全 文 ：酶是广泛分布于生命有机体的组织细胞内
具有催化活性的特殊蛋白质，参与体内几乎所有
的细胞功能活动进程。有些酶类还是不同亚细胞
器的标志酶，如酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶，
过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶，葡萄糖-6-
磷酸酶是内质网的标志酶，氨肽酶是微粒体的标
志酶，琥珀酸脱氢酶和细胞色素氧化酶是线粒体
的标志酶[1–2]。目前，由国际生物化学酶学委员会
(Enzyme Commission, EC)认 定 并 注 册 登 记 编 号
的酶约有 2000 多种。按照酶对底物的特异性、催
化性和来源，酶的命名可分为 6 大类：氧化还原酶
(Oxidoreductase, EC 1)、转移酶(Transferase, EC 2)、
水解酶(Hydrolase, EC 3)、裂解酶(Lyase，EC 4)、异
构酶(Isomerase, EC 5)和合成酶(Synthetase, EC 6),
这些酶中已知能被现有的组织化学和细胞化学技
术原位检测显示的酶仅有 200 多种[3]。1980 年，简
收稿日期： 2014–01–09　　　　接受日期： 2014–04–17
基金项目： 广东省科技计划项目资助
作者简介： 林植芳(1936~ )，女，研究员，主要从事植物生理学研究。
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: linzhif@scbg.ac.cn
热带亚热带植物学报　2014， 22(5)： 525 ~ 536
Journal of Tropical and Subtropical Botany
植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
林植芳*, 刘楠
(中国科学院华南植物园，广州 510650)
摘要： 酶是参与植物体内生化反应的特殊蛋白质。在保持活组织和细胞结构完整性的条件下，利用组织化学、细胞化学、免疫
学和显微检测等技术研究酶的即位定位，是了解酶在组织、细胞和亚细胞中的分布、活性动态与定量及酶功能等的重要途径。
对植物体中酶定位的组织化学和细胞化学方法的概念、原理与研究进展进行了综述，并根据国际酶化学分类编号顺序，分别介
绍了 25 种酶的组织化学染色定位所用的反应介质和染色方法及 46 种酶的细胞化学定位方法的参考文献。
关键词： 植物酶； 组织定位； 染色方法； 细胞化学定位
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.05.016
Methods of In situ Histochemical and Cytochemical Localizations of
Plant Enzymes
LIN Zhi-fang*, LIU Nan
(South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China)
Abstract: Enzymes are special proteins that catalyze and regulate a series of life processes in plants. Studies on
in situ histochemical, cytochemical, immunological and microscopical localizations of metabolism enzymes in
intact plant tissues and cells are important approaches in understanding the distributions, activity dynamics and
quantifications, and functions of enzymes within tissues, cells and organelles. The basic concepts, principles and
research progresses of histochemical and cytochemical localizations of enzymes were reviewed. According to
the international enzymology classification and taxis, the reaction media and staining method of histochemical
localizations on 25 plant enzymes and references of cytochemical localizations on 46 plant enzymes were
introduced, respectively.
Key words: Plant enzyme; Histochemistry localization; Stainning method; Cytochemistry localization
526 第22卷热带亚热带植物学报
令成认为已知的酶总数接近 1000 种，其中约有 100
种可在光学显微镜上通过组织化学的定位方法得
以证实[2]，但他未明确指出这些均是植物酶抑或只
是当时的技术水平所能检测的包括动物等在内的
酶总数。由于植物的组织和细胞结构有别于人类
和动物的，通常对植物酶的原位组织化学与细胞化
学检测技术的研究水平和数量均显著比对人类和
动物的要低。目前还缺乏较系统地涉及植物的组
织化学与细胞化学方面的研究报道，故本文的目的
在于初步收集与此相关的文献，为有兴趣从事此类
研究的人员提供参考。
研究酶在植物组织和细胞内的即位(in situ)定
位、活性动态和调节是了解酶功能的有效途径[4]。
活细胞中酶活性定位研究包括组织和细胞水平的
定位技术，这两种定位技术均要求操作过程中不能
破坏目标酶的正常分布、酶与底物反应有高度的专
一性、反应产物不可扩散移位。因此，保持活细胞
和组织结构的完整性是获得一个酶在体内的活性
数据的最重要前提[1,5]。两种定位法的差别在于：前
者利用组织化学技术在酶存在的组织中专一生成
反应产物，并在光学显微镜下观察酶的组织定位分
布，而后者则借助于细胞化学技术在细胞的酶活性
位置形成不溶性的高电子密度沉淀物或免疫标记
产物，再利用电子显微镜或荧光显微镜原位检测酶
的亚细胞定位，并可定性和定量[2]。
酶的组织定位方法是利用组织学及理化方法
使目标酶作用于特定底物，再通过反应产物与染色
剂发生作用产生有色的不溶性沉淀，通过显微镜检
测或肉眼观察来判断目标酶在组织中的分布位点，
还可利用专一的电脑软件进行相对的定量分析[3]。
为了获得最佳的定位结果，组织化学定位研究必须
仔细选择反应条件并保持组织和其细胞器完整性，
并设对照实验，避免出现假象[6]。组织化学定位的
流程包括新鲜材料的取材、固定、切片、温育反应和
定位观察等，操作技术则因不同组织、不同酶而有
所差别。组织化学定位的优点在于易操作，低成本，
主要用于酶的分布特性研究。但是，由于具有专一
性的染色剂种类不多，使组织化学定位的应用受到
一定的限制[7]。
本文简要综述酶定位的组织化学和细胞化学
方法的概念、原理与研究进展，并依酶学命名分类
的排序，分别介绍已知的 25 种植物酶类的即位组
织定位染色检测方法。此外，还提供了 46 种酶的
细胞化学定位方法的参考文献，共 88 篇。
1 酶的组织化学定位研究方法
常用的酶的组织定位的染色法[2,5,8]主要有：(1)
联苯胺(Benzidine)法。DAB (3-3-Diaminobenzidine,
3′,3-二氨基联苯胺)在 POD 或偶联 POD 的催化下
脱氢聚合，再氧化出现棕褐色的阳性产物。(2) 四
唑盐(Tetrazole)法。酶催化底物氧化释出质子，用
NBT (Nitroblue tetrazolium, 氮蓝四唑)作最终的电
子受体，阳性反应产物为蓝色。此染色法用于脱氢
酶、氧化酶、还原酶和转移酶的定位研究。(3) 靛蓝
(Indigo blue)形成法。以酯型吲哚酚(Indoxyl)为底
物，在酶的催化下分解出吲哚酚，再氧化生成蓝色
靛蓝。此法常用于酯酶和磷酸酶的定位研究。(4)
金属沉淀法。利用铜、铁、铅、银等在酶的催化下生
成有色的沉淀，常用于磷酸化酶和 ATP 酶的组织
定位研究。下面按照酶化学分类及其编号顺序对
已知的酶组织化学定位方法简述如下：
1.1 氧化还原酶类
乙醇脱氢酶 (Alcohol dehydrogenase, ADH, EC
1.1.1.2)　　 以 NBT 作 为 人 工 电 子 受 体，酶 促 反
应产生不溶性的蓝色甲 (Formazane)。新鲜切片
放于反应介质中 40℃保温 1 h，然后用蒸馏水清
洗，照相。介质包含 3 mmol L–1 MgCl2，1% 蔗糖，
0.6 mmol L–1 NBT，1 mmol L–1 吩嗪硫酸甲酯(Phenazine
methosulfate, PMS)， 0.5 mmol L–1 NADP， 2%
PVP360K，0.01% Tween-20，0.5 mmol L–1 乙醇的二
甲胂酸钠(Na-cacodylic acid)缓冲液，pH 7.4。ADH
将乙醇转化为乙醛时将 NBT 还原生成不溶性的
蓝色甲 [9]。对照不加乙醇，或加 15 mmol L–1 的
吡唑(Pyrazole)抑制 ADH 活性。另一种相似的方
法是：反应缓冲液含 100 mmol L–1 磷酸钠(pH 7.5)，
400 μmol L–1 NAD，100 μmol L–1 NBT，3% 乙醇。
切片在缓冲液中于 30℃暗下保温 10~15 min，至深
蓝色的甲 出现，蒸馏水冲洗切片，照相。以叶片
为试材时需延长染色时间至数小时[10]。
乳酸脱氢酶 (Lactate dehydrogenase, LDH, EC
1.1.1.27)　　以底物乳酸(Lactate)作电子供体，铁氰
化钾(K-ferricyanide)作电子受体，Cu2+ 作捕获剂形
成亚铁氰酸铜沉淀。反应过程同时加酒石酸钠钾
(Na-K-tatrate)作为螯合剂阻止 Cu2+ 与反应介质其
第5期 527
他成分形成沉淀。反应介质含 50 mmol L–1 磷酸钾
缓冲液(pH 7.2), 5 mmol L–1 Na-K-tartrate，5 mmol L–1
CuSO4，20 mmol L
–1 铁 氰 化 钾，0.5 mol L–1 乳 酸
(D-Lactate)[11]。
苹果酸脱氢酶 (Malate dehydrogenase, MDH, EC
1.1.1.37)　　 利 用 NBT 还 原 的 色 素 形 成 法 和 酶
的专一底物产生有色沉淀物进行组织定位。8 μm
厚的冷冻切片置于含 160 mmol L–1 苹果酸钠(Na-
malate)，0.66 mmol L–1 NAD，0.084 mmol L–1 PMS
及 0.77 mmol L–1 NBT 的 63 mmol L–1 磷酸钾缓冲
液(pH 7.6)中，37℃温育 60~120 min。随后于 4%
中性福尔马林中固定 15 min，重蒸馏水洗，甘油-白明
胶封片，镜检。对照的保温介质中不加底物苹果酸
钠[12]。Fatelli 等[13]提出将手切切片在 2% PVP-40,
2 mmol L–1 DTT, 2% 多聚甲醛(Paraformaldehyde)，
0.1% BSA中固定20 min后，移至1% Triton于–20℃
下过夜。取出切片解冻，用冷水洗 4 次，每次间隔
30 min。MDH 的另一种反应介质含 50 mmol L–1
Tris-HCl 缓 冲 液(pH 7.0)，0.5 mmol L–1 NAD 或
NADP，0.025% BSA，0.03% NBT，1 mmol L–1
EDTA，5 mmol L–1 MgCl2，8 mmol L
–1 苹果酸钠，
室温温育 15 min，加 4% 甲醛停止反应，以不加苹
果酸钠者作对照。
葡糖-6磷酸脱氢酶 (Glucose-6-phosphate dehydro-
genase, G6PDH, EC 1.1.1.49)　　定位原理与 MDH
相 同。 冷 冻 组 织 切 片 10~12 μm 厚，反 应 介 质 含
20% 聚 乙 烯 醇(Polyvinylalcohol, 作 为 稳 定 剂)的
0.2 mol L–1 Tris-maleats 缓冲液 20 mL (pH 7.2)，NBT
10 mg，NADP 10 mg，G6P (Glucose-6-phosphate,
葡糖-6-磷酸) 60 mg。37℃温育 20~45 min 或室温
温育 60~75 min 后水洗，封入甘油，镜检蓝色沉淀
的部位。对照不加 G6P[14]。
乙醇酸脱氢酶 (Glycolate dehydrogenase, GDH,
EC 1.1.99.14)　　采用金属盐法，与 LDH 的定位法
相似，酶活性位点呈褐棕色[11]。样品可用组织切片
或细胞，用 50 mmol L–1 磷酸钾缓冲液(pH 7.2)洗 2
次后，放入反应介质中于 25℃暗下温育 20 min。
反应介质为：50 mmol L–1 磷酸钾缓冲液(pH 7.2)，
5 mmol L–1 Na-K-tartrate，5 mmol L–1 CuSO4，
20 mmol L–1 K-ferricyanide，20 mmol L–1 乙醇酸钠
(Na-glycolate)。
GSH-甲醛脱氢酶 (GSH-formaldehyde dehydro-
genase, FALDH，EC 1.2.1.1., 也称 Class III ADH)　　
定位原理也是利用 NBT 还原的显色法。整株幼苗
或组织切片放于含 15 mL 反应介质的液闪瓶中，
反应介质为：100 mmol L–1 磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，
9 mmol L–1 丙 酮 酸 钠(Na-pyruvate), 0.1% Triton
X-100, 0.6 mmol L–1 NAD, 0.02 mg mL–1 PMS,
0.2 mg mL–1 NBT，用4.8 mmol L–1 甲醛和1 mmol L–1
谷胱甘肽(Glutathione, GSH)反应产生此酶的真正
底物羟甲基谷胱甘肽(S-Hydroxymethylglutathine,
0.73 mmol L–1)。真空渗入 10 min, 42℃暗下保温
1 h，水洗停止反应，用 70% 乙醇洗几次以限制非专
一背景色，酶活性部位显现蓝色。对照只加甲醛或
GSH[15]。
氨基醛脱氢酶 (Aminoaldehyde dehydrogenase,
AMADH，EC 1.2.1.19)　　利用 NBT 还原法显色。
酶染色液含 0.15 mol L–1 Tris-HCl 缓冲液(pH 8.5),
1 mmol L–1 3-氨基丙酰醛(3-Aminopropionaldehyde,
APAL)，1 mmol L–1 NAD, 0.15 mmol L–1 PMS,
0.75 mmol L–1 NBT，25℃暗下温育 1~3 h。对照不
加底物 APAL[16]。
黄嘌呤脱氢酶 (Xanthine dehydrogenase, XDH,
EC 1.2.1.37)　　通过 NBT 还原形成蓝色不溶物而
定位。切片在反应介质中室温暗下温育 3 h，反应
介质含 0.55 mL 1.8 mg mL–1 的 NBT, 1.15 mL 次黄
嘌呤(Hypoxanthine)溶液(3 mL 10 mmol L–1 次黄嘌
呤 + 0.1 mol L–1 KOH + 2 mL 0.5 mol L–1 Tris-HCl 缓
冲液，pH 7.1), 0.05 mL 10 mg mL–1 MgCl2, 0.1 mL
4.5 mg mL–1 NAD, 2.5 mL 聚 乙 烯 醇 (Polyvinyl
alcohol，20 g 在 90℃下溶于 50 mL 的 50 mmol L–1
Tris-HCl, pH 7.4)，最后加入 0.1 mL 32 mg mL–1 的
叠 氮 化 钠(NaN3)和 0.1 mL 1.0 mg mL
–1 的 PMS。
对 照 不 加 底 物 或 加 XDH 的 抑 制 剂 别 嘌 呤 醇
(Allopurinol)[17]。
乙醇酸氧化酶 (Glycolate oxidase, GO, EC 1.3.3.1)
定位原理是金属盐法显色。反应介质含 8.5 mL
25 mmol L–1 磷酸钠缓冲液(pH 7.2), 0.5 mL 60 mmol L–1
CuSO4, 40 mmol L
–1 Na-K-tartrate (pH 7.2)，1 mL
铁氰化钾，5 mg PMS, 2 mg 黄素单核苷酸(Flavin
mononucleotide, FMN)，12.5 mg 乙醇酸钠[18]。
琥珀酸脱氢酶 (Succinate dehydrogenase, SDH,
EC 1.3.5.1)　　 利 用 NBT 还 原 显 色 法。8 μm 厚
的 冷 冻 切 片 置 于 160 mmol L–1 琥 珀 酸 钠(Na-
succinate), 0.82 mmol L–1 NBT 的 63 mmol L–1 磷酸
钾缓冲液(pH 7.6)中，37℃温育 60 min，再用 4% 中
林植芳等：植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
528 第22卷热带亚热带植物学报
性福尔马林固定 15 min，重蒸馏水洗，甘油-白明胶
封片，镜检。对照不加底物[12]。
胺氧化酶 (Amino oxidase, DAO, EC 1.4.3.6；PAO,
EC 1.5.3.3)　　DAB 被 H2O2 氧化形成棕色不溶性聚
合物或氯萘酚(4-Chloronaphthol)氧化为苯胺红沉淀。
多胺氧化酶染色液：1 mmol L–1 亚精胺(Spermidine,
SPD)或 腐 胺(Putrescine, Put)和 1 mg mL–1 DAB 的
pH 3.8 缓冲液。光下放置 18 h，酶催化反应产生
的 H2O2 与 DAB 生成红棕色不溶物
[19]。或用 POD
偶联试验，切片在含 60 μg mL–1 POD，0.04% DAB
的 10 mmol L–1 磷 酸 钠 缓 冲 液(pH 6.5)中 预 保 温
10 min，然后加 3 mmol L–1 Spd 保温，水洗 3 min 停
止反应。切片封入 25% 甘油，光镜检测，对照不加
Spd[20]。含 Cu 的胺氧化酶染色液为：50 mmol L–1
磷酸缓冲液(pH 5.0)，5 mmol L–1 Put，2.5 mmol L–1
氯萘酚，5 U mL–1 POD，室温温育 30 min，水洗停
止反应。酶催化反应产生的 H2O2 与氯萘酚被 POD
催化生成蓝色的苯胺红(Magenta)沉淀[21]。
细胞激动素氧化酶/脱氢酶 (Cytokinin oxidase/
dehydrogenase, CKX, EC 1.5.99.12)　　 通 过 NBT
还原形成蓝色不溶物。20~40 μm 厚的切片浸泡于
含 5 mmol L–1 异 戊 烯 腺 嘌 呤(Isopentenyladenine,
底 物), 0.15 mmol L–1 PMS, 0.75 mmol L–1 NBT 的
Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)的染色液中，暗下 37℃温
育 0.5~24 h, 检查紫色产物形成。为了防止温育
过程中试剂产生沉淀，每隔 6 h 用 0.2 mol L–1 Tris-
HCl 缓冲液(pH 8.0)冲洗切片并转入新鲜的染色液
中 , 光镜观察蓝色产物出现的部位[22–23]。对照的染
色液中不加底物。
细胞色素氧化酶 (Cytochrome oxidase, Cyox, EC
1.9.3.1)　　 以 α-萘 酚(α-Naphthol)为 底 物 催 化 的
反应产物与对氨基二甲基苯胺(N-Dimethylaniline
hydrochloride)的重氮基结合产生偶联偶氮反应，形
成偶氮色素(Azo-dyes)。新鲜切片放入 pH 5.8 的
100 mmol L–1 磷酸缓冲液，室温温育 5~10 min 后，
移入 1∶1 (V/V)的 1% α-萘酚和 1% 盐酸对氨基二
甲基苯胺液中染色 5 min，生成蓝色靛酚产物。对
照样品先煮沸杀灭酶活性再加底物混合液或先用
20 mmol L–1 KCN 抑制酶活性后再加同上的反应底
物[24]。
多酚氧化酶 (Polyphenol oxidase, PPO, EC 1.10.3.1)
酶催化多酚氧化生成褐色的醌类或经 DAB 或 3-
甲 基 苯 并 噻 唑 啉 酮 腙(3-Methyl-benzotiazolinone
hydrazine, MBTH)氧化而显色。切片放入 pH 7.2
的磷酸缓冲液于 2℃~5℃放置 5 min，再移入 1% 邻
苯二酚(Catechol)液中，37℃温育 10 h, 出现茶褐色
或棕色络合物[21]。当检测儿茶酚氧化酶 / 酪氨酸酶 /
漆 酶 (Catechol oxidase/tyrosinase/laccase) 的 组 织
定位时，染色液含各自所需的底物及 0.05% DAB，
0.1% CAT 的 0.1 mol L–1 磷 酸 钾(pH 7.0)缓 冲 液
(加 CAT 降解内源 H2O2，防止 POD 染色对 PPO 活
性定位的干扰)，组织片段 / 切片在 37℃暗下温育
30~90 min，观察出现橙色产物的部位。对照不加
DAB[25]。López-Serrano 等[26]报道的 PPO 组织定位
反应介质为：5 mmol L–1 酪胺(Tyramine)，2 mmol L–1
MBTH 的 50 mmol L–1 K-phosphate 缓冲液(pH 6.8)。
在有或无 5 mmol L–1 环庚三烯酚酮(Tropolone，一
种 PPO 抑制剂)下 25℃温育 15~30 min，观察桃红
色产物出现的部位。
过氧化物酶 (Peroxidase, POD, EC 1.11.1.7)
用联苯胺蓝色显示或 H2O2 介导酚类氧化显色。
POD 组织定位有多种方式：(1) 新鲜切片放入磷酸
缓 冲 液(pH 7.2)中 于 25℃ 浸 泡 5 min，移 入 1% 钼
酸 中 5 min，再 用 0.1% 联 苯 胺(加 1 滴 30% H2O2)
处理 0.5~1.0 min，镜检蓝色络合物生成的部位，对
照加 10 mmol L–1 NaF 抑制 POD 或先用沸水杀死
酶[24]。(2) 直接将切片置于 50 μmol L–1 的四甲基联
苯胺(3,5,3,5-tetramethylbenzidine-HCl, TMBZ, 一种
POD 的底物)的 Tris-acetate 缓冲液(pH 5.0)中，加入
0.33 mmol L–1 H2O2，25℃温育 15~30 min。对照不
加 H2O2，观察亮绿产物出现的位点
[26]。(3) 染色液
包含 50 mmol L–1 KH2PO4/K2HPO4 缓冲液(pH 5.3),
5 mmol L–1 H2O2, 10 mmol L
–1 愈创木酚(Guaiacol)。
切片浸泡于染色液中 10 min，POD 活性位点呈红
棕色，对照不加 H2O2
[27]。
1.2 转移酶类
蔗 糖 合 酶 (Sucrose synthase, SUS 或 Susy, EC
2.4.1.13)　　在几种工具酶参与下，蔗糖合酶催
化蔗糖降解，使 NBT 还原而显色。反应介质含
50 mmol L–1 Hepes-NaOH 缓冲液(pH 7.4), 5 mmol L–1
MgCl2, 1 mmol L
–1 EDTA, 0.1% BSA, 1 mmol L–1
EGTA, 1 mmol L–1 NAD, 1 U 葡糖磷酸变位酶(Phospho-
glucomutase, PGM), 1 U G6PDH，20 mmol L–1 葡糖-
1,6-二磷酸 (Glucose-1,6-diphosphate, G-1-6P), 1 U 尿
苷二磷酸焦磷酸化酶(Uridine-5′-diphosphoglucose
第5期 529
pyrophorylase, UDPase), 0.03% NBT。反应由加入
底物终浓度分别为 3.6 mmol L–1 蔗糖、71 μmol L–1
UDP、71 mmol L–1 焦磷酸(PPi)而开始。对照不加
蔗糖或 PGM，G-1-6P，PPi 或 NAD[28]。Wittich 等[29]
以 200 μm 或 1 mm 厚的玉米(Zea mays)粒切片为
试材，先用 2% 多聚甲醛 + 2% PVP-40，5 mmol L–1
DTT 于 4℃ 固 定 1 h，水 洗 5 次 除 去 可 溶 性 糖。
反 应 介 质 含 5 μL 150 mmol L–1 NAD，1 U PGM
5 μL，5 μL 3 mmol L–1 G-1,6-P，1 U G6PDH 5 μL，
5 μL UDPase, 280 μL 0.07% NBT，350 μL 缓冲液
(100 mmol L–1 Hepes, 10 mmol L–1 MgCl2, 2 mmol L
–1
EDTA, 0.2% BSA, 2 mmol L–1 EGTA, pH 7.4)和
50 μL 底物(含 0.75 mol L–1 蔗糖，15 mmol L–1 UDP，
15 mmol L–1 PPi)。SUS 催化蔗糖降解，引起 NBT
还原产生蓝色不溶产物。
己 糖 激 酶 (Hexokinase, HK, EC 2.7.1.1)和 果
糖 激 酶 (Fructokinase, FK, EC 2.7.1.4)　　 在 相 关
的工具酶和 ATP 参与下，酶催化底物葡萄糖或果
糖转化为 G-6-P, 氧化 NBT 而显色。反应介质含
50 mmol L–1 二 羟 基 氨 基-2 羟 甲 基-1,3-丙 二 醇
(BisTris) 缓 冲 液 (pH 8.0)、 6.25 mmol L–1 MgCl2、
2.5 mmol L–1 ATP、1 mmol L–1 NAD、1 U G6PDH、
1 U 磷 酸 葡 糖 异 构 酶(Phosphoglucose isomerase,
PGI，只在 FK 定位时加入)、12.5 mmol L–1 Hepes-
NaOH pH 7.4、0.25 mmol L–1 EGTA、0.25 mmol L–1
EDTA、0.025% BSA、0.03% NBT。 酶 反 应 以 加
0.5 mmol L–1 葡 糖(测 HK 时)或 0.5 mmol L–1 果 糖
(测 FK 时)开 始。 对 照 不 加 底 物 或 不 加 ATP 或
G6PDH 或 NAD[28]。
腺苷二磷酸焦磷酸化酶 (Adenosine-5′-diphos-
phoglucose pyrophosphorylase, AGPase，EC 2.7.7.7)　　
利用相关工具酶，ATP 和 PPi 催化底物 ADPGlc
(Adenosine-5′-diphosphoglucose，腺 苷 二 磷 酸 葡
糖)转化为 G-1-P, 氧化 NBT 而显色。反应介质含
75 mmol L–1 Hepes-NaOH 缓 冲 液 (pH 8.0)、
0.44 mmol L–1 EDTA、5 mmol L–1 MgCl2、0.1% BSA、
1 mmol L–1 NAD、20 mmol L–1 G-1,6-P、2 U PGM、
6 U G6PDH、2 mmol L–1 3-磷酸甘油酸(3-Phospho-
glyceric acid, 3-PGA)、10 mmol L–1 NaF、1.4 mmol L–1
PPi、0.03% NBT。 以 加 入 2 mmol L–1 ADPGlc 开
始 反 应。 对 照 不 加 ADPGlc 或 ADPGlc+PPi 或
NAD[28]。
尿苷-5′-二磷酸焦磷酸化酶 (Uridine-5′-diphospho-
glucose pyrophorylase, UGPase, EC 2.7.7.9)　　 以
尿苷二磷酸葡萄糖(UDPGlc)为底物，催化其转化为
G-1-P, 还原 NBT 而显色。反应介质含 100 mmol L–1
Hepes-NaOH 缓 冲 液 pH 7.5、1 mmol L–1 EDTA、
2 mg Mg(AC)2、1 mmol L
–1 NAD、1 U PGM、
1 U G6PDH、20 mmol L–1 G-1-6-P、0.9 mmol L–1
PPi、0.03% NBT。反应由加入 5 mmol L–1 UDPGlc
开始。对照不加 UDPGlc+PPi 或 NAD 或 UDPGlc[28]。
1.3 水解酶类
非 专 一 性 酯 酶 (Non-specific esterase, NE, EC
3.1.1.1)　　利用偶联偶氮色素法(Azo-dye method)。
样品于 4% 甲醛的磷酸缓冲液(pH 7.2)中固定 1.5 h，
移入 7.5% 蔗糖溶液低压渗入 10 min。反应介质含
30 mL 磷酸缓冲液(pH 6.4)，0.5 mL 1% 萘酚-AS-
乙酸盐的二甲基酰胺(Naphthol AS-acetatedimethyl-
formamide)溶液，20 g 快蓝 B (Fast blue B 盐，FB)
和 4 mL 25% 二甲亚砜(Dimethylsulphoxide, DMSO)。
温育 3 h 过程中置换反应介质几次，然后用缓冲液
冲洗样品以停止反应，再放于 100℃中 2 s，甘油-白
明胶封片，镜检蓝色偶氮染料产物。利用成像分析
技术，用 Lucis M 软件(Lim CZ)测定切片上相同面
积的染色部位和对照的光密度，计算 NE 的相对活
性[30]。
酸 性 磷 酸 化 酶 (Acid phosphorylase, ACPase，
EC 3.1.3.2)　　利用金属盐法形成 PbS 沉淀。切片
放入 80% 乙醇中，5 min 更换 1 次，共 3 次，接着
换成无水乙醇，共 3 次。再移入 0.5%~1% 的火棉
胶中 30 s，取出用 80% 乙醇洗 1 次，水洗 3 次，浸水
24 h。取出吸干，加反应试剂(4 mL 0.1 mol L–1 醋酸
缓冲液 pH 5.1, 1 mL 0.1 mol L–1 醋酸铅，0.6 mL 水，
0.4 mL 3.2% 甘油磷酸钠)，37℃温育 75~90 min 后，
用水洗 3 次，2% HAC 作用 1~2 min，再用水洗 3 次。
最后加 2% 硫化铵 0.5~1 min，水洗 3 次，镜检或用
甘油封藏，观察 PbS 黑色沉淀[21]。Cashikar 等用的
固定液包含 3.5% 甲醛，5% 醋酸，50% 乙醇，而反
应介质含52 mmol L–1 醋酸缓冲液(pH 5.0), 4 mmol L–1
Pb(NO3)2, 1 mmol L
–1 ATP, 温育 1~2 h 后水洗，加入
0.5% (NH3)2S，水洗封片后，用相差显微镜观察 PbS
黑色沉淀的位点[31]。
酸性转化酶 (Acid invertase, AI，EC 3.2.1.26)　　
在 葡 萄 糖 氧 化 酶(Glucose oxidase, GOD)参 与 下，
AI 转化蔗糖为葡萄糖并还原 NBT 为蓝色沉淀。
林植芳等：植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
530 第22卷热带亚热带植物学报
新鲜切片用 4% 福尔马林(pH 7.0)于 4℃固定 3 min
后，水洗除去内源的糖类(1 h 内至少洗 10 次), 然
后移入含 0.96 mg mL–1 NBT，0.56 mg mL–1 PMS，
25 U mL–1 GOD 及 100 mg mL–1 蔗糖的 0.38 mol L–1
磷酸钠缓冲液(pH 6.0)中，室温下温育，水洗后光镜
拍照，观察不溶性蓝色沉淀的部位[32]。对照不加
蔗糖。Sergeeva 等[28]报道的反应介质略有不同，为
38 mmol L–1 磷 酸 钠 缓 冲 液(pH 6.0), 25 U GOD,
0.024% NBT, 0.014% PMS, 1% 蔗糖。对照不加蔗
糖或 GOD 或 PMS。
三 磷 酸 腺 苷 酶 (Adenosine triphosphatase,
ATPase，EC 3.6.1.35)　　采用金属盐法，酶催化
反应释出的磷酸用 Pb(NO3)2 捕获，转化为 PbS 沉
淀而定位。反应介质含 20 mL ATP (1.5 mg mL–1)、
20 mL 0.2 mmol L–1 Tris-HCl 缓冲液(pH 7.2)、3 mL
Pb(NO3)2, 5 mL 0.1 mol L
–1 MgSO4, 2 mL 蒸 馏 水。
切片在反应介质中 37℃温育 1~3 h，水洗，加 1%
(NH4)2S 显色 1 min，水洗，观察黑色 PbS 的部位
[24]。
1.4 裂解酶类
碳酸酐酶 (Carbonic anhydrase, CA, EC 4.2.1.1)
采用金属盐法。1~5 mm 的手切根段和下胚轴段
用 2% 多聚甲醛，2% PVP, 1 mmol L–1 DTT 在室温
下固定 30 min, 水洗 4℃过夜，移入反应介质中温
育 30 min, 反应介质含 17 mL 溶液 A (12 mmol L–1
NiSO4, 39 mmol L
–1 KH2PO4) 和 40 mL 溶 液 B
(220 mmol L–1 NaHCO3), 均于用前制备。温育后样
品用 0.67 mmol L–1 磷酸缓冲液(pH 5.9)洗 10 min，
再用 0.5% (NH4)2SO4 显色，观察深褐色的部位。对
照不加底物 NaHCO3
[33]。
1.5 异构酶类
葡萄糖磷酸异构酶 (Phosphoglucose isomerase,
PGI, EC 5.3.1.9)和葡萄糖变位酶 (Phosphoglucomutase,
PGM, EC 5.4.2.6)　　PGI 催 化 F-6-P 为 G-6-P，
PGM 催化 G-1-P 为 G-6-P，均偶联 NBT 还原显色。
反应介质含 42 mmol L–1 Hepes-NaOH 缓冲液(pH
7.4)、4.2 mmol L–1 MgCl2、0.84 mmol L
–1 EDTA、
0.84 mmol L–1 EGTA, 0.084% BSA、1.4 mmol L–1
NDA、1 U G6PDH, 0.03% NBT、4.35 mmol L–1 F-6-P
(PGI 测定)或 4.35 mmol L–1 G-1-P (GPM 测定)。对
照不加底物 F-6-P、G-1-P 或 NAD+，水洗终止反应[28]。
Sergeeva 等还对拟南芥(Arabidopsis thaliana)整株幼
苗进行 PGM 染色，将染色强度转为定量数据，分析
PGM 在不同器官中的定量分布[34]。
2 酶的细胞化学定位研究方法
通常体外分离不同酶活性的生化分析方法
存在酶蛋白的稳定性及其所得组分的纯化程度的
不确定性，且并非所有的植物种类都能做细胞分
离分析，不可能全部分离纯化出高产量的细胞类
型[35–36]。酶的细胞化学活性定位是一种在亚显微
结构原位上检测细胞内酶的分布位点和活性丰度
的精确方法，其优点在于能同时提供形态学与生化
代谢功能的信息。
植物酶细胞化学定位技术主要有电镜细胞化
学(Electronmicroscope cytochemistry, EMCC)技术
和免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)技术
两类。EMCC 技术使酶的定位研究从显微水平发
展到超微结构水平，研究专一性酶在完整细胞内不
同组分部位的定位，其原理是使细胞内的目标酶与
专一底物产生特异反应，在 Ce3+，Cu2+ 和 Pb2+ 等
金属离子的参与下产生不溶性的电子致密化合物，
用电镜观察这些化合物在细胞内的分布位点，结
合计算机的自动成像分析软件进行定量分析[37–38]。
EMCC 技术大多来自组织化学的经典方法，不同的
是样品在反应介质温育后尚需要脱水，树脂包埋，
超薄切片和二次固定[1–2]。
ICC 技术则是利用抗体与抗原特异性结合的
原理和特殊的标记技术，提供植物结构中不同组织
与细胞间的代谢如何分隔，各目标抗原(酶)在细胞
内的分布位点及丰度。此技术结合抗原和抗体的
高化学专一性和电镜的高度空间分辨力，具有高度
专一性、高灵敏性的特点，是理想的酶细胞定位的
方法。自 1970 年开始应用以来，已被广泛使用[35–36]。
ICC 技术因其标记物种类不同和所需检测仪
器不同而可区分为免疫电子显微镜技术和免疫荧
光抗体技术，抗体可连接到一系列标记，如酶、荧光
分子、金颗粒和同位素等。标记抗体并用标记物与
其他物质的反应将阳性结果放大后，转换成可见的
发光或显色。不同的免疫技术有各自独特的试剂
和方法，但基本的过程相似，都包括抗体制备，组织
材料处理，免疫染色，对照实验，显微镜观察等。免
疫荧光细胞化学技术的建立最早，该技术是用荧光
素标记已知的抗体，与切片组织、细胞的抗原(酶)反
第5期 531
应，在荧光显微镜或激光电子共聚焦显微镜下观察
呈特异荧光的抗原抗体复合物存在的部位，确定抗
原在细胞内的定性和定位。常用的荧光标记物有
异硫氰酸荧光素(Flurescein isothiocyanate, FITC, 呈
黄绿色荧光)、四甲基异硫氰酸荧光素(Tetramethyl
flurescein isothiocyanate, TMRITC, 呈橙红色荧光)
和四乙基罗丹明(Tetraethyl rhodamine, RB200, 呈亮
橙红色荧光)[3]。
免疫电子显微镜法包括免疫酶标法和免疫金
银法等。免疫酶标法的酶标抗体上结合的主要是
辣根过氧化物酶(以 DAB 作供氢体)、碱性磷酸酶
(以快蓝或快红染色)和葡萄糖氧化酶(以 NBT 作电
子供体)。这些酶标抗体与目标酶特异结合产生的
抗原抗体复合物可形成有色的产物，从而对目标酶
进行精细的亚细胞定位。免疫金(Immunogold)或
免疫金银(Immunogold-silver)细胞化学技术则以胶
体金颗粒(1~100 mm)标记特异的免疫球蛋白(常用
的山羊抗家兔免疫球蛋白 IgG 酶抗体)作为探针，
对组织或细胞内的目标酶(抗原)进行定性、定位及
定量研究。金颗粒有很高的电子密度，在显微镜下
清晰可辨，不必进行呈色反应。若再配合银离子(如
乙酸银)显影液的还原反应，可使目标酶与抗体反
应部位的免疫金颗粒增大，显示更清晰的棕黑色，
显著提高灵敏度。免疫金法还可根据反应部位的
金颗粒数量进行酶活性的免疫细胞化学定量。目
前，免疫金银细胞化学法已被视为是适用于酶的细
胞化学检测的最广泛、最有效和专一的方法。此法
的特点是高敏感性，定位准确，方法安全，成本低，
实验标本可长期保存[3]。与免疫电子显微镜术相比，
免疫荧光法的特异性较高，但敏感度较低，且反应
后的标本因荧光衰减而不能长期保存[39]。此两种
免疫技术依染色步骤的多少均有直接法(一步法)与
间接法(二步法)之分，直接法简便、快速、特异性强，
间接法可用一种酶标抗体与多种特异性的一抗配
合而检测多种抗原，且其敏感性高，故比直接法更
佳，应用更广[3–4]。免疫酶细胞化学定位法的重点在
于免疫技术，其他的操作过程包括材料制备，固定
脱水，包埋，超薄切片等均相类似，只是定位不同酶
时所用的固定剂、缓冲液及其 pH 值、温度、温育时
间和包埋材料等有所不同。关于影响免疫组织化
学(细胞化学)染色的主要因素，Fung 等已作了详
细的评述[40]。
由于细胞化学定位方法的操作过程较复杂，
难以一一描述。本文只列举 88 篇有关 46 种酶的
细胞化学定位方法的文献。这些酶包括：山梨醇脱
氢酶[41]、苹果酸脱氢酶[42]、NADP-苹果酸酶[43–45]、
异柠檬酸脱氢酶[46–47]、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶[48]、肉
桂醇脱氢酶[49–50]、甘油醛-3-磷酸脱氢酶[51–52]、乙醇
酸氧化酶[53]、NADH-谷氨酸脱氢酶[54–55]、胺氧化
酶[56–57]、硝酸还原酶[58–60]、多酚氧化酶[61–62]、NADH-
脱氢酶[63–64]、过氧化物酶和过氧化氢酶[65–67]、抗坏血
酸氧化酶和谷胱甘肽还原酶[68–69]、脂氧合酶[70–71]、
花色素苷合成酶[72]、NO 合成酶[73–75]、ACC 合成
酶[76–78]、酪氨酸酶[79–80]、超氧物歧化酶[81–83]、查尔酮
合成酶[84–85]、蔗糖合成酶[86]、丙酮酸磷酸双激酶[87–89]、
果胶甲酯酶[90–92]、叶绿素酶[93]、酸性磷酸酶和 ATP
酶[94–96]、果 糖-1,6-二 磷 酸 酶[97–98]、淀 粉 酶[99–102]、纤
维素酶[103–104]、溶菌酶[105]、酸性转化酶[106]、黑芥子
酶[107–108]、羧肽酶[109–110]、焦磷酸化酶[111–112]、PEP 羧
化 酶[45,89,113–114]、Rubisco[115–116]、羟 氰 裂 解 酶[117–118]、
苹果酸合成酶[119–120]、碳酸酐酶[121–122]、苯丙氨酸解
氨酶[123–124]、丙二烯氧化物环氧化酶[125–126]和谷氨酰
胺合成酶[55,127–128]。
3 结语和研究建议
采用组织化学和细胞化学定位研究技术，可
在光镜或电镜水平上观察酶在细胞组织内的空间
分布特点和动态，进而结合图像分析技术做定量评
估。这种技术对于阐明和定量参与植物重要代谢
活动的关键调节酶的特性与功能尤为重要。组织
化学定位法易于操作，但精度较差，迄今能用其了
解组织与细胞中目标酶分布定位的数量仍相当有
限。细胞化学定位法是后期发展起来的技术，其精
度和专一性高，能同时提供目标酶的超微结构形态
学与生化功能的信息，其中尤以免疫细胞化学定位
技术更为理想有效。近年来，随着免疫细胞化学的
双重 / 多重染色技术和图像分析技术的发展，人们
能在同一细胞 / 切片上同时定量地显示两种以上
共存的抗原。而其与分子生物学的结合，更使免疫
细胞化学技术达到基因、分子水平的定位，成为生
命科学研究前沿的一种重要技术方法。与生命科
学其他研究领域相比，植物学方面的相关研究在技
术、材料与数量上均相对落后。在我国，免疫细胞
化学 / 免疫组织化学技术在 20 世纪 80 年代才逐
步普及[3], 而用于植物学研究方面的报道不多。据
林植芳等：植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
532 第22卷热带亚热带植物学报
此，我们认为要广泛而深入开展植物学中细胞化学
酶的定位研究，必需解决如下问题：1、尽量借鉴其
他生命科学领域的有效技术方法，应用于植物酶细
胞化学定位研究中。2、探索和制备更适用于植物
酶类定位研究用的专一性抗体，新的发色剂和荧光
性物质。3、探索提高细胞壁的透性，使介质中的底
物能在短时间内快速进入细胞并使其产物保留在
酶活性原位的方法。4、避免植物细胞的内源荧光
性物质，尤其是叶片的具自发荧光性色素对免疫荧
光检测的干扰。
参考文献
[1]　 Han Y S, Chen Y Y, Wu J M, et al. The application of enzyme
cytochemistry to electronmicroscopy [J]. Chin J Cell Biol, 1982,
4(2): 44–49.
韩玉升, 陈玉英, 吴竟梅, 等. 酶细胞化学在电子显微镜术中的
应用 [J]. 细胞生物学杂志, 1982, 4(2): 44–49.
[2]　 Jian L C. Methods of electromicroscope for plant enzyme
cytochemistry [J]. Chin J Cell Biol, 1980, 2(4): 34–46.
简令成. 植物酶细胞化学的电子显微镜研究方法 [J]. 细胞生物
学杂志, 1980(4): 34–46.
[3]　 Cai W Q. Histochemistry and Cytochemistry [M]. Beijing: People’s
Health Publishing House, 2009: 25–30,51–96,174–196.
蔡文琴. 组织化学与细胞化学 [M]. 北京: 人民卫生出版社,
2009: 25–30,51–96,174–196.
[4]　 Schmid G, Grisebach H. Immunofluorescent labelling of enzymes
[M]// Immunology in Plant Sciences. Berlin, Heidelberg: Springer,
1986: 156–174.
[5]　 van Noorden C J F. Imaging enzymes at work: Metabolic mapping
by enzyme histochemistry [J]. J Histochem Cytochem, 2010,
58(6): 481–497.
[6]　 Rost F W. Histochemical localization and assay of enzymes [J]. J
Clin Path, 1970, 4(1): 43–50.
[7]　 Hrazdina G, Zobel A M. Cytochemical localization of enzymes in
plant cells [M]// Jeon K W, Friedlander M. International Review
of Cytology, Vol. 29. San Diego: Academic Press, 1991: 269–322.
[8]　 Boonacker E, van Noordden C J F. Enzyme cytochemical techniques
for metabolic mapping in living cells, with special reference to
proteolysis [J]. J Histochem Cytochem, 2001, 49: 1473–1486.
[9]　 Paterfield D M, Matthewe S W, Daugherty C J, et al. Spaceflight
exposure effects on transcription, activity, and localization of
alcohol dehydrogenase in the roots of Arabidopsis thaliana [J].
Plant Physiol, 1997, 113(3): 685–693.
[10]　 Papdi C, Àbraham E, Joseph M P, et al. Functional identification
of Arabidopsis stress regulatory genes using the controlled cDNA
overexpression system [J]. Plant Physiol, 2008, 147(2): 528–542.
[11]　 Beazley B B, Gruber P J, Frederick S E. Cytochemical localization
of glycolate dehydrogenase in mitochondria of Chlamydomona
reinhardi [J]. Plant Physiol, 1976, 58(3): 315–319.
[12]　 Zarivi O, Cesare P, Aimola P, et al. Biochemical, electrophoretic
and immunohistochemical aspects of malate dehydrogenase in
truffles (Ascomycotina) [J]. FEMS Microbiol Lett, 2000, 185(2):
213–219.
[13]　 Fatelli M N, Tsikou D, Kollipoulou A, et al. Nodulation enhances
dark CO2 fixation and recycling in the model legume Lotus
japonicus [J]. J Exp Bot, 2011, 62(8): 2959–2971.
[14]　 Negi D S, Stephens R J. An improved method for the histochemical
localization of glucose-6-phosphate dehydrogenase in animal
and plant tissues [J]. J Histochem Cytochem, 1977, 25(2): 149–
154.
[15]　 Diaz M, Fernandez M R, Martinez M C. Histochemical assay to
detect class III ADH activity in situ in Arabidopsis seedlings [J].
Biotechn Histochem, 2004, 79(2): 91–94.
[16]　 Petrivalský M, Brauner F, Luhová L, et al. Aminoaldehyde
dehydrogenase activity during wound healing of mechanically
injured pea seedlings [J]. J Plant Physiol, 2007, 164(11): 1410–
1418.
[17]　 Triplett E W. Intercellular nodule localization and nodule specificity
of xanthine dehydrogenase in soybean [J]. Plant Physiol, 1985,
77(4): 1004–1009.
[18]　 Burke J J, Trelease R N. Cytochemical demonstration of malate
synthase and glycolate oxidase in microbodies of cucumber
cotyledons [J]. Plant Physiol, 1975, 56(5): 710–717.
[19]　 Rea G, de Pinto M C, Tavazza R, et al. Ectopic expression of
maize polyamine and copper amine oxidase in the cell wall of
tobacco plants [J]. Plant Physiol, 2004, 134(4): 1414–1416.
[20]　 Angelini R, Tisi A, Rea G, et al. Involvement of polyamine oxidase
in wound healing [J]. Plant Physiol, 2008, 146(1): 162–177.
[21]　 Delis C, Dimou M, Flemetakis E, et al. A root-and hypocotyls-
specific gene coding for copper-containing amine oxidase is
related to cell expansion in soybean seedlings [J]. J Exp Bot, 2006,
57(1): 101–111.
[22]　 Galuszka P, Frébortova J, Lukova L, et al. Tissue localization of
cytokinin dehydrogenase in maize: Possible involvement of quinone
generated from plant phenolics by other enzymatic systems in the
catalytic reaction [J]. Plant Cell Physiol, 2005, 46(5): 716–728.
[23]　 Saravanakumar A, Aslam A, Shajahan A. Histochemical localization
of cytokinin oxidase/dehydrogenase during the developmental
stages of Withania somnifera (L.) Dunal [J]. Afr J Biotechn,
2011, 10(44): 8800–8804.
[24]　 Guo J F. Introduction on the localization of several enzymes in
plant tissues [J]. Plant Physiol Commun, 1964(2): 53–55.
郭季芳. 介绍植物组织中几种酶的定位测定法 [J]. 植物生理
学通讯, 1964(2): 53–55.
第5期 533
[25]　 Binnington K C, Barrett F M. Ultrastructural localization of
phenoloxidases in cuticle and haemopoietic tissue of the blowfly
Lucilia cuprina [J]. Tissue Cell, 1988, 20(3): 405–419.
[26]　 López-Serrano M, Barceló A R. Histochemical localization and
developmental expression of peroxidase and polyphenol oxidase
in strawberries [J]. J Amer Soc Hort Sci, 2001, 126(1): 27–32.
[27]　 Polle A, Otter T, Seifert F. Apoplastic peroxidase and lignification
in needles of Norway spruce (Picea abies L.) [J]. Plant Physiol,
2008, 106(1): 53–60.
[28]　 Sergeeva L I, Vreugdenhil D. In situ staining of activities of
enzymes involved in carbohydrate metabolism in plant tissues
[J]. J Exp Bot, 2002, 53(367): 361–370.
[29]　 Wittich P E, Vreugdenhil D. Localization of sucrose synthase
activity in developing maize kernels by in situ enzyme histochemistry
[J]. J Exp Bot, 1998, 49(324): 1163–1171.
[30]　 Bilkova J, Albrechtova J, Opatrna J. Histochemical detection and
image analysis of non-specific esterase activity and the amount
of polyphenols during annual bud development in Norway spruce
[J]. J Exp Bot, 1999, 50(336): 1129–1138.
[31]　 Cashikar A G, Kumaresan R, Rao N M. Biochemical characterization
and subcellular localization of the red kidney bean purple acid
phosphatase [J]. Plant Physiol, 1997, 114(3): 907–915.
[32]　 Sayago J E, Ordóñez R M, Isla M I. Acid invertase localization
in leaves of the fern Pteris deflexa Link [J]. Eup J Histochem,
2008, 52(4): 255–262.
[33]　 Dimou M, Paunescu A, Aivalakis G, et al. Co-localization of
carbonic anhydrase and phosphoenol-pyruvate carboxylase
and localization of pyruvate kinase in roots and hypocotyls of
etiolated Glycine max seedlings [J]. Int J Mol Sci, 2009, 10(7):
2891–2910.
[34]　 Sergeeva L I, Vonk J, Keurentjes J J B, et al. Histochemical analysis
reveals organ-specific quantitative trait loci for enzyme activities
in Arabidopsis [J]. Plant Physiol, 2004, 134(1): 237–245.
[35]　 Edwards G E, Franceschi V R, Ku M S B, et al. Compartmentation
of photosynthesis in cells and tissues of C4 plants [J]. J Exp Bot,
2001, 52(356): 577–590.
[36]　 Walker R P, Chen Z H, Jognson K E, et al. Using immuno-
histochemistry to study plant metabolism: The examples of its
use in the localization of amino acids in plant tissues, and of
phosphoenolpyruvate carboxykinase and its possible role in pH
regulation [J]. J Exp Bot, 2001, 52(356): 565–576.
[37]　 Slocum R D, Furey III M J. Electron-microscopic cytochemical
localization of diamine and polyamine oxidases in pea and maize
tissues [J]. Planta, 1991, 183(3): 443–450.
[38]　 van Noorden C J, Fredriki W M. Cerium methods for light and
electron microscopical histochemistry [J]. J Microscopy, 1993,
171(Pt 1): 3–6.
[39]　 Kroese F G M. Immunohistochemical Detection of Tissue and
Cellular Antigens [M/OL]. New Jersey, USA: John Wiley & Sons,
Ltd, 2001: 1–9 [2013–12–25]. doi: 10.1038/npg.els.0001176
[40]　 Fung A Y F, Tam D C C. Review on the effectiveness of immuno-
histochemical staining [J]. J Hong Kong Inst Med Lab Sci, 2009–
2010, 12(1/2): 49–55.
[41]　 Wang X L, Xu Y H, Peng C C, et al. Ubiquitous distribution and
different subcellular localization of sorbitol dehydrogenase in
fruit and leaf of apple [J]. J Exp Bot, 2009, 60(3): 1025–1034.
[42]　 Stutter C, Hock B. Fluorescence immunohistochemical localization
of malate dehydrogenase isoenzymes in watermelon cotyledons:
A developmental study of glyoxysomes and mitochondria [J].
Plant Physiol, 1982, 70(4): 1162–1168.
[43]　 Maurino V G, Drinocovich M F, Casati P, et al. NADP-malic
enzyme: Immunolocalization in different tissues of the C4 plant
maize and the C3 plant wheat [J]. J Exp Bot, 1997, 48(308):
799–811.
[44]　 Drincovich M F, Casati P, Andreo C S, et al. Evolution of C4
photosynthesis in Flaveria species: Isoforms of NADP-malic
enzyme [J]. Plant Physiol, 1998, 117(3): 733–744.
[45]　 Famiani F, Walker R P, Tecsi L, et al. An immunohistochemical
study of the compartmentation of metabolism during the
development of grape (Vitis vinifera L.) berries [J]. J Exp Bot,
2000, 51(345): 675–683.
[46]　 Boiffin V, Hodges M, Gálvez S, et al. Eucalypt NADP-dependent
isocitrate dhydrogenase cDNA cloning and expression in
ectomycorrhizae [J]. Plant Physiol, 1998, 117(3): 939–948.
[47]　 Corpas F J, Barroso J B, Sandalio L M, et al. Peroxisomal NADP-
dependent isocitrate dehydrogenase: Characterization and activity
regulation during natural senescence [J]. Plant Physiol, 1999,
121(3): 921–928.
[48]　 Crevecoeur M, Cisse M, Albe X, et al. Glucose-6-phosphate
dehydrogenase activity in spinach as measured by image analysis:
A new approach for plant enzyme histochemistry [J]. Histochem
J, 1996, 28(1): 25–32.
[49]　 Blanco-Portales R, Medina-Escobar M, López-Raez A, et al.
Cloning, expression and immunolocalization pattern of a cinnamyl
alcohol dehydrogenase gene from strawberry (Fragaria × ananassa
cv. Chandler) [J]. J Exp Bot, 2002, 53(375): 1723–1734.
[50]　 Samag J, Hawkine S, Lauvergest V, et al. Immunolocalization
of cinnamyl alcohol dehydrogenase 2 (CAD2) indicates a good
correlation with cell specific activity of CAD2 promoter in
transgenic poplar shoots [J]. Planta, 1998, 204(4): 437–443.
[51]　 Zammit A, Copeland L, Miller C, et al. Immunocytochemical
localization of NAD-dependent glyceraldehydes-3-phosphate
dehydrogenase in soybean nodules [J]. Physiol Plant, 1992,
84(4): 549–554.
[52]　 Negi S S, Carol A A, Pandya S, et al. Co-localization of
glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase with ferredoxin-
林植芳等：植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
534 第22卷热带亚热带植物学报
NADP reductase in pea leaf chloroplasts [J]. J Struct Biol, 2008,
161(1): 18–30.
[53]　 Thomas J, Trelease R N. Cytochemical localization of glycolate
oxidase in microbodies (glyoxysomes and peroxisomes) of
higher plant tissue with the CeCl3 technique [J]. Protoplasma,
1981, 108(1/2): 39–53.
[54]　 Loulakakis K A, Roubelakis-Angelakis K A. Immunocharacterization
of NADH-glutamate dehydrogenase from Vitis vinifera L [J].
Plant Physiol, 1990, 94(1): 109–113.
[55]　 Kichey T, Le Gouis J, Sangwan B, et al. Changes in the cellular
and subcellular localization of glutamine synthase and glutamate
dehydrogenase during flag leaf senescence in wheat (Triticum
aestivum L.) [J]. Plant Cell Physiol, 2005, 46(6): 964–974.
[56]　 Laurenzi M, Tipping A J, Marcus S E, et al. Analysis of the
distribution of copper amine oxidase in cell walls of legume
seedlings [J]. Planta, 2001, 214(1): 37–45.
[57]　 Maini L, Carraro L M, Torrigiani P, et al. Cytochemical localization
of diamine oxidase in Helianthus tuberosus developing tubers [J].
J Plant Physiol, 1995, 146(3): 375–378.
[58]　 Vaughn K C, Campbell W H. Immunogold localization of nitrate
reductase in maize leaves [J]. Plant Physiol, 1988, 88(4): 1354–
1357.
[59]　 Kamachi K, Amemiya Y, Ogura N, et al. Immuno-gold localization
of nitrate reductase in spinach (Spinacia oleracea) leaves [J].
Plant Cell Physiol, 1987, 28(2): 333–338.
[60]　 López-Ruiz A, Verbelen J P, Bocanegra J A, et al. Immunocy-
tochemical localization of nitrate reductase in green algae [J].
Plant Physiol, 1991, 96(3): 699–704.
[61]　 Lax A R, Vaughn K C. Colocalization of polyphenol oxidase and
photosystem II proteins [J]. Plant Physiol, 1991, 96(1): 26–31.
[62]　 Thipyapong P, Joel D M, Steffena J C. Differential expression
and turnover of the tomato polyphenol oxidase gene family
during vegetative and reproductive developmemt [J]. Plant Physiol,
1997, 113(3): 707–718.
[63]　 Chabanet A, Goldberg R, Catesson A M, et al. Characterization
and localization of a phenloxidase in mung bean hypocotyl cell
wall [J]. Plant Physiol, 1994, 106(3): 1095–1102.
[64]　 Talarczyk A, Krzymowska M, Borucki W, et al. Effect of yeast
CAT1 gene expression on response of tobacco plants to tobacco
mosaic virus infection [J]. Plant Physiol, 2002, 129(3): 1032–
1044.
[65]　 De Felipe M R, Lucas M M, Pozuelo J M. Cytochemical study
of catalase and peroxidase in the mesophyll of Lolium rigidum
plants treated with isoproturon [J]. J Plant Physiol, 1988, 132(1):
67–73.
[66]　 Andrews J, Adams S R, Burton K S, et al. Subcellular localization
of peroxidase in tomato skin and the possible implications for
the regulation of fruit growth [J]. J Exp Bot, 2002, 53(378):
2185–2191.
[67]　 Bestwich C S, Brown I R, Mansfield J W. Localized changes in
peroxidase activity accompany hydrogen peroxide generation
during the development of a nonhost hypersensitive reaction in
lettuce [J]. Plant Physiol, 1998, 118(3): 1067–1078.
[68]　 Dalton D A, Bird L M, Lengeberg L, et al. Subcellular localization
of oxygen defense enzymes in soybean [Glycine max (L.) Merr.]
root nodules [J]. Plant Physiol, 1993, 102(2): 481–489.
[69]　 Matamoros M A, Baird L M, Escuredo P R, et al. Stress induced
legume root nodule senescence: Physiological, biochemical, and
structural alterations [J]. Plant Physiol, 1999, 121(1): 97–112.
[70]　 Rodriguez-Concepsión M, Gómez M D, Beltrán J P. Immunolo-
calizatin of lipoxygenase in pea (Pisum sativum L.) carpels [J].
Planta, 1996, 15(8): 620–626.
[71]　 Wang C, Croft K P C, Jarlfors U, et al. Subcellular localization
studies indicate that lipoxygenase 1 to 6 are not involved in lipid
mobilization during soybean germination [J]. Plant Physiol,
1999, 120(1): 227–235.
[72]　 Wang H, Wang W, Li H, et al. Expression and tissue and
subcellular localization of anthocyanidin synthase (ANS) in
grapevine [J]. Protoplasma, 2011, 248(2): 267–279.
[73]　 Barrose J B, Corpas F J, Carreras A, et al. Localization of nitric-
oxide synthase in plant peroxisomes [J]. J Biol Chem, 1999,
274(51): 36729–36733.
[74]　 Kuo W N, Ku T W, Jones D L, et al. Nitric oxide synthase
immunoreactivity in Baker’s yeasts, lobster and wheat germ [J].
Biochem Arch, 1995, 11(1): 73–78.
[75]　 del Rio L A, Corpas F J, Barroso J B. Nitric oxide synthase
activity in plants [J]. Phytochemistry, 2004, 65(7): 783–792.
[76]　 Rombaldi C, Lelièvre J M, Latché A, et al. Immunocytolocalization
of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase in tomato
and apple fruit [J]. Planta, 1994, 192(4): 453–460.
[77]　 Chung M C, Chou S J, Kuang L Y, et al. Subcellular localization
of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase in apple fruit
[J]. Plant Cell Physiol, 2002, 43(5): 549–554.
[78]　 Peck S C, Reinhardt D, Olson D C, et al. Localization of the
ethylene-forming enzyme from tomatoes, 1-aminocyclopropane-
1-carboxylate oxidase, in transgenic yeast [J]. J Plant Physiol,
1992, 140(6): 681–686.
[79]　 Moore B M, Kang B, Flurkey W H. Histochemical and immuno-
chemical localization of tyrosinase in whole tissue section of
mushrooms [J]. Phytochemistry, 1988, 27(12): 3735–3737.
[80]　 Moore B M, Kang B, Flurkey W H. Histochemical localization
of mushroom tyrosinase in whole tissue sections on nitrocellulose
[J]. Histochem Cell Biol, 1989, 90(5): 379–381.
[81]　 Ogawa K, Kanematsu S, Asada K. Generation of superoxide
anion and localization of CuZn-superoxide dismutase in the
vascular tissue of spinach hypocotyls: Their association with
第5期 535
lignification [J]. Plant Cell Physiol, 1997, 38(10): 1118–1126.
[82]　 del Río L A, Lyon D S, Olah I, et al. Immunocytochemical
evidence for a peroxisomal localization of manganese superoxide
dismutase in leaf protoplasts from a higher plant [J]. Planta,
1983, 158(3): 216–224.
[83]　 Canini A, Civitareals P, Marini S, et al. Purification of iron superoxide
dismutase from the cyanobacterium Anabaena cylindrica Lemm
and localization of the enzyme in heterocysts by immunogold
labeling [J]. Planta, 1992, 187(4): 438–444.
[84]　 Rommeswinkel M, Karwatzki B, Beerhues L, et al. Immuno-
fluorescence localization of chalcone synthase in roots of
Pisum sativum L. and Phaseolus vulgaris L. and comparable
immunochemical analysis of chalcone synthase from pea leaves
[J]. Protoplasma, 1992, 166(3/4): 115–121.
[85]　 Lembach A, Beerhues L, Wiermann R. In situ localization of
chalcone synthase in Larix needles by indirect immunofluorescence
[J]. Protoplasma, 1989, 153(1/2): 58–61.
[86]　 Fallahi H, Scofield G N, Badger M R, et al. Localization of
sucrose synthase in developing seed and siliques of Arabidopsis
thaliana reveals diverse roles for SUS during development [J]. J
Exp Bot, 2008, 59(12): 3283–3295.
[87]　 Hata S, Matsuoka M. Immunological studies on pyruvate
orthophosphate dikinase in C3 plants [J]. Plant Cell Physiol,
1987, 28(4): 635–641.
[88]　 Ueno O. Immunogold localization of photosynthetic enzymes in
leaves of various C4 plants, with particular reference to pyruvate
orthophosphate dikinase [J]. J Exp Bot, 1998, 49(327): 1637–
1646.
[89]　 Kondo A, Nose A, Ueno O. Leaf inner structure and immunogold
localization of some key enzymes involved in carbon metabolism
in CAM plants [J]. J Exp Bot, 1998, 49(329): 1953–1961.
[90]　 Quentin M, Jauneau A, Marvan O, et al. Immunolocalization of
pectin methylesterases in the hypocotyls tissues of flax [J]. Plant
Physiol Biochem, 1997, 35(6): 475–482.
[91]　 Morvan O, Quentin M, Jauneau A, et al. Immunogold localization
of pectin methylesterases in the cortical tissues of flax hypocotyls
[J]. Protoplasma, 1998, 202(3/4): 175–184.
[92]　 Chamberland H, Ouellette G B, Pauzé F J, et al. Immunocyto-
chemical localization of tomato pectinesterase in root cells of
tomato plants infected by Fusarium oxysporum f. sp. radicis-
lycopersici [J]. Can J Bot, 1991, 69(6): 1265–1274.
[93]　 Shemer T A, Harpaz-Saad S, Belausov E, et al. Citrus chlorophyllase
dynamics at ethylene-induced fruit color-break: A study of
chlorophyllase expression, posttranslational processing kinetics,
and in situ intracellular localization [J]. Plant Physiol, 2008,
148(1): 108–118.
[94]　 Wasaki J, Kojima S, Maruyama H, et al. Localization of acid
phosphatase activities in the roots of white lupin plant grown
under phosphorus-deficient conditions [J]. Soil Sci Plant Nutrit,
2008, 54(1): 95–102.
[95]　 Olmos E, Hellin E. Cytochemical localization of ATPase plasma
membrane and acid phosphatase by cerium-based method in
a salt-adapted cell line of Pisum sativum [J]. J Exp Bot, 1997,
48(8): 1529–1535.
[96]　 Hayashi M, Inoue S I, Takahaski K, et al. Immunohistochemical
detection of blue light-induced phosphorylation of the plasma
membrane H+-ATPase in stomatal guard cells [J]. Plant Cell
Physiol, 2011, 52(7): 1238–1248.
[97]　 Hermoso R, Felipe M R, Vivo A, et al. Immunogold localization
of photosynthetic fructose-1,6-bisphosphatase in pea leaf tissue
[J]. Plant Physiol, 1989, 89(1): 381–385.
[98]　 Ying Y S, Li L K, Wang D Y. Cytochemical localization of
electron microscopy on fructose 1,6-diphosphatase (FDPase) in
the mesophyll cells of plants [J]. J Chin Elect Micros Soc, 1989,
8(2): 31–35.
应芸书, 李里焜, 汪德耀. 植物叶肉细胞内果糖1,6-二磷酸酶
(FDPase)的电镜细胞化学定位法 [J]. 电子显微镜学报, 1989,
8(2): 31–35.
[99]　 Asatsuma S, Sawada C, Itoh K, et al. Involmemnt of α-amylase
I-1 in starch degradation in rice chloroplasts [J]. Plant Cell Physiol,
2005, 46(6): 858–869
[100]　 Pogson B J, Ashford A E, Gubler F. Immunofluorescence
localization of α-amylase in the scutellum, germ aleurone and
“normal” aleurone of germinated barley grains [J]. Protoplasma,
1989, 151(2/3): 128–136.
[101]　 Okamoto K, Akazawa T. Enzymic mechanism of starch breakdown
in germinating rice seeds: 8. Immunohistochemical localization
of β-amylase [J]. Plant Physiol, 1979, 64(2): 337–340.
[102]　 Zhang D, Wang Y. β-amylase in developing apple fruits: Activities,
amounts and subcellular localization [J]. Sci China C Life Sci,
2002, 45(4): 429–440.
[103]　 Bal A K, Verma D P S, Byrne H, et al. Subcellular localization
of cellulases in auxin-treated pea [J]. J Cell Biol, 1976, 69(1):
97–105.
[104]　 Peid P D, del Campillo E, Lewis L N. Anatomical changes and
immunolocalization of cellulase during abscission as observed
on nitrocellulose tissue prints [J]. Plant Physiol, 1990, 93(1):
160–165.
[105]　 Audy P, Benhamou N, Trudel J, et al. Immunocytochemical
localization of a wheat germ lysozyme in wheat embryo and
coleoptile cells and cytochemistry study of its interaction with
the cell wall [J]. Plant Physiol, 1988, 88(4): 1317–1322.
[106]　 Iwatsubo T, Nakagawa H, Ogura N, et al. Acid invertase of
melon fruits: Immunochemical detection of acid invertase [J].
Plant Cell Physiol, 1992, 33(8): 1127–1133.
[107]　 Thangstad O P, Iversen T-H, Bones S A. Immunocytochemical
林植芳等：植物酶的组织和细胞化学定位研究方法
536 第22卷热带亚热带植物学报
localization of myrosinase in Brassica napus L. [J]. Planta,
1989, 180(2): 245–248.
[108]　 Hoglund A S, Lenman M, Falk A, et al. Distribution of myrosinase
in rapeseed tissues [J]. Plant Physiol, 1991, 95(1): 213–221.
[109]　 Mehta R A, Warmbardt R D, Mattoo A K. Tomato fruit
carboxypeptidase: Properties, induction upon wounding, and
immunocytochemical localization [J]. Plant Physiol, 1996,
110(3): 883–892.
[110]　 Mehta R A, Warmbardt R D, Mattoo A K. Tomato (Lycopersicon
esculentum cv. Pik-Red) leaf carboxypeptidase: Identification,
N-terminal sequence, stress-regulation, and specific localization
in the paraveinal mesophyll vacuoles [J]. Plant Cell Physiol,
1996, 37(6): 806–815.
[111]　 Long A R, Williams L E, Nelsom S J, et al. Localization of
membrane pyrophosphatase activity in Ricinus communis
seedlings [J]. J Plant Physiol, 1995, 146(5/6): 629–638.
[112]　 Maeshima N, Hara-Nishimura I, Takeuchi Y, et al. Accumulation
of vacuolar H+-pyrophosphatase and H+-ATPase during reformation
of the central vacuole in ferminating pumpkin seeds [J]. Plant
Physiol, 1994, 106(1): 61–69.
[113]　 Araus J L, Bort J, Brown R H, et al. Immunocytochemical
localization of phosphoenolpyruvate carboxylase and
photosynthetic gas-exchange characteristics in ears of Triticum
durum Desf [J]. Planta, 1993, 191(4): 507–514.
[114]　 Ueno O. Immunocytochemical localization of enzymes involved
in the C3 and C4 pathways in the photosynthetic cells of an
amphibious sedge, Eleocharis vivipar [J]. Planta, 1996, 199(3):
394–403.
[115]　 Borkhsenious O N, Mason C B, Moroney J V. The intracellular
localization of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
in Chlamydomonase reinlandtii [J]. Plant Physiol, 1998, 116(4):
1585–1591.
[116]　 Castrillo M, Aso P, Longart M, et al. In situ immunofluorescent
localization of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
in mesophyll of C4 dicotyledonous plants [J]. Photosynthetica,
1997, 33(1): 39–50.
[117]　 Wajant H, Riedel D, Bent S, et al. Immunocytochemical
localization of hydroxynitrile lyases from Sorghum bicolor L.
and Linum usitatissimum L. [J]. Plant Sci, 1994, 103(2): 145–
154.
[118]　 White W L B, Aris-Garzon D I, McMahon J M, et al. Cyanogenesis
in cassava: The role of hydroxynitrile lyase in root cyanide
production [J]. Plant Physiol, 1998, 116(4): 1219–1225.
[119]　 Jaunin F, Henry H, Richter H, et al. Immunolocalization of
glyoxysomal malate synthase from soybean cotyledons (Glycine
max L.) [J]. Biol Cell, 1995, 83(1): 93–97.
[120]　 Trelease R N, Becker W M, Barks J J. Cytochemical localization
of malate synthase in glyoxysome [J]. J Cell Biol, 1974, 60(2):
483–495.
[121]　 Rumeau D, Cuiné S, Fina L, et al. Subcellular distribution of
carbonic anhydrase in Solanum tuberosum L. leaves [J]. Planta,
1996, 199(1): 79–88.
[122]　 Golvez S, Hirech A M, Wycoff K L, et al. Oxygen regulation
of a nodule-located carbonic anhydrase in alfalfa [J]. Plant
Physiol, 2000, 124(3): 1059–1068.
[123]　 Osakabe Y, Nanto K, Kitamura H, et al. Immunocytochemical
localization of phenylalamine ammonia-lyase in tissue of Populus
kitakamiensis [J]. Planta, 1996, 200(1): 13–19.
[124]　 Schöpker H, Kneisel M, Beerhues L, et al. Phenylalanine
ammonia-lyase and chalcone synthase in glands of Primula
kewensis (W. Wats): Immunofluorescence and immunogold
localization [J]. Planta, 1995, 196(4): 712–719.
[125]　 Cenzano A, Abdala G, Hause B. Cytochemical immuno-
localization of allene oxide cyclase, a jasmonic acid biosynthetic
enzyme, in developing potato stolons [J]. J Plant Physiol, 2007,
164(11): 1448–1456.
[126]　 Stenzel I, Hause B, Maucher H, et al. Allene oxide cyclase
dependence of the wound response and vascular bundle-
specific generation of jasmonate in tomato-amplification in
wound signaling [J]. Plant J, 2003, 33(3): 577–589.
[127]　 Pereira S, Carvalho H, Sunkel C, et al. Immunocytolocalization
of glutamine synthetase in mesophyll and phloem of leaves of
Solanum tuberosum L. [J]. Protoplasma, 1992, 167(1/2): 66–73.
[128]　 Carvello H, Pereira S, Sunkel C, et al. Detection of a cytosolic
glutamine synthetase in leaves of Nicotiana tabacum L. by
immunocytochemical methods [J]. Plant Physiol, 1992, 100(3):
1591–1594.