全 文 ：收稿日期： 2012–02–27　　　　接受日期： 2012–04–27
基金项目： 广西直属公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(桂热研 201102)资助
作者简介： 蔡元保，男，硕士，助理研究员，从事植物生理与分子生物学研究。E-mail: caiyuanbao205@163.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: yangxiangyan84412@126.com
热带亚热带植物学报　2013， 21(3)： 253~258
Journal of Tropical and Subtropical Botany
澳洲坚果又称夏威夷果，原产于亚热带雨林，
是 山 龙 眼 科(Proteaceae)澳 洲 坚 果 属(Macadamia
F. Muell.)常绿乔木果树。澳洲坚果种仁营养价值
高，风味独特，享有“干果皇后”的美誉，深受广大
消费者的喜爱。目前，国外在分子水平上已成功
应 用 同 工 酶 技 术 [1–2]、RAPD[3]、SSR[3]、AFLP[4]、
澳洲坚果SCoT反应体系的建立及应用
蔡元保1, 杨祥燕1*, 陈显国1, 曾黎明1, 郭凌飞2, 林玉虹1, 崔明勇1
(1. 广西亚热带作物研究所， 南宁 530001； 2. 厦门市农业机械监理所，福建 厦门 361009)
摘要： 为建立澳洲坚果(Macadamia spp.)的 SCoT 最适反应体系，用单因素设计方法对影响 SCoT-PCR 反应体系的主要影响
因素进行了优化筛选，并构建了澳洲坚果种质的指纹图谱。结果表明，澳洲坚果的 SCoT 最适反应体系为：反应体系总体积为
20 μL，包含 2.5 mmol L–1 Mg2+， 0.3 mmol L–1 dNTPs， 0.8 μmol L–1 引物， 40 mg L–1 模板 DNA 和 1.0 U Taq DNA 聚合酶。最适
退火温度为 50℃。该反应体系对澳洲坚果种质具有良好的稳定性、可靠性和较高的分辨率。选用多态性良好的单引物 SC5 和
引物组合 SC34 + SC39，可以将 12 份澳洲坚果种质完全区分开，每份种质都各有独特的指纹图谱，置信概率达到 99.988%。构
建的 SCoT 反应体系可为澳洲坚果种质鉴定和遗传多样性分析等提供技术支持。
关键词： 澳洲坚果； SCoT； 单因素试验； 体系优化； DNA 指纹图谱
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.03.011
Establishment and Application of SCoT Amplification System for
Macadamia
CAI Yuan-bao1, YANG Xiang-yan1*, CHEN Xian-guo1, ZENG Li-ming1, GUO Ling-fei2, LIN Yu-hong1,
CUI Ming-yong1
(1. Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning 530001, China; 2. Xiamen Supervision Department of Agricultural Machinery, Xiamen
361009, China)
Abstract: SCoT-PCR amplification system of macadamia (Macadamia spp.) was optimized and established by
using single factor design, such as Mg2+, dNTPs, primer, Taq DNA polymerase and DNA template, and DNA
fingerprint maps of macadamia germplasms were constructed. The results showed that final volume of optimum
reaction system was 20 μL, including 2.5 mmol L–1 Mg2+, 0.3 mmol L–1 dNTPs, 0.8 μmol L–1 primer, 1.0 U Taq
DNA polymerase, 40 mg L–1 template DNA, and 2 μL 10 × buffer with ddH2O water. The suitable annealing
temperature of primers was 50℃. The optimum SCoT-PCR system was shown to be steady and reliable. The
12 germplasms of macadamia could be absolutely identified by primer SC5 and SC34 + SC39 with 99.988%
probability of confidence, every germplasm of macadamia had a unique fingerprint map. It showed that the
optimum SCoT-PCR system could be applied effectively in germplasm identification and genetic diversity analysis
of macadamia.
Key words: Macadamia; SCoT; Single factor experiment; System optimization; DNA fingerprint map
254 第21卷热带亚热带植物学报
RAMiFi[5]和 RAF[6]等分子标记对澳洲坚果种质资
源进行种质鉴定、遗传多样性分析和遗传图谱构
建；而我国对澳洲坚果的研究大多局限于栽培生
理 [7-9] 和遗传多样性的分析 [10–11]，对种质资源的遗
传背景缺乏深入研究。
目标起始密码子多态性分子标记(Start condon
targeted polymorphism, SCoT)是 Collard 和 Mackill[12]
于 2009 年在水稻(Oryza sativa)上提出的一种基于
单引物扩增反应的新型分子标记。该标记具有操
作简单、成本低廉、多态性高、引物通用、可获得丰
富的遗传信息等优点，已成功应用于园艺植物遗传
多样性研究中，如芒果(Mangifera indica)[13]、龙眼
(Dimocarpus longgana)[14]、柑橘(Citrus reticulata)[15]
等。与传统的分子标记相比，SCoT 标记具有物
种间引物通用，能有效产生与性状连锁的标记，方
便分子标记辅助育种等独特优点，是一种能跟踪性
状的新型分子标记。由于澳洲坚果多数品种存在
部分或完全的自交不亲和现象[16–17]，品种随意搭配
种植和杂交亲本选择不合理会影响到澳洲坚果产
量和育种进程。因此，深入研究澳洲坚果种质资源
的遗传背景对其产业的可持续发展具有重要意义。
采用 SCoT 标记将有利于澳洲坚果的分子辅助育
种和种质鉴定，但目前还未见该标记应用于澳洲坚
果的报道。本研究采用单因素试验方法优化和构
建了澳洲坚果的最适 SCoT-PCR 反应体系，并首次
构建了 12 份澳洲坚果种质的指纹图谱，为澳洲坚
果种质资源的遗传多样性评价、种质鉴定以及分子
标记辅助选择育种等研究提供有益的科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
12 份原产于澳大利亚的澳洲坚果(Macadamia
spp.)种质均取自广西亚热带作物研究所澳洲坚
果种质资源圃，除了 T2 种质属于澳洲坚果粗壳种
(Macadamia tetraphylla)外，其余 11 份种质都属于
澳洲坚果光壳种(Macadamia integrifolia)，分别是
Reown (D4)、HY、Hinde (H2)、Own Choice (O.C.)、
DND、D. Bown、NG-18、Ronik、Own-rentun、
HAES114 和 HAES842。其中 HAES842 种质用于
SCoT-PCR 反应体系的优化。供试材料均选取健康
植株上的无病虫害幼嫩叶片，液氮速冻后于 –70℃
保存。
1.2 总DNA的提取
采用 CTAB 法提取澳洲坚果基因组 DNA，用
1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量；用 Biophotometre
型核酸蛋白仪检测其浓度，稀释至 20 mg L–1，置
于 –20℃保存备用。
1.3 SCoT-PCR扩增
SCoT 引物 SC1 ~ SC60 参考 Collard 和 Mackill[12]
的方法，由上海生工合成。PCR 扩增程序为：94℃
预 变 性 5 min；94 ℃ 变 性 1 min， 50 ℃ 复 性 1 min，
72℃延伸 90 s，共 35 个循环；最后 72℃延伸 10 min。
扩增反应结束后，加入 3 μL 6 × Loading buffer，取 8 ~
10 μL 扩增产物在 1.8% 琼脂糖凝胶中电泳，于凝胶
成像系统上检测并拍照。
1.4 单因素优化设计和退火温度筛选
以澳洲坚果 HAES842 种质 DNA 为模板，以
SC3为扩增引物，将Mg2+、 dNTPs、引物、DNA模板、
Taq DNA 聚合酶等 5 种影响因素各设置 5 个水平(表
1)，采用单因素试验对澳洲坚果 SCoT-PCR 反应体
系进行优化，当进行某一因素水平试验时，其它因
素固定在第 3 个水平，从而筛选出每一因素的最佳
浓度，最后组合成为最佳反应体系。dNTPs 和 Taq
聚合酶均购自天根生化科技(北京)有限公司。每个
处理重复 2 次，反应体系总体积为 20 μL，每个处理
的 10 × buffer 用量均为 2 μL，用 ddH2O 补足到终
体积为 20 μL。
以 SC3 为扩增引物，根据单因素试验结果筛
选的最佳反应体系对退火温度进行梯度试验，设定
6 个温度梯度：40℃、 43.8℃、 50℃、 53.9℃、 60.1℃
和 64℃。除退火温度不同外，反应程序与单因素试
验相同。
1.5 SCoT-PCR优化体系的验证
根据确定的 SCoT-PCR 最适反应体系和退火
温度，选用引物 SC5 和引物组合 SC34 + SC39 分别
对 12 份澳洲坚果种质进行 PCR 扩增，以验证该反
应体系的稳定性和可靠性。
1.6 指纹图谱构建
通过对 60 条 SCoT 引物和 40 个随机引物组
合进行筛选，选用其中多态性良好的引物 SC5 和
引物组合 SC34 + SC39 构建 12 份澳洲坚果种质的
第3期 255
指纹图谱。对于 12 份澳洲坚果种质的 SCoT 扩增
谱带，只分析清晰可辨的电泳条带。根据 SCoT 图
谱中条带的有无，图谱中的每 1 条带均作为 1 个标
记。每条引物所有扩增片段按分子量从大到小的
顺序排列。全部材料在重复扩增中稳定出现的条
带无论强弱均赋值 1，不存在时赋值 0。以不同谱
带的组合构建指纹图谱。根据指纹图谱出现的概
率公式 P = 1/2n (2 为等位基因的数目，n 为多态位
点数，2n 则为检测 n 个位点涉及的所有可能的试
验材料个数)，统计图谱的置信概率[18]。同时，按照
Botstein 公式计算引物的多态信息含量 PIC = 1 −
∑ Pi
2，式中 Pi 表示第 i 种基因型出现的频率
[19]。
2 结果和分析
2.1 SCoT-PCR优化体系的确立
选取澳洲坚果 HAES842 品种 DNA 为模板，
以 SC3 为扩增引物，6 个 SCoT-PCR 影响因子的
单因素试验结果见图 1。
Mg2+ 浓度对扩增效果的影响明显。当 Mg2+
浓度小于 2.0 mmol L–1 时，基本上无扩增谱带；当
Mg2+ 浓度为 2.5 mmol L–1 时，其扩增谱带最明亮、
清晰、数目最多；而 Mg2+ 浓度为 3.0 mmol L–1 时，
扩增谱带减少，且条带模糊。因此，用 2.5 mmol L–1
作为 Mg2+ 最适浓度。
随着 dNTPs 浓度的升高，扩增谱带的数量及
亮度呈上升趋势。当 dNTPs 浓度为 0.3 mmol L–1 时，
扩增谱带最明亮、清晰、数目最多；之后随着浓度的
增加扩增谱带减少。因此，选择 0.3 mmol L–1 为最
适浓度。
随着引物浓度的增加，扩增谱带的数量及亮度
逐渐增加。当引物浓度为 0.8 μmol L–1 时，其扩增
效果最佳，谱带最明亮、清晰、数目最多。因此，选
择 0.8 μmol L–1 为最适浓度。
表 1 澳洲坚果 SCoT-PCR 反应体系中影响因素的水平设计
Table 1 Different concentrations of factors in SCoT-PCR system for macadamia
因素 Factors 浓度 Concentration
Mg2+ (mmol L–1) 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
dNTPs (mmol L–1) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
引物 Primer (μmol L–1) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
DNA 模板 Template DNA (mg L–1) 10 20 30 40 50
Taq DNA 聚合酶 Taq DNA polymerase (U) 0.25 0.50 1.00 1.50 2.00
图 1 Mg2+、dNTPs、引物、模板 DNA、Taq DNA 聚合酶浓度和退火温度对 SCoT 反应的影响。M: DNA marker, DL 2000; 1 ~ 5: 1.0、 1.5、 2.0、
2.5、 3.0 mmol L–1 Mg2+； 6 ~ 10: 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 mmol L–1 dNTPs; 11 ~ 15: 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 μmol L–1 引物； 16 ~ 20: 10、 20、 30、 40、
50 mg L–1 模板 DNA; 21 ~ 25: 0.25、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0 U Taq DNA 聚合酶； 26 ~ 31：退火温度为 40℃、 43.8℃、 50℃、 53.9℃、 60.1℃、 64℃。
Fig. 1 Effects of six factors on SCoT reaction. M: DNA marker, DL 2000; 1 – 5: 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 mmol L–1 Mg2+; 6 – 10: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4,
0.5 mmol L–1 dNTPs; 11 – 15: 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 μmol L–1 primer； 16 – 20: 10, 20, 30, 40, 50 mg L–1 template DNA; 21 – 25: 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 U
Taq DNA polymerase; 26 – 31: Annealing temperature at 40℃， 43.8℃ , 50℃ , 53.9℃ , 60.1℃ , 64℃ , respectively.
蔡元保等：澳洲坚果SCoT反应体系的建立及应用
256 第21卷热带亚热带植物学报
随着模板 DNA 浓度的增加，扩增谱带的数量
及亮度逐渐增加。当模板 DNA 浓度为 40 mg L–1 时，
扩增谱带最明亮、清晰、数目最多；之后浓度提高
扩增效果无明显差异。本着经济高效的原则，选择
40 mg L–1 为模板 DNA 最适浓度。
随着 Taq DNA 聚合酶用量的增加，谱带的亮
度和数量增加，同时也逐渐出现模糊拖影现象。
Taq DNA 聚合酶用量在 1.0 ~ 2.0 U 时扩增效果较
好，但用量在 1.0 U 时的条带较明亮清晰，无模糊拖
影现象，故选取 1.0 U 为最适 Taq DNA 聚合酶浓度。
随着退火温度的增加，谱带数量也增加。当退
火温度为 50℃时的谱带最多且清晰，此后随着退
火温度的升高特异性增强，谱带逐渐减少。因此，
确定引物 SC3 的最佳退火温度为 50℃。用随机选
择的 30 条引物以退火温度为 50℃进行扩增，证明
50℃可以作为澳洲坚果 SCoT 标记的统一退火温
度。
因此，澳洲坚果总 DNA 的 SCoT-PCR 反应体系
确定为：体系总体积为 20 μL，包含 2.5 mmol L–1 Mg2+，
0.3 mmol L–1 dNTPs， 0.8 μmol L–1 引物， 40 mg L–1
模板 DNA 和 1.0 U Taq DNA 聚合酶 , 最适退火温
度为 50℃。
2.2 SCoT-PCR优化体系的验证
根据确立的优化条件，选用引物 SC5 和引物组
合 SC34 + SC39 分别对参试的 12 份澳洲坚果种质
进行扩增 , 以验证该体系的稳定性和可靠性。由图
2 可见，该反应体系对不同澳洲坚果种质的扩增效
果良好，扩增条带清晰，分辨率较高，多态性好。说
明所确立的优化体系具有良好的稳定性、可靠性和
较高的分辨率，适用于澳洲坚果的 SCoT 分析。
2.3 指纹图谱构建与置信概率分析
采用优化的反应体系对引物进行了筛选，结果
表明，引物 SC5 和引物组合 SC34 + SC39 都能扩增
出 11 条带；多态性的条带分别有 8 条和 6 条，多态
性比率分别高达 72.73% 和 54.55%；多态性信息含
量 PIC 分别为 0.66 和 0.68。PIC 能反映出某一个
遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容
量，当 PIC > 0.5 时，该座位为高度多态性座位[20]。
因此，引物 SC5 和引物组合 SC34 + SC39 属于高度
多态性引物。
根据最小差异原则兼顾鉴别种质指纹图谱的
置信概率，选用多态性良好的引物 SC5 和引物组合
SC34 + SC39 进行扩增(图 2)。结果表明，它们可
将参试的 12 份种质全部区分开，将代表等位基因
位点有无的 1 和 0 按顺序组成数字指纹(表 2)。这
2 组引物的多态性位点数为 14，根据概率公式 P =
1/2n 可知，在 214 = 16384 份澳洲坚果种质中才有可
能存在 2 份种质的电泳图谱完全相同，置信概率达
到 99.988%，该指纹图谱可准确检测其中任何一份
种质。
3 讨论
SCoT 标记作为一种基于 PCR 技术的新型分
子标记，具有独特的优点，能有效地产生与性状连
锁的标记，方便分子标记辅助育种[12]。但由于其
图 2 引物 SC5 (A)和引物组合 SC34 + SC39 (B)对 12 份澳洲坚果种质的 SCoT-PCR 扩增。M: DNA marker, DL 2000；1 ~ 12 分别为 Reown (D4)、
HY、Hinde (H2)、Own Choice (O.C.)、T2、DND、D. Bown、NG-18、Ronik、Own-rentun、HAES114 和 HAES842。
Fig. 2 SCoT-PCR amplification of 12 macadamia germplasms by primer SC5 (A) and primer combination SC34 + SC39 (B). M: DNA marker, DL
2000；1 – 12 present Reown (D4), HY, Hinde (H2), Own Choice (O.C.), T2, DND, D. Bown, NG-18, Ronik, Own-rentun, HAES114 and HAES842,
respectively.
第3期 257
PCR 扩增结果受材料、反应体系等因素的影响很
大，有必要针对不同的试材和 SCoT-PCR 反应体系
进行优化。本研究用单因素设计方法进行了不同
影响因子的梯度试验，结果表明扩增结果在一定范
围内受引物、模板 DNA 和 Taq DNA 聚合酶用量的
影响不大，但 Mg2+ 和退火温度对 SCoT-PCR 扩增
的特异性和产量有显著的影响。这些结果与已有
的 SCoT-PCR 反应条件研究结果一致[21–23]，但是不
同物种对其各个影响因素的浓度要求不同。因此，
将 SCoT 标记应用于特定物种时，应对各主要影响
因素和反应程序进行优化，从而保证该标记反应体
系的稳定性和可靠性。对 12 份澳洲坚果种质的
SCoT-PCR 扩增结果表明，所确立的优化体系具有
良好的稳定性、可靠性和较高的分辨率，说明 SCoT
标记可适合于澳洲坚果种质鉴定、遗传多样性分析
和优良性状标记等方面的应用。
利用分子标记技术获得品种的指纹图谱是目
前品种鉴定技术的主要手段。用于构建品种指纹
图谱的 DNA 分子标记应具有多态性高、重复性
和稳定性好、带型清晰、操作简单、成本低等特点。
SCoT 标记具有这些优点，可用于澳洲坚果品种指
纹图谱构建，使每个品种获得唯一的指纹身份证，
从而可简单有效地判别某一个品种。在实际应用
中，随着澳洲坚果品种的不断增加，可能会出现相
同单引物在不同品种之间谱带相同的现象。因此，
本研究在 SCoT 单引物筛选基础上，筛选出多态
性良好的引物组合，以进一步区别不同澳洲坚果
品种。经筛选的单引物 SC5 和引物组合 SC34 +
SC39 具有良好的多态性，PIC 分别高达 0.66 和
0.68，可以将 12 份澳洲坚果种质完全区分开，每
份种质都有各自独特的数字指纹，置信概率达到
99.988%，可用于品种真伪鉴定、新品种登记以及品
种权益维护。因此，澳洲坚果 DNA 指纹图谱可成
为一种应用生物学技术保护澳洲坚果品种产权的
重要方法。
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表 2 澳洲坚果 12 份种质的 DNA 数字指纹图谱(SC5， SC34 + SC39)
Table 2 DNA fingerprint binary codes of the twelve macadamia varieties (SC5, SC34 + SC39)
编号
No.
材料
Material
数字指纹图谱
Digital DNA fingerprint
编号
No.
材料
Material
数字指纹图谱
Digital DNA fingerprint
1 D4 00110110 – 001000 7 D. Bown 00011011 – 000001
2 HY 11011100 – 010010 8 NG-18 00010100 – 001100
3 H2 00011001 – 001100 9 Ronik 00111010 – 111100
4 O.C. 10011011 – 001000 10 Own-rentun 00011011 – 001000
5 T2 00100100 – 111000 11 HAES114 00110101 – 111000
6 DND 10011011 – 000000 12 HAES842 00110100 – 001000
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