全 文 ：热带亚热带植物学报 2016, 24(3): 259 ~ 266
Journal of Tropical and Subtropical Botany

收稿日期: 2015–07–13 接受日期: 2015–09–11
基金项目: 国家级星火计划项目(2014GA720032)；福建省种业创新与产业化工程项目(FJZZZX-1540)；福建省三明市科技计划项目
(2014-N-3)；三明市农业科学研究院院立项目(2013-Y-01)资助
This work was supported by the China Spark Program (Grant No. 2014GA720032), the Seed Industry Innovation and Industrialization Project in
Fujian Province (Grant No. FJZZZX-1540), the Sanming Science and Technology Plan Projects in Fujian Province (Grant No. 2014-N-3), and the
Program of Sanming Institute of Agricultural Science (Grant No. 2013-Y-01).
作者简介: 江金兰(1973~ )，女，高级农艺师，主要从事园艺植物生物技术研究。E-mail: 420465520@qq.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: yewei922@qq.com




福建泰宁野生铁皮石斛种群的 ISSR 亲缘关系分析

江金兰 1，叶炜 1*，李永清 1，范志敏 2，雷伏贵 1，张锐 1，周建金 1
(1. 三明市农业科学研究院药用植物研究所，福建 沙县 365509；2. 福建泰宁红石山生态农业科技有限公司，福建 泰宁 354400)

摘要：为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)种质间的亲缘关系，利用 ISSR 技术对 34 份铁皮石斛种质资源进行亲缘关系和
遗传多样性分析。结果表明，9 条 ISSR 引物在 34 份种质中共扩增出 78 条带，多态位点百分率达 100%。UPGMA 聚类分析
表明，种质的相似系数为 0.61~0.92，在相似系数 0.626 处，福建省泰宁的野生铁皮石斛与栽培铁皮石斛分为两大类。泰宁
野生铁皮石斛种群的 Nei’s 基因多样性(H)和遗传分化系数(Gst)分别为 0.3111 和 0.4609，均高于栽培种群(0.3056 和 0.4204),
表明泰宁野生铁皮石斛具有较丰富的多样性和较高的种群分化系数。AMOVA 分析表明，铁皮石斛种群内变异指数为 74%,
种群间变异指数为 26%，表明不同种群间可能存在基因交流。这些为不同地域的野生铁皮石斛资源的有效保护及利用提供
理论依据及技术参考。
关键词：铁皮石斛；亲缘关系；ISSR；遗传多样性
doi: 10.11926/j.issn.1005-3395.2016.03.003

Genetic Relationships among Wild Dendrobium officinale Populations in
Taining, Fujian by ISSR

JIANG Jin-lan1, YE Wei1*, LI Yong-qing1, FAN Zhi-min2, LEI Fu-gui1, ZHANG Rui 1, ZHOU Jian-jin1
(1. Institute of Medicinal Plants, Sanming Academy of Agricultural Science, Shaxian 365509, Fujian, China; 2. Taining Hongshishan Ecological Agriculture
Science and Technology LTD Co. in Fujian, Taining 354400, Fujian, China)

Abstract: In order to understand the genetic relationships among germplasms of Dendroubium officinale, the
genetic relationships and genetic diversity of 34 germplasms of D. officinale were analyzed by ISSR. The results
showed that total 78 bands were amplified by 9 ISSR primers with percentage of polymorphic loci at 100%.
UPGMA cluster analysis indicated that the similarity coefficient ranged from 0.61 to 0.92, and wild and cultivated
D. officinale were divided into 2 groups at level of 0.626. The Nei’s gene diversity (H) and coefficient of gene
differentiation (Gst) of wild D. officinale from Fujian Taining was 0.3111 and 0.4609, respectively, which were
higher than those of cultivated D. officinale (0.3056 and 0.4204, respectively), indicated that there were high
diversity and gene differentiation among Taining D. officianle populations. AMOVA analysis showed that
variation coefficients between populations and within populations were 24% and 76%, respectively, which
indicated that there was gene flow among different populations. These would provide theoretical basis and
reference for efficient protect and utilization of wild D. officinale germplasms.
Key words: Dendrobium officinale; Genetic relationship; ISSR; Genetic diversity
260 热带亚热带植物学报 第 24 卷

铁皮石斛(Dendrobium officinale)又名黑节草,
是兰科(Orchidaceae)多年生附生草本植物，为我国
名贵中药材，主要含多糖、生物碱、多种人体必需
的微量元素和氨基酸，另外还有酮类、酯类、芪类、
酚、醇等，具有益胃生津、滋阴清热的功效[1]。野
生的铁皮石斛主要分布于我国安徽、浙江、福建、
广西、四川、云南等地[2]。福建省作为铁皮石斛的
原产地之一，野生资源丰富，已在纵跨境内的武夷
山脉多处发现野生的铁皮石斛资源，泰宁位于武夷
山脉中段的杉岭支脉东南侧，海拔落差大，境内大
量丹霞地貌以丘陵及山地形式分布，蕴藏丰富的野
生铁皮石斛群落，并在外观上与现有铁皮石斛栽培
品种呈现丰富的多样性。了解福建泰宁野生铁皮石
斛的生物多样性，对该地区野生铁皮石斛资源的保
护和利用具有重要的理论和现实意义。
铁皮石斛分布广泛，生存环境复杂，其形态特
征易受环境影响，DNA 分子标记具有受环境因素影
响小，可直接反映基因组的差异性特点。简单重复
序列(Inter-simple sequence repeats, ISSR)有较好的
稳定性和多态性，且操作简单、高效，已在石斛的
遗传多样性[3–5]、种类鉴定[6–10]和野生居群分析[11–15]
等方面得到广泛应用。福建是铁皮石斛的原产地之
一[2]，泰宁县分布有大量的野生铁皮石斛，其民间
采集与利用历史悠久，近年来由于破坏性采集，野
生资源日渐稀少，对其多样性研究与保护迫在眉
睫，但目前对该区铁皮石斛的种质资源调查和分析
还未见报道。本研究以福建省泰宁野生铁皮石斛和
其他地区人工栽培铁皮石斛为试验材料，利用 ISSR
分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系分析，探
讨泰宁野生铁皮石斛多样性以及与人工栽培铁皮
石斛的亲缘关系，为泰宁野生铁皮石斛资源的保护
及品种选育提供理论支持及技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂
材料 从福建泰宁采集野生铁皮石斛
(Dendrobium officinale)种质 19 份，人工栽培铁皮石
斛种质 15 份收集自福建、江西、湖北、浙江、云
南、广西等地(表 1)，所有材料均保存于三明市农业
科学研究院药用植物研究所实验室及种质资源圃。
生化试剂 Taq DNA 聚合酶和 Marker 购自
上海宝生物工程有限公司，琼脂糖、SDS、ISSR 引
物购自上海生工生物工程技术服务公司。

1.2 DNA 的提取
采用改良 CTAB 小量法提取铁皮石斛叶片总
DNA。取幼嫩叶片 0.1 g，加液氮研磨至粉末状，转
移至 2 mL 离心管中；加 800 µL 70℃预热的提取缓
冲液，振荡混匀，于 70℃水浴 5~10 min，期间不时
轻摇；加入 400 µL 氯仿，颠倒混匀 3~5 min；在 4℃
下 12000×g 离心 5 min，弃上清，用 75%预冷的乙
醇漂洗 2 次；晾干，加入 50 µL ddH2O，常温下溶
解；于-20℃保存备用。

1.3 ISSR 引物筛选及扩增
随机选取 3 个铁皮石斛样品混合，对 100 条随
机 ISSR 引物进行初步筛选，选出清晰、重复性好
的 ISSR 引物，再用所有铁皮石斛的 DNA 样品进一
步筛选，最终筛选出条带丰富、清晰的 9 条 ISSR
引物(表 2)。
ISSR-PCR 扩增反应体系共 20 µL，包含 ddH2O
9 µL，2×Taq MasterMix 9 µL，引物 1 µL，模板 DNA
1 µL。ISSR-PCR 扩增程序：94℃预变性 4 min; 94℃
变性 45 s，51℃~62℃退火 45 s，72℃延伸 2 min,
共 40 个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。2%琼脂
糖凝胶电泳分离扩增电泳产物，EB 染色，凝胶成
像系统观察并拍照。

1.4 数据统计和分析
ISSR 扩增产物经成像仪拍照，同一引物扩增、
电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，将扩增
产物在相同迁移位置清晰的条带赋值为 1，没有或
不易分辨的条带赋值为 0，用 Excel 建立原始数据
矩阵。
数据采用 NTSYS2.10e 软件进行分析，采用
SAHN 进行聚类分析，生成 UPGMA (Unweighted
pair group method with arithmetic mean)聚类图。利
用 POPGENE 1.32 分析不同种群间等位基因数
(Observed number of alleles, Na)、有效等位基因数
(Effective number of alleles, Ne)、Nei’s 基因多样性
(Nei’s gene diversity, H)、Shannon 信息指数(Shannon
information index, I)、多态性位点百分率(Percentage
of polymorphic loci, PPL)、遗传分化系数(Coefficient
of gene differentiation, Gst)。利用 GenAlEx 6.5 进行分
子变异分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)。
第 3 期 江金兰等: 福建泰宁野生铁皮石斛种群的 ISSR 亲缘关系分析 261



262 热带亚热带植物学报 第 24 卷

表 2 ISSR 引物
Table 2 Primers for ISSR
引物
Prime
序列 (5′~3′)
Sequece
退火温度 (℃)
Annealing temperature
条带数
Number of bands
多态性位点百分率
% of polymorphic loci
I08 (Ag)8C 54.59 9 100
I10 (GA)8T 52.18 7 100
I35 (AG)8YC 56.16 11 100
I41 (GA)8YC 56.16 9 100
I42 (GA)8YG 56.16 10 100
I66 (CTC)6 61.86 9 100
I73 (gACA)4 51.55 10 100
I78 (GGAT)4 51.55 8 100
I80 (GGAGA)3 53.57 5 100
总和 Total 78 100
平均 Mean 8.67 100

依据地理位置和来源将种质分为 5 个种群，种群 1
是福建省泰宁县杉城镇江家坊和寨下大峡谷的 7 份
野生种质，种群 2 是福建省泰宁县杉城镇洋川的 6
份野生种质，种群 3 是福建省泰宁县朱口镇蛤蟆岩
的 4 份野生种质，种群 4 是福建省泰宁县梅口乡野
趣源的 2 份野生种质，种群 5 是云南、福建、广西、
江西、广西、浙江的 15 份人工栽培种质(表 1)。

2 结果和分析

2.1 ISSR 扩增
从 100 条 ISSR 引物中筛选出 9 条扩增条带丰
富清晰的 ISSR 引物(表 2)，对铁皮石斛 5 个种群
34 份种质进行 ISSR-PCR 扩增。结果表明，9 条
引物共扩增条带 78 条，多态性位点百分率达
100%，每条引物扩增的多态性条带为 5~11 条, 平
均 8.67 条，其中引物 I41 扩增出的条带最清晰, 共
扩增出条带 9 条，ISSR 扩增条带大小为 100~
2000 bp (图 1)。

2.2 聚类分析
使用NTSYS 2.10e软件对遗传相似性进行分析
构建亲缘关系 UPGMA 树状图(图 2)。结果表明, 种
质间的相似系数为 0.61~0.92，在相似系数为 0.626

图 1 引物 I41 的 PCR 扩增。M: 标准分子量; 1~34 见表 1。
Fig. 1 PCR amplification by primer I41. M: DL 2000 bp standard Marker; 1-34 see Table 1.
第 3 期 江金兰等: 福建泰宁野生铁皮石斛种群的 ISSR 亲缘关系分析 263


处，可将 34 份铁皮石斛种质分成 2 大类，第 I 大类
包含 1~19 号，均为从福建泰宁采集的野生铁皮石
斛，第 II 大类包含 20~34 号，为从福建、浙江、云
南等地收集的人工栽培铁皮石斛。其中，源自福建
武夷山及冠豸山的栽培种与源自云南、湖北及江西
的栽培种的遗传距离较近，而源自浙江的栽培种则聚
在一起。这说明福建泰宁野生铁皮石斛与人工栽培铁
皮石斛的亲缘关系较远，存在较大的遗传距离。

图 2 铁皮石斛的 UPGMA 聚类分析。1~34 见表 1。
Fig. 2 UPGMA polygenetic tree of Dendrobium officinale. 1-34 see Table 1.

在相似系数为 0.634处可将 19份野生铁皮石斛
分为 2 个亚组，第 1 亚组由 1~4、6 (杉城镇江家坊)、
10~12 (杉城镇洋川村)和 18~19 号(梅口乡大金湖野
趣源)共 11 份种质构成；第 2 亚组由 7~9 (杉城镇洋
川村)、13 (寨下大峡谷)、14~17 (朱口镇蛤蟆岩)共
8 份种质构成，从采集地来分析(图 3)，源自不同地
理位置的泰宁野生铁皮石斛种质倾向于聚在独立
的分支上。

2.3 种群间的遗传多样性分析
为了解铁皮石斛野生种群和人工栽培种群间的
遗传多样性差异，将 34 份种质材料依据地理来源划
分为 5 个种群(表 1)。通过 POPGENE 分析(表 3)，多
态性最高为人工栽培种群 5 (样本数 15 份), 种群内
多态性位点百分率为 89.74%，Nei’s 基因多样性 H=
0.3056。值得注意的是，4 个泰宁野生铁皮石斛种群
(样本数 19 份)总体的基因多样性(H=0.3111)与人工
栽培种群 5 极为接近，这表明泰宁野生铁皮石斛具
有较为丰富的遗传多样性。而 4 个野生种群内的 Nei’s
基因多样性指数为 0.0385~0.2376，最高的是种群 1，
最低的是种群 4。种群的遗传分化系数(Gst)是评价种
群遗传结构的重要指标，5 个种群的 Gst为 0.4204, 而
4个野生种群的Gst为0.4609, 显示泰宁野生铁皮石斛
具有较高的种群分化系数, 这与进化树的结果相符。
为了解铁皮石斛野生种群与人工栽培种群间
的基因交流情况，利用 GenAlEx 6.5 进行 AMOVA
分析，结果表明，种群内的变异指数为 74%，种群
间的变异指数为 26%，表明不同群体间可能存在基
264 热带亚热带植物学报 第 24 卷


图 3 福建省泰宁野生铁皮石斛种群的地理分布
Fig. 3 Distribution of wild populations of Dendrobium officinale in Taining, Fujian

表 3 铁皮石斛种群的基因多样性
Table 3 Genetic diversity among 5 populations of Dendrobium officinale
种群 Population Na Ne H I PPL (%) Gst
1 1.6538±0.4788 1.4011±0.3635 0.2376±0.1934 0.3557±0.2772 65.38
2 1.5128±0.5031 1.3615±0.3929 0.2058±0.2117 0.3012±0.3037 51.28
3 1.4103±0.4951 1.2923±0.3713 0.1683±0.2063 0.2458±0.2990 41.03
4 1.0769±0.2682 1.0769±0.2682 0.0385±0.1341 0.0533±0.1859 7.69
小计 Subtotal 1.8590±0.3503 1.5423±0.3630 0.3111±0.1772 0.4621±0.2388 85.90 0.4609
5 1.8974±0.3054 1.5144±0.3329 0.3056±0.1600 0.4616±0.2127 89.74
总和 Total 2.0000±0.0000 1.6069±0.3156 0.3507±0.1411 0.5228±0.1725 100 0.4204
Na: 等位基因数; Ne: 有效等位基因数; H: Nei’s 基因多样性; I: Shannon 信息指数; PPL: 多态性位点百分率; Gst: 基因分化系数。
Na: Observed number of alleles; Ne: Effective number of alleles; H: Nei’s gene diversity; I: Shannon information index; PPL: Percentgage of polymorphic
loci; Gst: Coefficient of gene differentiation.

因交流。而基于 Nei’s 基因多态性指数建立的种群
树状图表明(图 4)，泰宁铁皮石斛不同种群间有较大
的基因差异，其中，种群 POP3、POP4 与 POP1、
POP2 的遗传距离大于与 POP5 的距离。这表明泰宁
野生铁皮石斛种群间虽然存在一定的基因交流，但
种群间仍有较大的基因差异。
3 讨论

福建泰宁县境内分布大量丹霞地貌，而野生铁
皮石斛在泰宁地区的分布区域狭窄，仅生长在丹霞
地貌岩壁上，但该地区铁皮石斛个体间的外观仍呈
现较为丰富的多样性。我们曾对源自福建泰宁地区
第 3 期 江金兰等: 福建泰宁野生铁皮石斛种群的 ISSR 亲缘关系分析 265



图 4 基于 Nei’s 遗传距离对铁皮石斛 5 个种群的聚类分析。POP1~POP5
分别为种群 1~5。
Fig. 4 Dendrogram of 5 populations of Dendrobium officinale based on
Nei’s gene distance. POP1-POP5 was population 1 to 5, respectively.

的 158 株野生铁皮石斛(由福建泰宁红石山生态农
业科技有限公司采集)进行了 ISSR 分子标记分析,
个体间的遗传距离为 0~0.58，多态性位点百分率为
91.7%，表明泰宁地区可能存在基因多样性丰富的
铁皮石斛种群。
为进一步了解福建泰宁不同区域野生铁皮石
斛的种群多样性，本研究收集了来自泰宁 4 个主要
丹霞地貌区域的 19 份野生铁皮石斛和 15 份主要栽
培种铁皮石斛进行 ISSR 分析。结果表明，所筛选
的 9 条 ISSR 引物可以在铁皮石斛野生和栽培种群
中扩增出丰富清晰的条带，且多态性条带百分率分
别为 85.90%和 89.74%，而在物种水平上的多态性
位点百分率为 100%。曾淑华等[15]对云南文山 8 个
种群 55 份材料进行分析，物种水平的多态性条带
百分率仅为 74.0%，表明泰宁地区可能存在基因多
态性更为丰富的种质资源。4 个泰宁野生铁皮石斛
种群的 Nei’s 基因多样性(H)为 0.3111，也高于云南
文山地区的(H=0.240)[15]和Li等报道的 12个铁皮石
斛种群(H=0.269)[16]，体现了泰宁地区野生铁皮石斛
资源的丰富程度。而与其他兰科植物野生种群相
比，泰宁地区野生铁皮石斛资源多样性指数小于无
距虾脊兰(Calanthe tsoongiana, H=0.398)[17]、云南西
双版纳的流苏石斛(D. fimbriatum, H=0.3227)[14]，但
高于湖北的春兰(Cymbidium goeringii, H=0.263)[18]
和天麻(Gastrodia ealta, H=0.176)[19]，在兰科植物中
具有较高的多样性水平。同时，AMOVA 分析表明
泰宁野生种群间的变异指数为 26%，表明泰宁野生
铁皮石斛不同群落间虽存在一定的基因交流，但种
群间仍有较大的基因差异，这与 Li 等[16]的研究结
果相似。本研究中，泰宁野生铁皮石斛 4 个种群具
有较高的种群分化系数(Gst=0.4609)，这可解释进化
树中 19 份泰宁野生铁皮石斛样本虽独立聚在同一
分支，但种质间呈现较远的相关性。
此前有研究指出，福建地区森林覆盖率高，地
理气候条件多样性程度大，其分布的兰科植物具有
明显的热带特征，兰科植物资源较其周边的浙江与
江西更为丰富[20–21]。在石斛属方面，中国植物志记
载福建分布的石斛属植物有剑叶石斛(D. acina-
ciforme)、细茎石斛(D. moniliforme)、铁皮石斛和广
东石斛(D. wilsonii)[2]，而林建丽等报道福建还有霍
山石斛(D. huoshanense)分布[22]。这表明，福建地区
可能蕴含丰富的野生石斛资源还有待发掘，福建泰
宁地区野生铁皮石斛种质资源分布广泛、基因多样
性丰富，可作为福建及周边地区的野生铁皮石斛种
质中心进行保护和利用。

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