全 文 ：山楂海棠 RAPD亲缘关系研究
张冰冰1 , 2 , 梁英海2 , 田彬彬1 , 王庆芬1 , 张彦波2 , 刘洪章1
(1.吉林农业大学园艺学院 , 长春 130118;2.吉林省农业科学院果树研究所 , 公主岭 136100)
摘 要:应用 RAPD分子标记技术 , 对山楂海棠的分类地位进行了探讨。根据 RAPD分子标记聚类分析 , 将14
份苹果材料分为 5类 , 8 份山楂材料分为 4 类 , 山楂海棠的亲缘关系位于山楂和苹果之间 , 但与苹果较近 , 认
为山楂海棠可能是苹果和山楂的属间杂交种。
关键词:山楂海棠;苹果;山楂;RAPD;亲缘关系
中图分类号:S661.5 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2007)05-0507-04
Study on the Genetic Relationship of Malus komarovii
Using RAPD Markers
ZHANG Bing-bing1, 2 , LIANG Ying-hai2 , TIAN Bin-bin1 , WANG Qing-fen1 , ZHANG Yan-bo2 , LIU
Hong-zhang1
(1.Colloge of Horticulture , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China;2.Pomology Insti-
tute , J ilin Academy of Agricultural Sciences , Gongzhuling 136100 , China)
Abstract:The classification status of Malus komarovii was discussed using RAPD(Random amplified
polymorphic DAN).Based on the Cluster analysis of RAPD markers , 16 species and cultivars of apple
were divided into 5 classes and 8 species and cultivars of Hawthorn were divided into 4 classes.M.ko-
marovii.was placed between Apple and Hawthorn ,whose genetic distance was closer with the apple′s
group and which was probably hybrid of Malus and Crataegus
Key words:Malus komarovii;apple;hawthorn;random amplified polymorphic DNA(RAPD);genetic
relationship
全世界苹果属植物共有 35个种 ,我国原产及
自然分布的有 24个种 。原产于吉林省长白山区
的山楂海棠(Malus komarovii)是苹果属 35个种中
的一个野生种 ,在分类学上被划归为陇东海棠
系[ 1-2] 。目前 ,苹果属植物中除山楂海棠外的 34
个种在世界上均有较广泛的分布 ,且资源数量较
多 ,唯有山楂海棠仅在我国吉林省长白山区有零
星分布 ,并处于濒临灭绝状态 ,现已被列为我国一
类保护植物 ,并在长白山建立了山楂海棠原生境
保护点 ,以加强其资源保护。张冰冰等人[ 3]研究
结果表明 ,山楂海棠植株能抗-45℃低温 ,属于高
抗寒的种质资源 ,同时还鉴定出山楂海棠高抗苹
果腐烂病。因此 ,山楂海棠已成为果树中独特的
优异种质资源而倍受世人瞩目 。陇东海棠 、山楂
海棠叶片与山楂的叶片相似 ,而山楂海棠野生分
布在吉林省长白山区 ,同陇东海棠(野生分布在甘
肃)存在着地理分布的远缘性 ,所以山楂海棠在分
类上可能并非与陇东海棠同属陇东海棠系 ,存在
属间杂交后代的可能性[ 1] ,但尚无分子水平上的
证据。本研究应用 RAPD分子标记技术对苹果
属 、山楂属相关种质资源进行了研究 ,其目的是通
过亲缘关系研究 ,为确定山楂海棠的分类地位提
通讯作者
基金项目:吉林省科技发展计划项目(20060224)
作者简介:张冰冰(1960-),女 ,研究员 ,在读博士 ,研究方向:果树种质资源。
收稿日期:2006-11-02 修回日期:2007-04-20
吉林农业大学学报 2007 ,29(5):507 ～ 510 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
供分子水平上的依据 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
因苹果属与山楂属植物有共祖关系[ 1] ,所以
选择 14份苹果属材料和 8份山楂属材料为试验
材料 ,分别取自国家果树种质苹果圃(中国农业科
学院果树研究所 ,辽宁兴城)、沈阳农业大学园艺
学院(辽宁沈阳)、国家果树种质公主岭寒地果树
圃(吉林省农科院果树所 ,吉林公主岭)和辽宁省
果树研究所(辽宁熊岳)。供试材料的编号 、名称
和分类等[ 4]详见表1 。试验所用 RAPD随机引物 、
Taq酶 、琼脂糖 、λDNA Marker 及限制性内切酶
EcoRⅠ和 HindⅢ等均购自北京鼎国生物技术有
限公司。
1.2 试验方法
基因组DNA的提取采用SDS法[ 5] 。用 1%的
琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量和浓度。在 25 μL
PCR反应体系中 ,分别加入 10 pmol/L引物 1μL ,
2 U/μL TaqDNA 聚合酶 0.5 μL , 20 ng/μL 模板
DNA 1 μL , 2.5 μL PCRbuffer[其中含 Tirs-HCl缓
冲液(pH 8.0)10 mmol/L , KCl 50 mmol/L , Mg2+
2.0 mmol/L] , 0.2 mmol/L dNTP 0.5 μL , ddH2O
19.5μL。扩增反应在德国 Biometra 公司生产的
UNO-Ⅱ型 PCR 扩增仪上进行 。反应程序为
94℃预变性 4 min;94℃变性45 s ,37℃退火 45 s ,
72℃延伸 90 s ,循环 35次;72 ℃5 min 。
电泳条件为恒压 110 V ,2 h ,电泳仪为北京市
六一仪器厂生产(DYY-6C)。紫外透射反射仪上
观察拍照。2次重复扩增 ,统计 DNA 带 ,有电泳
带记为 1 ,无电泳带记为 0。作 0 , 1矩阵图 ,计算
样品间的相似系数 ,利用 DPSv7.05软件的 UPG-
MA方法构建聚类树状图。
表 1 22份供试资源
Table 1.22 Germplasm resources used in the study
编号
Number
供试材料
Experimental
material
种质类型
Geermplasm type
分类地位及拉丁名
Classifi cation status and Latin name
来源地
Place of source
1 紫太平 地方品种 海棠果 M.prunifolia Brokh. 公主岭
2 白太平 地方品种 海棠果 M.prunifolia Brokh. 公主岭
3 小黄海棠 地方品种 海棠果 M.prunifolia Brokh. 公主岭
4 四楞海棠 地方品种 海棠果 M.prunifolia Brokh. 公主岭
5 六楞海棠 地方品种 海棠果 M.prunifolia Brokh. 公主岭
6 山楂海棠 野生种 山楂海棠 M.komorovii Rehd. 公主岭
7 毛山荆子 野生种 毛山荆子 M.mandshurica Maxim. 公主岭
8 陇东海棠 野生种 陇东海棠 M.kansuensis 兴城
9 东光一号 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
10 旭 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
11 富士 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
12 红星 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
13 金冠 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
14 拉宝 地方品种 苹果 M.pumi la Mill 熊岳
15 山楂 野生种 山楂 C.pinnatifida Bunge 公主岭
16 甘肃山楂 野生资源 甘肃山楂 C.kansuensis Wils 沈阳
17 吉伏 3号 育成品系 伏山楂 C.bret tschneideri Schneid 公主岭
18 吉伏 2号 育成品系 伏山楂 C.bret tschneideri Schneid 公主岭
19 红肉山楂 地方品种 山楂 C.pinnatifida Bge.var.major N.E.Br 沈阳
20 财红 育成品系 山楂 C.pinnatifida Bge.var.major N.E.Br 公主岭
21 黑石 4号 地方品种 山楂 C.pinnatifida Bge.var.major N.E.Br 公主岭
22 阿尔泰山楂 野生种 阿尔泰 C.altaica(loud.)lange 公主岭
508 吉林农业大学学报 2007年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2007 , October
2 结果与分析
2.1 DNA扩增结果
从120个随机引物中筛选出 10个引物 ,对供
试的 22 份试材进行 RAPD 标记分析 。共在 117
个位点上扩增出条带 , 平均每个引物扩增出
11.7个位点 。多态性位点 115个 ,平均多态性为
98.29%(表2)。10个引物在 22份供试材料中共
扩增出21个特异位点 ,扩增出 DNA 带的大小为
550 ～ 8 000 bp。引物 OPU3扩增的 RAPD产物图
谱见图1 。
1 , 24.λDNA Marker;2～ 23.1～ 22号试材 Experimental No.1 to 22 DNA
图 1 引物 OPU3对 22份资源的扩增结果
Fig.1.The amplification map of OPU3 on 22 Germplasm resources used in the study
表 2 10个 RAPD引物对 22份资源扩增结果
Table 2.RAPD amplification results with 8 primers on 22 Germplasm resources used in this study
引物
Primers
序列(5′～ 3′)
Sequence
扩增带数(多态性带数)
Total amplified bands(Polymornbic bands)
多态性百分率/ %
Percentage of polymorphic
bands
OPA 1 CAGGCCCTTC 14(13) 92.86
OPA 2 TGCCGAGCTG 13(12) 92.31
OPA 4 AATCGGGCTG 14(14) 100.00
OPA 16 AGCCAGCGAA 13(13) 100.00
OPA 18 AGGTGACCGT 10(10) 100.00
OPB 8 GTCCACACGG 10(10) 100.00
OPB 20 GGACCCTTAC 8(8) 100.00
OPH 14 ACCAGGTTGG 10(10) 100.00
OPU 2 CTGAGGTCTC 11(11) 100.00
OPU 3 CTATGCCGAC 14(14) 100.00
2.2 亲缘关系聚类结果
由图 2可见 ,在 0.27阈值可将 14份苹果试材
分为 5组:第 Ⅰ组有东光一号 、旭 、富士 、拉宝和红
星;第 Ⅱ组有小黄海棠 、六棱海棠 、金冠;第 Ⅲ组有
毛山荆子 、四楞海棠 、紫太平和白太平;第Ⅳ组只
有陇东海棠;第Ⅴ组只有山楂海棠。8份山楂试材
在0.41阈值下分为 4 大组:第 Ⅰ组为大果山楂
(Crataegus pinnatifida ),包括财红 、红肉山楂 、黑石
4号 、阿尔泰山楂;第 Ⅱ组为伏山楂(Crataegus pin-
natifida),包括吉伏 2号 、吉伏 3号;第 Ⅲ组为甘肃
山楂(Crataegus kansnensis);第Ⅳ组为山楂(Cratae-
gus pinnatifida)。
山楂海棠先与苹果属材料聚在一起之后再与
山楂属材料聚在一起 , 表明山楂海棠与山楂属和
苹果属都具有亲缘关系 ,但与苹果属更近 。
509张冰冰等:山楂海棠 RAPD亲缘关系研究
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
阈值 Threshold
图 2 22份资源 RAPD聚类图
Fig.2.Clustering scheme of 22 Germplasm resources
based on RAPD Marker
3 讨 论
李育农将原产于中国的苹果属植物划分为 3
组6 系:真正苹果组(包括山定子系 、苹果系和海
棠系 3个系)、花楸苹果组(包括三叶海棠系 、陇东
海棠系和滇池海棠系 3个系)、木多依海棠组 。其中
陇东海棠和山楂海棠划分在花楸苹果组中的陇东
海棠系。陇东海棠和山楂海棠表型性状与同组的
山荆子有着较大差异[ 1] ,前两者叶片与山楂叶片
相似。为此 ,笔者将陇东海棠和山楂海棠与山楂
和真正苹果组的山定子 、海棠果 、大苹果等具有代
表性的苹果属资源放在一起进行 RAPD 聚类研
究 ,结果陇东海棠先与山定子 、海棠果 、大苹果等
具有代表性的苹果属资源聚在一起之后再与山楂
海棠聚类 ,然后再与山楂聚类 ,表现出陇东海棠 、
山楂海棠亲缘关系位于山楂和苹果之间 ,但是近
于苹果属 。但山楂海棠和陇东海棠的亲缘关系也
较远 ,其原因可能是陇东海棠原产于甘肃(目前在
原产地还有野生分布),而山楂海棠原产于吉林省
长白山区 、朝鲜北部及俄罗斯远东地区(目前仅长
白山有少量野生分布),二者的地理远缘造成其遗
传距离和亲缘关系较远。因此笔者初步推断 ,山
楂海棠可能是山荆子与同属蔷薇科中的山楂的远
缘杂交后代 ,因苹果属 、梨属 、山楂属 、花楸属具有
共祖关系[ 1] ,存在属间杂种的可能性 。山楂海棠
同山楂的亲缘关系尚需进一步研究 。
参考文献:
[ 1] 李育农.苹果属植物种质资源研究[ M] .北京:中国农业出
版社 , 2001.
[ 2] 李育农.世界苹果属植物种类和分类的研究进展评述[ J] .
果树科学 , 1996 , 13(增刊):63-81.
[ 3] 张冰冰 ,刘慧涛 ,宋洪伟 ,等.寒地果树种质资源研究与利
用进展[ J] .植物遗传资源学报 , 2006, 7(1):123-128.
[ 4] 江用文.国家种质资源圃保存资源名录[ M] .北京:中国农
业出版社 , 2005.
[ 5] 王丙旭.RAPD在梨种质资源亲缘关系和品种鉴定中的应
用[ D] .长春:吉林农业大学 , 1998.
(上接第 494页)
的菌株或专化型产生毒素的能力不同 ,相同的菌
株产生毒素的能力直接受培养基成分和外界环境
等条件的影响[ 11] 。
综上所述 ,可以得出:F.oxysporum 4号小种
在 Richard液体培养基中最容易产毒 ,且以 20℃,
pH初始值为3 ～ 5时振荡培养 10 d为最佳产毒条
件。
参考文献:
[ 1] 林时迟 , 张绍升 , 周乐峰 , 等.福建省香蕉枯萎病鉴定[ J] .
福建农业大学学报 , 2000 ,29(4):465-469.
[ 2] 方中达.植病研究方法[ M] .3版.北京:中国农业出版社 ,
1998:62-72.
[ 3] 范文艳.茄腐镰刀菌液体培养产毒条件的筛选[ J] .黑龙江
八一农垦大学学报 , 2001 ,13(1):117-120.
[ 4] 石晓燕.谷镰刀菌液体培养产毒条件研究初报[ J] .河北农
业大学学报 , 1992 , 15(3):34-37.
[ 5] 胡适连 , 王碧青.香蕉枯萎病组培苗伤根接种试验[ J] .广
东农业科学 , 1988(2):38-39.
[ 6] 吴经纶 ,孙冰 ,王玉琴 ,等.麦类赤霉菌毒素的研究[ J] .微
生物学报 , 1981 , 21(3):344-349.
[ 7] 陈红兵 ,王金胜 ,张作刚 ,等.万寿菊根的提取物对西瓜枯
萎病反应的抗性研究[ J].植物病理学报, 2003(5):440-441.
[ 8] MATSMUOTO K , SOUZA L A C , BARBOSA M L.In vitro selec-
tion for Fusarium wi lt resistance in banana 1.Co-cultivation tech-
nique to produce culture fi lt rate of race 1 Fusarium oxysporum
f.sp.cubense[ J] .Fruits , 1999 , 54(2):97-102.
[ 9] 黎永坚.香蕉枯萎病菌及其毒素致病机制的研究[ D] .湛
江:广东海洋大学 ,2007:40-46.
[ 10] 马国斌 ,林德佩 ,王叶筠 ,等.培养条件对西瓜枯萎病菌镰
刀菌酸产生的影响[ J] .植物病理学报 , 1996 , 26(2):187-
191.
[ 11] 姚艳平 ,王建明 ,郭强 ,等.枯萎病菌不同专化型镰刀菌酸
的产生数量与菌丝生长的相互关系[ J] .山西农业大学学
报 ,2002 , 22(3):231-233.
510 吉林农业大学学报 2007年 10月
Journal of Jilin Agricultural University 2007 , October