物酶活性明显增高，而感染前后
1AA氧化酶活性变化不明显。两个品种相比较，建兰根状茎的呼吸速率、细胞色素 C氧化酶和过氧化物酶
活性均 比墨兰的高 但墨兰的根状茎 IAA氧化酶活性则高于建兰 。
关键词：菌根真菌；墨兰 ；建兰；根状茎 ；氧化酶类 ；呼吸速率
中图分 类号 ：Q945．】9 文献标识码：A 文章编号 ：1005—3395(2002)01—0046-05
Efect of M ycorrhizal Infection on Respiration and Activities of
Some Oxidase in Rhizome of Cymbidium sinense and cI ensifolium
PAN Chao．mei CHEN Ru min LI Ling
(I ’如 ofPharm~u％ Guw~zh {]tdz,e~ity TradztJ~mal Chi~se Medi~ine．Ouangzhou 510407 China；
2．Deptu~ nt 《Bifl【’ ．South China Nounal n叭m Gu~ngzhou 510630．China)
Abstract： Endophytic mycorrhizaI fimgus P15 isolated from the lootS ofwild Cymbidium e ifolium
was used to infect the noa—mycorrhizal rhizomes ofC．sinen．~e and c Ⅲifolium A marked increase in
respiratory,rate，cytochrome C oxidase activity，and peroxidase activi was shown in the~flizomes of
two infected species，while the change in IAA oxidase activity was sIight．The levels ofrespiratory rate，
activities ofcytochrome C oxidase and peroxidase in the rhizomes of c ensifolium~,vare al higher than
those ofC nPr e before or alter infection．but the IAA oxidase activity showed the contraw．
Key words： Mycorrhizal fungi； cy 啪 sinerc~e； Cymbidium PⅢ lium ； Rhizome； Oxidases；
Respirator),rate
兰科植物是菌根植物 ，在 自然条件下其胚细胞不能形成酶系统来满足萌发过程 的营养所需 l。
近年来 的一些研究结果表明，菌根真菌能够吸收多种无机和有机化合物满足兰科植物体生长的需
要；菌丝入侵到植物细胞内被同化，同时真菌菌丝也能激发寄主植物体内的一系列生理变化，从而
促进了寄主植物体内的生理代谢活动 。细胞色素氧化酶是植物体呼吸链中的末端氧化酶，它调控
着植物细胞的呼吸速率 ，并直接关系到 ATP的生成；而 IAb．氧化酶和过氧化物酶与植物细胞的生
长和抗逆性有密切的联系．一直为研究者所关注 。目前有关菌根真菌与兰科植物共生感染后的
生理研究报道不多见。本试验以墨兰(Cymbidium s n e)和建兰(c．ens蜘f um)的根状茎为材料 ，
探讨菌根真菌感染对兰科植物根状茎的呼吸速率和对细胞色素 C氧化酶 、IAA氧化酶和过氧化物
收稿 日期：200l一03—23 接受 日期：2001—08—20
基金项目：广东省“九五 重点科投攻关项 日(049711961101
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 潘超美等：菌根真菌感染墨兰与建兰根状茎对 呼吸速率和几种氧化酶活性的影响 47
酶活性的影响 ．为围兰的快速繁殖生产提供部分科学依据
1 材料和方法
实验材料 由华南师范大学国兰研究中心提供墨兰(Cymb~ium sinense)无菌根状茎。建
兰根状茎从广东新丰县采集野生建兰(c eFt．~ifollum)的种子 ，经无菌培养后获得。根状茎在 1／2MS+
2mgL。NAA+2mgL 6-BA+IO％CM(椰乳 )+1％蔗糖的生长培养基中继代培养保存。
菌丝滤液的制备 菌根真菌 P1 5号菌株从野生建兰根段上分离、纯化后获得 。把 P15号菌
株接种到含有麦麸 50 gL～、葡萄糖 20 gL-。、KH：PO 1．5 gL～、维生素 B 10mgL-。的液体培养基 中．
28 c下．摇床 100—120 rmin 振荡培养两周，待菌丝体充分生长后 ，将菌丝体取出、捣碎、过滤，滤液
备用。
根状茎感染真菌的培养 选取继代培养 30 d、生长旺盛 、体积大小较一致的根状茎 2 g．转
到含有 3mI菌丝滤液和 100ml感染培养基 (I~MS+2mgL。NAA+2mgL 6-BA+1O％CM +1％
羧甲基纤维素+0．1％葡萄糖)中．28℃自然光照下，摇床 100 rmin 振荡培养 35 d。每周一次将根状
茎转移到不含菌丝滤液的感染培养基 ，以防止菌丝生长过盛。以未感染 的根状茎作为对照。在感染
培养开始后 ．每隔 3 d(后期隔 5 d)取样一次作相关的生理指标分析。
呼吸速率的检测 呼吸速率用 warburg微量呼吸测压仪测定 。每个 Warburg小瓶内放人
1．0 g鲜重的根状茎，加入 2m1 0 2mol／L磷酸盐缓冲液(pH7．0)，小烧瓶内室放置一张吸附了 0．2
ml 20％KOH的小滤纸．2 h内每隔20 min记录一次读数。测定温度为 25℃。呼吸速率以每克鲜重
的根状茎每小时吸氧的微升数表示。五个重复测定 ，取平均值 。
酶液的提取 准确称取 2．0 g根状茎置于玻璃研钵上 ，迅速冷冻 (I~C一 10％)10 min。加入
10ml 0，1 molFL．pH7．0磷酸盐缓冲液 ，置冰浴中研磨成匀浆 ，于 4℃下 7 162xg离心 20min，上清液
为粗酶液。
细胞色素 c氧化酶活性测定 参照陈 良碧 的方法 ．取 10 l粗酶液置于 1 12m的比色杯
中，加入 0．2mol／L，pH7．0的磷酸缓冲液 2．6ml，0．04％细胞色素 c 0．2ml，0．4％二甲基对 ．苯二胺
盐酸溶液 0．1 ml，置 37％水浴保温 30 min．立即冰浴冷却 迅速在 510 rim波长下测定 OD值的变
化。酶活性 OD mg FW min 表示。每样三个重复，取平均值 。
过氧化物酶活性测定 参照张志 良[71的方法。取粗酶液 10 1．置 于 1m 比色杯 中，加人反
应混合液(0．2moFL磷酸缓冲液 pH6．0 50ml，30％H O 0 028ml，愈创木酚 0 019m1)3ml，立 即开
启秒表记录时间，于470 nm波长下．读取 1min时的OD值。以煮沸 5min的酶液作对照。每样三
个重复。酶活性以 OD mg。FW min。表示
IAA氧化酶活性的测定 参照张志良l 和徐如捐等 的方法 。取粗酶液 2 ml，加入 4 ml冷
丙酮 ，置冰箱中．沉淀过夜后去掉丙酮 ．用 4ml 0．02mol／L的磷酸缓冲液溶解沉淀。再经 16 114xg
离心 15min后加 3ml反应试剂(198 gMnCI]，163 g 2,4．dichlorophenol，200 gIAA，用磷酸缓冲
液配制)．25％下黑暗保温 1．5 h后．取保温液 0．5m1．加 2ml Salkowski试剂(将 0．135 gFeCI~溶解
于 50 ml 35％的 HCIO 中)，同样条件下再放置 30 min．530 rim 比色测定溶液中 IAA的含量 ，以煮
沸5 min晌酶液作对照 用每克鲜重材料每小时内分解破坏 1AA的微克数表示酶活力大小。每样
三个重复，取平均值
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 10卷
2 结果和分析
2．1 菌根真菌对墨兰和建兰根状茎呼吸速率和细胞色素氧化酶活力的影响
无 论是否被菌根真菌感染，建兰的呼吸速率要 比墨兰高得多(图 1)。与菌根真菌感染的墨兰和
建兰根状茎相 比(图 1)，在感染 30 d的过程 中，对照根状茎呼吸速率变化不大 ，只在开始缓慢地持
续上升，到 了第 1 0天后趋于较平稳状态。被菌根真菌感染后 的根状茎呼吸速率始终高于未感染的
对照 ．分别在第 9天和第 20天出现了两个氧吸收的高峰。一般来说 ，真菌侵染寄主后 10 d左右 ．细
胞内的菌丝团就开始消解 】。在前一实验中，我们观察到 Pl 5号菌株的菌丝团的初次解体发生在侵
染寄主的第 9—1 1天之间 。所以，推测第一个高峰出现可能是寄主细胞内菌丝团开始消解的时候，
由于菌丝团在寄主细胞内解体 ，释放出能被寄主细胞利用的营养物质，从而刺激了寄主细胞的物
质代谢，使呼吸速率产生跃升。菌丝团消解后的细胞可以再次被相邻的菌丝重新感染，在细胞内又
形成新的菌丝团，一段时间后菌丝团再次解体：或者也可能是其它感染区域的细胞群的菌丝团解
体使呼吸速率再次跃升 ，即出现在 20 d时的高峰 。
细胞色素 C氧化酶是植物呼吸链中的末端氧化酶，位于线粒体膜中，催化将电子从细胞色素
c(cyt c)传到 o 的反应 ．在控制电子传递 中起着很重要 的作用。从图 2看出．真菌感染过程中 ，墨兰
和建兰根状茎 的细胞色素 C氧化酶活性 皆提高 ，表明感染后的共生体系 比未感染前的根状茎本身
具有更强的代谢能力。两个品种比较．未感染建兰的细胞色素 C氧化酶活性高于墨兰的活性．但从
感染后 的变化幅度看 ，墨兰酶活性的增值幅度为 33％一1 50％，平均增加 比率为 91％；而建兰的增值
幅度为 26．8％一82％，平均增加比率为39．6％。从整个培养过程来看，酶活性呈持续升高趋势．在第 9
天出现高蜂，以后缓慢下降，到 20 d时再次出现高峰．这与呼吸速率的变化基本一致。
3 ● ● I2 lI ll 灯 蔓
瞄染后 王散 Days afte r infectjon
图 l茁根真苗感染后两种兰花根状茎 图 2 苗根真菌感染扁l两种 兰花根状茎
呼吸速率的变化 细胞色隶 C氧化酶活性 的变化
Fig l Changes in n~spirator~rate of ⋯ and Fig 2 Changes in cytoehrome C oxidase activity ofC ⋯
c．⋯ if,1Ium rhizomes after mycorrhizai infeetion and c ,／urn rhizomes aier mycorrhizal infection
■未感染建兰 Unln ckd￡ 肺扣n¨ ：口感染后建兰 Infected c lium；
●未感染墨 兰 Uninfected￡ ~iuens e；0感染后墨兰 fected c ~iae．．qe
cl-ulE芒 一．} e。_ 】÷
一，一 ! ∞日 一 0 0 _g LIuD 0
掣烬蕾 慵 0*脚普 再
m 啪 - 秘 柚
一l-I芒 l- 口{苫3 o 一 芒o= Jl嚣 童}昏瞥
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 潘超美等 ：菌根真菌感染墨兰与建兰根状 茎对呼吸速率和几种氧化酶活 陛的影响 49
2．2 菌根真菌感染过程中．IAA氧化酶和过氧化物酶活性的变化
在菌根真菌感染过程中，IAA氧化酶活性变化幅度不大(图 3)，基本维持在相对稳定的水平
墨兰的 IAA氧化酶活性比建 兰高 一般认为．IAA含量与其酶活性之间存在着反比关系 ，IAA氧
化酶活性高，使 IAA含量减少，生长速度慢。在本实验条件下，墨兰根状茎的生长也稍比建兰慢些
但 IAA氧化酶活性容易受环境因子的影响，如低温和水分胁迫都会增加 IAA氧化酶的活性，IAA
含量随之降低 从本实验结果来看．真菌的介人，对 IAA氧化酶活性的影响不大，同一品种感染前
后 的酶活-眭水平差异不大，感染后 IAA酶活性在第 10天和第 25天时稍有波动，这可能是 由于胞
内菌丝体解体导致其它代谢活动加强 ，相互影响所致
而过氧化物酶活性的变化(图 4)则有所不同。在感染后 的第一天 ，被菌根真菌感染后的两种根
状茎的过氧化物酶活性高于对照 感染的初期 ，酶活性不断上升 ，第 7天达到了高峰 ，随后逐渐下
降 ，到培养后期(30 d)，酶活性水平已接近来感染根状茎的水平。兰科菌根真菌是能与兰科植物形
成共生关系的内寄生菌 ．但对于非兰科植物却是致病性很强的腐生菌 ，尤其是 Rhizoctonia solani，
能引起许多植物根腐病 。有关学者认为，致病性感染对寄主呼吸和各种氧化酶活性增高的影响可
能与毒素的释放有关H】。Maxwell和Bateman在用R．sotani感染莱豆幼苗时，发现植株在生长中期
和结实的成熟阶段，组织中的多酚氧化酶 、过氧化物酶、过氧化氢酶和细胞色素 C氧化酶才显著升
高 ，而不是发生在感染初期的幼苗阶段 在这些氧化酶升高的同时，寄主组织细胞会 出现严重损伤
或坏多E；而用菌根真菌感染兰科植物的过程却是一个形成共生联合体的过程 ，在这个过程中酶活
性的增加 ，尤其是过氧化物酶 ，在感染的初期就可检测 出来“】。本实验 中观察到被感染后的根状茎
的寄主组织细胞生长正常 ，没有发生褐变和坏死 ，可 以证实是共生感染 ，区别于致病感染 。
童
至 兰
3 6 9 12 1S 1日 2l 24 27 3O 33
瞎 染 后 天 数 0ays aftar I nfoetion
图 3苗根真曲感垫后l曲种兰花根状茎 IAA氧化酶活性变化 圉 4曲根真菌感垫后_嗍种 兰花根状茎过氧化物酶活性的变化
Fig 3 Changes in TAA oxidase activity ofC．⋯ ， and Fig 4 Chan ges in peroxldase activity ofC．xinen．~e and
c f⋯ rhizomes after m rrhizal infection e lium rhizomes after mycorrhi~l infection
一束感染建兰 Uninfected c ~r,．,ifohum；口感染后建兰 ]nfec~d C P 扣linm；
●束感染墨兰 unin cted c ⋯ r：0感染后墨兰 Infected c ⋯
3讨论
本实验中，两个兰花品种的根状茎被菌根真菌感染后，细胞色素 C氧化酶、过氧化物酶活性显
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 1O卷
著增加 (图 2，4)。过氧化物酶的第一次活性高峰发生在第 7天 ，比呼吸速率 、细胞色素 c氧化酶、
LAA氧化酶活性 的高峰出现时间(第 9天 )要早些 ，这与 B1akeman等的结果基本一致 ，他认为在
兰科植物与真菌的共生体 系中，过氧化物酶(POD)活性增加是生长发育的特征。植物体内 POD的
作用底物很多 ，如 H O 以及酚酸化合物等一系列其他物质 ，因此 ．POD是一种多功能的酶，它不仅
可以将体内某些有害的代谢副产物转变为无害物质 ，而且可以促进体 内某些 中间物质的转化 ，从
而对植物生长、发育和提高抗性起积极作用 有学者认为 ，POD活性的提高可能是植物对逆境反
应的自我 节 ．有助于植物的生长 。
菌根真菌与墨兰和建兰根状茎形成共生体系后 ，刺激了植物体内一系列的生物代谢活动 ，其
结果是呼吸速率、细胞色素 c氧化酶和过氧化物酶活性都显著提高，这些指标说明了真菌与其兰
科寄主的共生发育过程是互为有利的，兰花与真菌的共生联合体 比未感染的植株具有更强的代谢
能力。但接种与否则对 IAA氧化酶影响不大(图 3)，其原因不明 ，还有待进一步了解 。
参考文献：
Il J Harley J L Smith S E Mycorhizal Symbiosis(M_London：Academic F~ress，I983，268 295
[2_HadleyG+Orchidmyco~hiza(A]In：Arditi J Orchid Bio[og3~[MJ Ithaca NewYork：Co,nellUniversity Press,1982 86-l1 8
叫3 Boldue R，Cherry J BLair B increase in IAA ox[das~activity ofwimer wheat by cold trea~nent and gibberelic acid(J1 Plant Pbysio]，
1970 45：461_464
f4]Blakcman J P，Mokahel M A，Hadley G Efect ofm2c~corhiza[infection Otl respiration and activity ofsome oxidase enzymes oforchid
protoeorns_J1．New Phytol 1 976，77：697—704．
f5]AI Barazi Z，Schwabe W W The possible involvement ofpolypheno[oxidase and the auxinox[dase system in root formation and
development in cuttings ofm l⋯ M lJJ_J Hon Sci，1 984，59(3)：453-461
_6J徭趟美 陈汝民，Il庆生 苗根真菌在兰属{ rubidium)墨兰和建兰根部中的感染持扯及其生删特扯 f J_土壤与环境 ，1 999，8f4)：
287—289
【7]张志 良+植物生理学实验指导 【MJ北京 高等教育出版杜，1990，I31
【8】陈良碧 杂交水稻种子生 特点与耐储藏性研究 l J1_补子 1 994，(4)：1 9-21，24
【9】棣如涓，赵毓橘 表油 菜隶内酯刘黄瓜幼苗下胚轴过氧 化物酶 和 IAA氧化酶 活性的影响 fJl植物生理学报 ，1989，15(3)：
263—267
【l0l郭 秀珍．毕国昌 林木菌根及臆用技术 【M】北京 中国林业出版社 ，1989，131一I40
维普资讯 http://www.cqvip.com