全 文 ：核 农 学 报 ,
刀
卵清蛋 白基因表达放射免疫分析法
朱献琅 王 公金 严建民
一泉京南江苏省农业科学院原子能农业利用研究所
张德玉
江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所
应用竟争结合原理建立 了卵清蛋 白基 因表达的放射免疫分析法 。 采用氛胺 法标记
卵清蛋 白 , ‘ , 一 比活度达 一 拼 · 拼
一
,
, 冻干后在常温 下保存 , 有效期 一 个 月
以 鸡 卵清蛋 白作免疫原制备 出的杭五清特异性强 , 与其他生物大分子无交 叉反应 , 亲和
常数 为 护 , 结合率为 又 ” 最终稀释度 用双杭 一 作分 离剂
沉淀免疫复合物 , 其方法灵敏度为 , 可检 范国为 一 , 批 内
、批 问变异 系数
分别 为 和 。 该方法能有效地直接检测类卵清蛋 白含量 , 可作为一 种特异 、 灵
敏 、 简便 、 可 靠的分析技米 , 应用于 卵清蛋 白基 因表达生物基 因工程研 究
。
关键词 卵清蛋 白 基 因表达 放射免疫分析
前 言
利用重组 技术 , 已把一些真核生物基因如胰岛素 、 干扰素及生长激素等基因转移到原核
生物细胞中 , 生产出相应的商品药物 , 年 , ‘ 〕报道了把卵清蛋 白基因转移到大肠杆菌中 , 成
功地表达出类卵清蛋白 一 一 。 放免法 被有效地用于定性和定量检测基
因之表达 。 国内尚未见到测定卵清蛋白基因表达方法的报道 。 作者参阅有关文献 , 〕建立了卵清蛋
白基因表达的放射免疫分析方法 。
材 料 与 方 法
主要化药品及试剂 卵 鸡 清蛋白 为电泳纯 牛血清白蛋 白 为中国科学院上海生
化所东风生化试剂厂产 品 羊抗免丙种球蛋 白抗血清冻干 品为上海红旗制药厂产 品 聚 乙二醇
为上海化学试剂厂产品 ” 比活度 ·
一
, , 有还原剂 为中国原子能研究院
产品 抓胺 分析纯 为上海余山化工厂产品 其他药品均为分析纯 。
卵清蛋白抗血清的制备 选择新西兰雄兔 只 , 每只体重 。一 , 称取 , 加入
。二 生理盐水 溶解 , 然后加入等量的福 氏完全佐剂 , 待其充分溶解后 , 在兔颈 、 背部皮下多
点 点 注射 , 每只兔注射 , 作为基础免疫 , 以后每隔 周加强免疫 次
齐量同基础免疫 , 用福氏不完全佐剂 , 至第 次加强免疫后 天 , 颈动脉采血 , 分离出抗血清 ,
此文 于 年 月 日收到 。
期 卵清蛋白基因表达放射免疫分析法
按 加 。 防腐 、分装 , 于一 ℃冰箱保存 。
标记卵清蛋 白的制备 取 川 拼 溶液 于微量反 应 瓶 , 加入 川
, , 在冰浴条件下 , 磁力搅拌 , 同时加入 拼 拼 氛胺 溶液 , 反应 秒钟后 , 加
拜 拌 溶液终止 反应 , 立即上 〕 一 层析柱 , 饱和 , 用
。 溶液洗脱 , 部分收集放射性组分 , 第 峰为标记 ” 一 游离碘 , 加少址
作保护剂 , 立即分装 、冻干 , 在一 ℃冰箱保存备用
。
检测程序 样品 由本院农业生物遗传生理所提供 用 液 氮 冻 融 破 坏 细 菌 细 胞 壁 , 加
浸提 , 小时后 , 在高速微量离心机上离心 , 除去细胞壁 , 保留上
清液待测 。 称 于 容量瓶中 , 用 的 溶解 , 并稀释至浓度为
拜 , , 配成 拜 含有 、 、 、 、 、 、 系列浓度的标准液 。 取 塑料
试管 预先用 封闭 支 。 第 一 管为非特异性管 , 管内加 ,
下同 、 ‘’ 一
、 ,
正常兔血清 第 管为零标准管 。 , 每管
各加 , 、 ‘ 一 和抗血清 , 下同 第 管为标准管 , 依次分别加入
已配制好的标准 , 并在每管中各加入
, ” 一 和抗血清 第 管为样品管 , 每管
各加入 样品待测液 、 ’ ” 一 和抗血清 。 混匀后 , 置
‘
冰箱温育 小时 。
向每管内分别加入二抗 、 各 , 混匀 , 置室温
‘
左右 一 小时 , 在
高速微量离心机上离心 分钟 , 弃去上清液 , 再加 , 在旋涡混合器上振荡片刻后离心 , 弃去
上清液 , 保留沉淀 , 在 免疫计数器上测定放射性 。
结 果 与 分 析
一 抗血清的质量鉴定
抗血清的特异性 按 提出的方法测定其交叉反应 。 由表 看 出 , 参加测定的几种蛋
白质和细菌提取液与 抗血清的交叉反应均毛 或为零 , 说明 抗血清具有 良好的特异
性 。
表 卵清蛋白抗血清与若干蛋白质的交叉反应
一
化 合 物 交 叉 反 应
一 定 沉
卵清蛋白
胃蛋白酶
双甘氨肤
溶菌酶
胰蛋 匀酶
牛血清白蛋 白
明 胶
水稻 白叶枯菌 , , 。川 。功 、
抗血清的滴度 效价 将抗血清用 。 稀释成系列浓度 , 按零标准管程序测
定不同稀释度抗血清与‘ 一 结合率 , 以 为纵坐标 , 以抗血清稀释倍数为横坐标 , 绘出
抗血清稀释 曲线 图 , 抗血清与 ’ 一 结合率约为 最终稀释度 , 说明抗
血清有很高的效价 。
核 农 学 报 卷
抗血清的亲和力 按 作图法 , 根据标准曲线所得的数据 , 计算各标准管的 值
和 值 , 再从 值计算各标准管的结合浓度 即 值乘以标准抗原加标记抗原浓度之和 ,
以各标准管 值为纵坐标 , 结合抗原浓度 为横坐标 , 用直线回归法在普通坐标纸上得一
条与纵坐标 、横坐标相交的直线 。 值等于直线在纵坐标上的截距 与横坐标上的截距 二 ,
即 最大结合容量和结合点的浓度 的 比值 , 值的单位为 。 如 图 所示 , 经直线 回归
一
当 时 ,
当 时 ,
一 一 护
, 属高亲和力抗体 。
肠
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,
⋯。
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稀释倍数 肠 加
结合浓度 。
一
图 抗血清稀释度曲线
, 一
图 、 作图法计算抗血清 值
二 ’“ 一 标记抗原的质量
采用锐胺 法标记 , 使用 ’
厂
的比活度为 一 ·
一‘ , 经若干次标记 , ’ 一 的比
活度为 一 拼 · 拜
一 ‘ , 游离 三氯醋酸法 , 与 抗血清 , 结合率为 写 , 对免疫
管 经 。 封闭 非特异吸附镇 , 冻干品在常温下保存 个月有效 。
三 标准曲线的建立和样品的实测
根据上述检测程序实测数据 , 以 。 为纵坐标 , 标准 品浓度为横坐标 作图 图
, 标准曲线的结合率在 巧 , 曲线具有 良好的斜率 , 测试范围在 一 , 为便于计算 ,
曲线以 ’一 ’作图 ,样品浓度可根据实测结合率在标准曲线上直接查出或通过微机检测程
序得出 。 图 显示出 , 带有卵清蛋 白基因大肠杆菌 质粒 提取液与标记抗原具有强烈的竞
争抑制作用 。 因此 , 类卵清蛋 白含量随提取液的增加而等比例的增加 。 而天然大肠杆菌 提
取液则不显示竞争结合反应 。
四 方法的精确度
以变异 系数表示 , 个不同浓度样品批 内 一 差为 一 , 平均为
, 批间 一 差为 写一 , 平均为 。 因此 , 此方法具有 良好的重现性
表 。
五 方法的灵敏度
期 卵清蛋白基因表达放射免疫分析法
按两倍标准差法 , 用 个零标准管的平均计数减去两倍标准差 , 所得的计数在标准曲
线上查出相应的数值 。 本方法最小检出值为 。
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,
八次︶。国
提取液 川
〕
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尸月 小 】 刘门
图
·
卵清蛋白基因表达放射免疫标准曲线
只 。 。 八 一 。
图 细菌提取液类卵清蛋白的测定
一
· 提取液 。 提取液
表 放射免疫分析法的精确度
一一一
一 一 一
批 内
‘
批 间
讨 论
卵清蛋 白抗原碘化标记品是否符合要求是该方
一
法是否成功的关键 。
〕采用 和 的酞化试剂碘化法 , 标记品的比活度为 拜
· 拼 一 , , 有效地测定了
卵清蛋白基因在大肠杆菌中的表达产物 类卵清蛋白 。 该方法的优点是避免了蛋白质在标记过程
中与氧化剂 、 还原剂和碘液接触而产生的变性问题 , 把化学损伤减少到最低限度 缺点是在标记过
程中要进行两步反应 , 操作烦锁 , 放射性用量也较大 , 标记率较低 , 且试剂难得到 。 我们采用锐胺
法 , 经多次标记 , ’ 一 比活度为 一 介
· 拼 一‘ , 但标记品贮存方法不当 , 容易引起脱碘 。 因此
在标记品中加适量的 作保护剂后 , 再分装
、 冻干 , 常温下保存 个月 , 游离碘在 以下 ,
有效地克服了碘脱落 , 其免疫活性也无明显下降 石
“ ”
,
参 考 文 献
李向辉等 植物遗传操作技术 二 北京 科学出版社 ,
一 一
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李振甲 , 王仁芝主编 激索放射免疫分析 北京 科学技术文献出版社 ,
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