全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，l1(2)：l7 l76
Jbzl丌lnf of Tropical and Subtropical Botany
荔枝胚蛋白质的提取方法
张以顺 向 旭 2 黄上志 傅家瑞
(1．中山大学生命科学学院，广东 广州 510275；2．广东省农业科学院果树研究所，广东 广州 51o64o)
摘要：以不同体积的Tris—HCI(O．1moFL,pH8．8)为提取液，结合不同含量(以胚鲜重计)的PVP40，对怀枝、黑叶和桂味等
荔枝 (Litchi chinensis)品种 的胚蛋 白质进行提取 。结果表 明，提取液体积为胚鲜重 的 5倍(ml FW)，并加入 15％的
Pv】P4O时，提取蛋 白质的效果最好，可用于荔枝胚可溶性蛋 白质含量 的测定 ；胚乳蛋 白质的提取则 以等体积的提取液
(内含 2％的 PW 4O)为佳。加入 10％PVP40的胚蛋白提取液可直接进行 SDS-PAGE电泳 ，用 l0倍于蛋 白质提取液体
积 的乙醇沉淀胚和胚乳的蛋 白提取液，可得到最佳的 SDS-PAGE电泳效果 。
关奠词 ：荔枝 ；胚蛋 白质：P~ 40：电泳
中固分类号 ：Q946．1 文献标识码：A 文章编号 ：1005-3395(2003)02—0174—03
A M ethod for Extracting Embryo Proteins in Litchi chinensis Sonn．
ZHANG Yi．shun XIANG Xu HUANG Shang．zhi Ftl Jia．rui
(1．L Science College，踟 n hm Uniters讧y，Guangzhou 510275，chil1a；2．Pomology Institute，
C,,,eaong Academy ofAgriculturd Siences，Guangzhou510640。China)
Abstract：Diferent volumes ofTris-HCl bufer (0．1mol／L， pH 8．8) in combination with diferent contents of
PVP40 were employed to study the embryo protein extracted from Litchi chinensis varieties “Huaizbi”，
“Guiwei”and “Heiye”． It was shown that the volum e of Tris-HCl bufer being 5 times the蕾 sh wieght of
embryo and added with 15％PVP40(g g。FW)Was adapted to obtain a satisfactory result．Homogenate containing
15％PVP40(g g。FW)could be used directly for determination ofsoluble protein content by Coomassie Briliant
Blue G一250 and 10％ PVP40 (g g。FW) for sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS—PAGE)． Endosperm protein could be extracted with equal volum e of Tris—HCI containing 2％ PVP40．
Pr~ipitation of embryo an d endosperm proteins with ethan ol of 10 times the volum e ofpro tein extraction gave
bestSDS-PAGE pattern．
Key words：Litchi chinensis；Embryo protein ：PVP40；Elcctrophoresis
荔枝 (Litchi chinensis Sonn．)原产我国，是南
方典型的亚热带水果，也是顽拗性植物 的代表。荔
枝胚的发育状况可分为正常型、败育型和部分败育
型【l】，败育型胚俗称 “焦核 ”，是评估荔枝 品质的一
个非常重要的因子。
顽拗性植物荔枝、芒果等植物材料中通常含有
大量的多酚和醌类物质。多酚和醌类物质在蛋 白质
的提取过程中容易被氧化而使匀浆液变成褐色 ，不
但严重干扰提取工作的进行，而且影响蛋 白质的电
收稿 日期：20o2-o6一l1 接受日期：2O02—1O一18
基金项 目：广东省 自然科学基金项目 (980720)资助
善
泳效果。陈伟等[21用含有三氯醋酸和 B一巯基乙醇的
预冷丙酮在-20~C下浸提荔枝胚与 PVP的研磨粉来
提取荔枝胚蛋白质，取得较好的效果 。但该方法操
作程序烦琐，三氯醋酸不仅会造成蛋 白质变性，还
会改变蛋 白质的电泳行为网。也有学者通过在缓冲
液中加入一定量的SDS来提取含多酚类物质的植
物材料的蛋白质 ，可这种蛋 白质提取液不能用较
为简单的考马斯亮蓝 G-250法测定其蛋白质含量，
也不能直接用于双向电泳分析。我们的研究目的在
于建立一种简便 、快速和可靠 的方法，以适用于荔
枝胚和胚乳等含有多酚类物质的植物材料的蛋白
质提取。提取的蛋白质匀浆液经简单沉淀后，不仅
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第 2期 张 以顺等：荔枝胚蛋 白质 的提取方法 175
能直接用于含量测定，而且可直接用于单向和双向
电泳的分析 ，促进荔枝胚败育的分子机制等深层次
研究工作的开展 。
1材料和方法
1．1 植物材料
采 集 开 花 后 20 d和 40 d的 荔 枝 (Litchi
chinemis Sonn．)品种怀枝、黑叶及桂味幼果，置于
一 2o℃低温冰箱中保存 。
1．2 试 验方法
液体胚乳可溶性蛋白质提取 提取液配制：
Tris-HCl 0．1mol／L，pH 8．8 (内含 2 mmol／L二硫苏
糖醇 、2 mmol／L抗坏血酸 、2 mmol／L半胱氨酸 、
5 mmol／L EDTA、1％聚乙烯吡咯烷酮 PVP40、2％
B一巯基 乙醇)。从-20~C冰箱 中取出开花后 20 d的
荔枝幼果，剥去珠被 ，将冻冰的液体胚乳与胚分离
收集 ，等体积加入提取液 ，4℃，13 000×g离心
10min，取上清液，置 4~C备用。
胚可溶性蛋 白质提取 剥取开花后 40 d的
荔枝胚 ，取 1 g分别用 5％、10％、15％、20％、25％及
30％ 的 PVP40 (g g- FW)和 2、3、4、5倍 体 积
(ml g- FW)的 Tris-HCl提取液在液氮中研磨提取 ，
4~C，13 000×g离心 15 min，取上清液，置 4~C备用。
胚的蛋 白提取液与液体胚乳的蛋白提取液相同，但
PVP40用量按胚鲜重的百分比加入，且在提取前须
用少许提取液浸湿。
蛋白质纯化 在胚及胚乳蛋 白粗提液 中加
入 10倍 体 积 无 水 乙醇 ，置-20~C下 2-3 h，4~C，
13 000×g离心 20 mil，沉 淀用适量提取液溶解 ，
- 20~C条件下保存备用 。
蛋 白质含 量测定 按 Bradford川的方 法 进
行，用牛血清蛋白做标准曲线 。
SDS-PAGE 按 Menendezt4~方法进行 ，分离
胶浓度为 12％，浓缩胶为 4％，30 mA恒流电泳，蛋
白质上样量为 30 u g。用考马斯亮蓝 R-250对凝胶
进行染色，脱色液含 7％的冰醋酸和 10％的乙醇。
2结果
2．1 PVP40对荔枝胚蛋白质提取的影响
PVP40的主要作用在于它能与植物材料 中的
多酚类物质结合，以降低蛋 白质提取过程 中由于多
酚被 氧化而 带来 的干扰 。从提取 效果看 ，未加
PVP40的对照蛋白质提取液，当与考马斯亮蓝作用
时，其颜色为绿色，无法测定。随着 PVP40的加入，
蛋白质含量逐渐上升，当 PVP40用量约为胚鲜重的
15％时，蛋白质含量最高，其后又逐渐下降 (图 1)。
≥
∈
一
-c
旦
2
一
姐
龌
皿
囊
5％ 10％ 1S％ 20％ 25％ 30％
PVP40占胚鲜t的百分比
Percentage of PVP40 in embryo freah woight
图 l不同含量 PVP40及不同体积 的 Tris-HCl缓冲液对
荔枝胚蛋白质提取的影响
rig．1 Efectofdiferentcontents0f VP4oanddifotent
volun~ of Tris-HCIbuferOllm bryoprotein
extractioninlycheevarieties
A．桂味 C_miwei；B．黑叶I-Ieiye；C．怀枝 Htmizhi
2x、3x、4x、5x分别表示 Tris-I Cl缓冲液体积是胚鲜重
的 2 3 4 5倍 。 2x,3x,4x and 5x represent that the
volumes of s-HCl bufer ale 2,3．4 and 5 times ofthe
freshweightofembryo，respectively．
2．2 不同体积的 Tris-Ha 缓冲液对荔枝胚蛋白质
提取的影响
常用的蛋白质提取缓冲液不适用于荔枝胚蛋
白质 的提 取 。 经 过 大量 筛 选 ，我 们 采 用 了
0．1 moFL、pH 8．8的 Tris-HCl缓冲液(具体配制见
方法所述)。该提取液配合 PVP40的使用，可得到非
常好的效果，而且蛋 白质含量可通过比较简单的考
马斯亮蓝 (3-250法进行检测。
在 PVP40含量不变的的情况下，随着 Tris-HCl
缓冲液体积的增加，荔枝胚的蛋白质含量也随之提
高，当提取液体积达到胚鲜重的5倍(ml g- FW)时，
蛋白质含量最高 (图 1)。
6 5 ● 3 2 1 O ● § ● 3 2 ，
O
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176 热 带亚 热带 植物 学报 第 l1卷
2．3 PVP40对荔枝胚及胚乳蛋白质 SDS—PAGE的
影 响
提取完成后，我们分别对不同用量的 PVP40的
蛋白质提取液进行 SDS—PAGE电泳分析。结果表
明，当PVP40的用量大于或小于胚鲜重的 10％时，
电泳效果不理想 ，主要表现为泳道严重偏离，相互
挤压，即使提取液 的蛋 白质含量很高，凝胶却染不
出蛋 白质条带 ，未加 PVP40的对照也是如此 ；当
PVP40的用量为材料重量的 10％时，胚乳和胚的蛋
白质提取液进一步用 10倍体积的乙醇沉淀 ，可得
到最佳的 SDS-PAGE电泳效果 (图2)。
。 ◆ 20．1
_- -- _～ ● 一 14．4
1 2 3 M
A
纂
1 2 3
B
3讨论
荔枝胚和胚乳中含有大量的多酚及醌类物质、
有机酸 、糖等，成分复杂。传统的蛋白质提取缓冲液
难 以取得较好的分离效果，有的提取液如磷酸缓冲
液根本就不能提取出任何荔枝胚蛋白质 ，原因在于
大部分缓冲液的缓冲能力较差，荔枝胚用其匀浆，
前后的 pH值变化非常大，不利于蛋白质提取。即使
本文推荐的 Tris-HC1缓冲液 ，也只有在配合适量
PVP40的条件下 ，才能取得满意 的结果 ，达到分离
和测定的 目的。
- ．_．一 97．4
_ - ●一-66．2
43．0
- ．．． 31．0
■ 一 20．1
¨ ^
M
一 一
1 2 3 M
C
图 2乙醇沉淀对荔枝胚及胚乳蛋 白质 SDS-PAGE的影响
Fig．2 EfectofethanolprecipitationonSDS．PAGEoflycheeembryoprotein
h^乙醇沉淀后的胚乳蛋白质 SDS-PAGE。 SDS-PAGEofendospermproteinprecipitatedinethanol
B．10％PVP40提取的胚蛋白质 SDS-PAGE。 SDS-PAGE ofembryo protein homogenate containing 10％PVP40
C．乙醇沉淀后的胚蛋白质 SDS-PAGE。 SDS-PAGEofembryoproteinprec itat~ inethanol
1．桂味 Gu 试；2．黑叶 Heiye；3．怀枝Huaizhi；M：ProteinnlaEk~
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鼍 羹
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