全 文 ：梨(Pyrus bretschneideri)褐色果皮具有抵御病
虫害和不良环境的能力[1]。在安徽省砀山县发现 1
株 50 年生‘砀山酥梨’的 1 个枝条发生变异，暂定
名为‘锈酥’。‘砀山酥梨’和‘锈酥’幼果的果皮均为
绿色，从花后 75 d 开始，‘锈酥’果皮逐渐褐变；果实
成熟时，‘砀山酥梨’果皮黄绿，而‘锈酥’果皮为褐
热带亚热带植物学报　2015， 23(4)： 379 ~ 385
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2015–01–09　　　　接受日期： 2015–03–02
基金项目： 国家自然科学基金项目(31101519)； 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-29-14)资助
作者简介： 王孟东(1989~ )，男，硕士研究生，研究方向为果树种质资源利用与创新。E-mail: wangmengdong1989@sina.cn
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: hengwei@ahau.edu.cn
‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达
分析
王孟东, 杨金宇, 黄海娜, 朱立武, 衡伟*
(安徽农业大学园艺学院 , 合肥 230036)
摘要： 为了解梨(Pyrus bretschneideri)中 ERF 基因的功能，采用 3′ RACE 和 PCR 技术从‘砀山酥梨’中克隆了两个 ERF 基因，
并对其表达进行了分析。克隆的两个 ERF 基因都具有典型的 AP2/ERF 结构域，属于 ERF 基因家族，分别命名为 PbERF2 和
PbERF4，GenBank 登录号分别为 KJ623716 和 KJ623718。系统进化分析表明，PbERF2 与枇杷 ERF1，PbERF4 与黄瓜 ERF1
的亲缘关系较近。表达分析表明，PbERF2 和 PbERF4 在叶片中几乎不表达，果皮中的表达量高于果肉；‘锈酥’果皮 3 个发育
时期的 PbERF2 和 PbERF4 表达量均显著高于‘砀山酥梨’，且均呈现先上升后下降的趋势。这为深入研究梨 ERF 基因家族的
作用机理提供了理论依据。
关键词： 梨； ERF 基因； 实时荧光定量反转录 PCR
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.04.003
Cloning and Expression Analysis of Two ERF Genes in Pericarp of
Russet Mutant of ‘Dangshansuli’ Pear
WANG Meng-dong, YANG Jin-yu, HUANG Hai-na, ZHU Li-wu, HENG Wei*
(School of Horticulture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)
Abstract: The aim was to understand the function of ethylene responsive factor (ERF) in Pyrus bretschneideri.
Two ERF genes were cloned from pericarp of ‘Dangshansuli’ and its russet mutant ‘Xiusu’ by using 3′ RACE and
PCR monthods. Both of genes had typical conserved domain of AP2/ERF, named as PbERF2 and PbERF4, with
GenBank accession No. of KJ623716 and KJ623718, respectively. The phylogenetic tree showed that PbERF2
had closed correlation with ERF1 in loquat (Eriobotrya japonica) and PbERF4 was closed to ERF1 in cucumber
(Cucumis sativus). Semi-quantitative RT-PCR indicated that expressions of PbERF2 and PbERF4 in pericarps
were higher than those in sarcocarps, and both hardly expressed in leaves. Real-time RT-PCR showed that
expressions of PbERF2 and PbERF4 in pericarps of ‘Xiusu’ was significant higher than those in ‘Dangshansuli’,
and expression trend of them was upgrade at first and then descend. These would provide theory foundation for
further study on mechanism of ERF family genes in pear.
Key words: Pear; ERF gene; Realtime RT-PCR
380 第23卷热带亚热带植物学报
色。经 RAPD、AFLP、ISSR 分子标记研究，确定
为遗传性变异[2–4]。
在非生物胁迫中，干旱、冷害和盐胁迫等逆境
对梨产业造成的损失始终高于其它逆境危害[5]，因
此，研究梨的抗逆基因具有重要意义。AP2/ERF 家
族转录因子普遍存在于各种植物中，广泛参与植
物逆境诱导信号传导[6]。乙烯应答因子(Ethylene
responsive factor, ERF)属 于 AP2/ERF 家 族 中 重 要
的一个亚族，是该家族中成员最多的一类结合蛋
白，参与植物体的生物、非生物胁迫信号传导过
程[7–8]。干旱、低温和盐胁迫可以诱导水稻(Oryza
sativa)的 OsBIERF1、OsBIERF3 和 OsBIERF4 表
达[9]。ERF 基 因 在 番 茄(Lycopersicum esculentum)
中过量表达，植株的抗旱或耐盐能力不同程度提
高[10]。烟草(Nicotiana tabacum)中超表达 GmERF3
基因可诱导 PR 基因上调表达，增强对青枯病菌、
烟草花叶病毒的抗性以及抗盐抗旱能力[11]。香蕉
(Musa paradisiaca)在受到病菌侵染和低温胁迫时，
根和叶片中 MaERF 基因表达明显升高[12]。
目前，有关梨 ERF 基因的克隆与表达研究还
尚未见报道。本研究主要以‘砀山酥梨’和‘锈酥’
不同发育时期果皮为材料，利用 RACE 技术克隆了
两个抗逆相关基因 ERF 类转录因子，并进行相关
生物信息学分析；利用半定量 PCR 分析两个基因
在不同组织中的表达；利用 Real-time RT-PCR 检测
两个基因在 3 个发育时期果皮中的表达，从而为深
入了解 ERF 基因家族在梨树的功能提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
供 试 材 料‘砀 山 酥 梨 ’(Pyrus bretschneideri
‘Dangshansuli’)和‘锈酥’(‘Xiusu’)采自安徽省砀山
县园艺场。2013 年分别在花后 25 d、75 d 和 150 d
随机摘取果实各 10 个，分别切取果肉和 1 mm 厚
的果皮。果皮、果肉和叶片用液氮处理，混合均匀
后保存于 –80℃冰箱中。
1.2 药品、试剂和引物
RNA 提 取 试 剂 盒(StarSpin Plant RNA Mini
Kit)和 感 受 态 细 胞(DH5α Chemically Competent
Cells)购自 Genstar 公司，反转录酶(M-MLV Reverse
Transcriptase)、载体(pGEM®-T Easy Vector Systems I)、
PCR MIX (GoTaq® GreenMaster Mix)购自 Promega
公司。Real-time 试剂(PrimeScriptTM RT reagent Kit
with gDNA Eraser)和 SYBR® Premix Ex TaqTM II 购自
Taraka 公司。
表 1 试验所用引物
Table 1 Primers tested
引物 Primer 序列 Sequence (5′~3′)
ERF2-5F ATGTGTGGTGGTGCTATCATTTCCG
ERF2-5R ATCCAGCATCCACAGGTCCAAC
ERF2-R GTTACTATTAAACATAAACAC
ERF2-3F1 CTCTTCACCGCTTCCATCTCTG
ERF2-3F2 CTCAACCGAGTTTCCAGACC
ERF4-5F ATGGCGACTGCAGCTGCTCCGTCT
ERF4-5R ACTGCCGAAACCCGAACCTT
ERF4-R GCCTCTCTCTAATAATTTAA
ERF4-3F1 TCAACGCTCCCTCCGCCGCCC
ERF4-3F2 AGCGGCACTTCCACGAATGATAC
ERF2-BDL-F CCCTCTTCACCGCTTCCAT
ERF2-BDL-R GCTAGAACAATTCCGCTGCCT
ERF4-BDL-F CCAAGACCAACTTCCCTGCG
ERF4-BDL-R TATCCTCATACATCCGAAACG
YgERF2-F GAGTCAGGTGGTGAGTGGAAGC
YgERF2-R CAAACAGCACACGGTACACAAAC
YgERF4-F GGCGGTAATGCCACGGTC
YgERF4-R AACCAGCGATGAGAGGGAAA
3′-CDS AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTT-
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
UPM long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGT-
ATCAACGCAGAGT
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
Actin-F TGGTGTCATGGTTGGTATGG
Actin-R CAGGAGCAACACGAAGTTCA
1.3 基因克隆和测序
采 用 StarSpin Plant RNA Mini Kit 提 取‘砀 山
酥梨’和‘锈酥’的果皮 RNA，用 M-MLV Reverse
Transcriptase 反 转 录 酶，以 3′-CDS 为 引 物 合 成
cDNA，按说明书操作。根据‘砀山酥梨’和‘锈酥’
转录组中获得的两个 ERF 差异表达基因的片段，设
计 5′ 端特异性引物 ERF2-5F 和 ERF2-5R，ERF4-
5F 和 ERF4-5R，以果皮 cDNA 为模板进行 PCR 扩
增，PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析、回收，
第4期 381
连接到 pGEM-T 载体，将含有目标片段的阳性单
克隆送至深圳华大有限公司分别测序验证，得到
两个基因的 5′ 端序列。设计 3′ RACE 引物 ERF2-
3F1 和 ERF2-3F2，ERF4-3F1 和 ERF4-3F2，分 别
和 UPM long、NUP 进行巢式 PCR 扩增，克隆出两
个基因的 3′ 端序列。根据 5′ 端和 3′ 端的重叠序
列，利用 DNAMAN 软件进行拼接，从而获得 2 个
基因的全长序列。再根据两个基因 3′ 端序列设计
下游引物 ERF2-R 和 ERF4-R，结合 5′ 端上游引物
ERF2-5F 和 ERF4-5F 进行 PCR 扩增，验证拼接结
果。所得结果在 NCBI 上进行 BLAST 比对，利用
DNAMAN、BioEdit 等软件进行分析。
1.4 基因生物信息学分析
使用 Protparam 网站(http://web.expasy.org/prot-
param/)，预 测 PbERF2 和 PbERF4 两 个 基 因 编 码
蛋 白 的 理 化 性 质。 采 用 MEGA5.0 软 件 对 预 测
的 PbERF2 和 PbERF4 两个蛋白的氨基酸序列和
NCBI 已经登录 ERF 蛋白的氨基酸序列进行聚类
分析。
1.5 特异表达
分别提取‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后 150 d 的
果皮、果实和同时期叶片的总RNA，反转录第一链，
设 计 特 异 性 引 物 ERF2-BDL-F 和 ERF2-BDL-R，
ERF4BDL-F 和 ERF4-BDL-R，使用浓度一致的反
转录产物为模板，以梨 Actin 基因为内标，进行半定
量 RT-PCR。
1.6 基因表达分析
分别提取‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后 25 d、75 d
和 150 d 果皮的总 RNA，反转录第一链，设计特异
性 引 物 YgERF2-F 和 YgERF2-R，YgERF4-F 和
YgERF4-R，以梨 Actin 基因为内参，引物为 Actin-F
和 Actin-R，3 次重复。使用 STEPONE 荧光定量
PCR 仪进行定量分析，试剂采用 TaKaRa 公司的
SYBR® Premix Ex Taq™ II，按照试剂说明书进行
操作。
2 结果和分析
2.1 ERF基因全长的克隆
根据‘砀山酥梨’和‘锈酥’转录组中获得的两
个 ERF 差异表达基因的片段，设计 5′ 端特异性引
物 ERF2-5F 和 ERF2-5R，ERF4-5F 和 ERF4-5R，
以果皮 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，PCR 产物
经 1% 琼脂糖凝胶电泳分析、回收，连接到 pGEM-T
载体，将含有目标片段的阳性单克隆送至深圳华大
有限公司分别测序验证，得到两个基因的 5′ 端序
列。 设 计 3′ RACE 引 物 ERF2-3F1 和 ERF2-3F2，
ERF4-3F1 和 ERF4-3F2，分 别 和 UPM long、NUP
进行巢式 PCR 扩增，克隆出两个基因的 3′ 端序列。
其中 1 个基因的 5′ 端和 3′ 端分别有 765 bp (图 1: A)
和 482 bp (图 1: B)核苷酸，通过拼接得到 1020 bp 的
全长 cDNA 序列(图 3)，其中开放阅读框为 816 bp，3′
端非编码区长 204 bp，命名为 PbERF2，GenBank
图 1 PbERF2 基因的 PCR 扩增。A: 5′ RACE; B: 3′ RACE; C: 全长
序列验证； M: DNA Marker。
Fig. 1 PCR amplification of PbERF2. A: 5′ RACE; B: 3′ RACE; C:
Verification of full length sequence; M: DNA Marker.
图 2 PbERF4 基因的 PCR 扩增。A: 5′ RACE; B: 3′ RACE; C: 全长
序列验证； M: DNA Marker。
Fig. 2 PCR amplification of PbERF4. A: 5′ RACE; B: 3′ RACE; C:
Verification of full length sequence; M: DNA Marker.
王孟东等：‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达分析
382 第23卷热带亚热带植物学报
图 4 PbERF4 的核苷酸序列和推测的氨基酸序列。ATG: 起始密码子 ; TGA: 终止密码子。
Fig. 4 cDNA sequence of PbERF4 and deduced amino acid sequence. ATG: Start codon; TGA: Stop codon.
列构成与拼接结果一致。测序结果表明，‘锈酥’果
皮中 PbERF2 和 PbERF4 的 cDNA 序列与‘砀山酥
梨’的无差异。
2.2 生物信息学分析
编码蛋白的理化性质　　用 Protparam 预测
PbERF2 和 PbERF4 编 码 蛋 白 的 理 化 性 质，推 测
图 3 PbERF2 的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。ATG: 起始密码子； TAA: 终止密码子。
Fig. 3 cDNA sequence of PbERF2 and deduced amino acid sequence. ATG: Start codon; TAA: Stop codon.
登录号为 KJ623716，其全长验证片段长 983 bp (图
1: C)，序列构成与拼接结果一致。另 1 个基因的
5′ 端 和 3′ 端 分 别 有 462 bp (图 2: A)和 450 bp (图
2: B) 核苷酸，拼接后得到 780 bp 的全长 cDNA 序
列(图 4)，其中开放阅读框为 537 bp，3′ 端非编码
区长 243 bp，命名为 PbERF4，GenBank 登录号为
KJ623718，其全长验证片段长 748 bp (图 2：C)，序
第4期 383
图 5 PbERF2 和 PbERF4 与其他植物 ERF 蛋白的系统进化树。分支节点上的数值为自举支持率。EjERF: 枇杷； MdERF: 苹果； AdERF: 猕猴桃；
LeERF: 番茄； AtERF: 拟南芥； CsERF: 黄瓜； ZmERF: 玉米； StERF: 马铃薯； CaERF: 咖啡树； NtERF: 烟草； PbERF: 白梨； DkERF: 柿。
Fig. 5 Phylogenetic tree of PbERF2 and PbERF4 with ERF proteins in other plants. Data upon branch nodes are bootstrap. EjERF: Eriobotrya
japonica; MdERF: Malus x domestica; AdERF: Actinidia deliciosa; LeERF: Lycopersicum esculentum; AtERF: Arabidopsis thaliala; CsERF: Cucumis
sativus; ZmERF: Zea mays; StERF: Solanum tuberosum; CaERF: Coffea arabica; NtERF: Nicotiana tabacum; PbERF: Pyrus bretschneideri; DkERF:
Diospyros kaki.
王孟东等：‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达分析
两 个 蛋 白 的 分 子 式 分 别 为 C1320H2078N374O405S5 和
C831H1301N247O247S3，相 对 分 子 质 量 分 别 为 29827.5
和 18800.1，等电点分别为 7.71 和 9.76。理论推导
半衰期均大于 10 h，不稳定参数分别为 41.57 和
43.83，两个蛋白均属于不稳定蛋白。总的带负电荷
的残基(Asp+Glu)分别为 35 和 15，总的带正电荷
的残基(Arg+Lys)分别为 36 和 19。亲水指数分别
为 –0.609 和 –0.349，预测均为水溶性蛋白。
系 统 进 化 分 析　　 利 用 MEGA5.0 软 件 的
Neighbor-Joining 方法，将 PbERF2 和 PbERF4 蛋白
与 GenBank 中已经登录的其他物种 ERF 蛋白进行
系统进化树分析。从图 5 可看出，PbERF2 与枇
杷(Eriobotrya japonica)的 EjERF1 亲缘关系较近，
PbERF4 则是与黄瓜(Cucumis sativus)的 CsERF1 比
较接近。
2.3 基因的组织特异性表达
从图 6 可见，PbERF2 和 PbERF4 在叶片中几
乎不表达，果皮中的表达量高于果肉，且‘锈酥’两
个基因的表达量都高于‘砀山酥梨’。
图 6 PbERF2 和 PbERF4 基因在不同组织中的表达。a~c: ‘砀山酥
梨’； d~f: ‘锈酥’； a,d: 叶片； b,e: 果肉； c,f: 果皮。
Fig. 6 Expressions of PbERF2 and PbERF4 in different tissues. a–c:
‘Dangshansuli’; d–f: ‘Xiusu’; a,d: Leaf; b,e: Sarcocarp; c,f: Pericarp.
384 第23卷热带亚热带植物学报
图 7 PbERF2 和 PbERF4 基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中的表达。柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Fig. 7 Expression of PbERF2 and PbERF4 in pericarp of ‘Dangshansuli’ and ‘Xiusu’. Different letters above column indicate significant difference
at 0.05 level.
2.4 基因的定量表达分析
荧光定量 PCR 结果表明，PbERF2 和 PbERF4
基因在‘砀山酥梨’和‘锈酥’花后 3 个时期果皮中
的表达存在差异。‘锈酥’3 个时期果皮中 PbERF2
和 PbERF4 的表达量均显著高于‘砀山酥梨’, 且随
发育的进程，两个基因的表达规律均为先升高后降
低(图 7)。
3 讨论
ERF 转录因子是仅存在于高等植物中的一
类大基因家族，最早是作为 GCC-box 结合蛋白从
烟草中分离得到的[13]。Tang 等把辣椒(Capsicum
annuum)的 CaPF1 转入东部白松(Pinus strobus)基
因组后发现该植株对干旱等逆境的耐受性明显增
加[14]；陆地棉(Gossypium hirsutum)的 ERF 亚家族中
GhERF4、 GhERF2、 GhERF3、 GhERF6 和 GhERF1
在响应盐、低温和干旱胁迫及受乙烯和 ABA 处理
后，能一定程度提高抗非生物逆境的能力[15–16]。烟
草的 TERF2 通过乙烯信号途径来调控对低温胁迫
的抗性[10]，过量表达 TERF2 或 JERF3 的转基因植
株中活性氧水平显著下降，从而提高了对低温胁迫
的耐受力[17–19]，烟草过表达 GmERF3 后，组织的可
溶性糖和脯氨酸等渗透保护物的含量提高，植株不
但表现出显著增强的抗旱耐盐能力，而且对某些病
虫害等生物胁迫的抵抗力也有提升[11]。
本 研 究 克 隆 的 PbERF2 和 PbERF4，经 比 对
及聚类分析确定为 ERF 家族基因，半定量显示
PbERF2 和 PbERF4 在果肉和果皮中均有表达，而
叶片中几乎不表达，表明这两个基因的表达具有一
定的组织特异性，在不同器官中可能发挥不同作
用。‘锈酥’果皮 3 个发育时期 PbERF2 和 PbERF4
的表达量均显著高于‘砀山酥梨’，且均呈现先升
高 后 降 低 的 趋 势，说 明 PbERF2 和 PbERF4 在 梨
果皮中发挥协同作用。PbERF2 与枇杷(Eriobotrya
japonica)的 EjERF1 同源性较高，EjERF1 受低温
胁迫诱导，在低温贮藏过程中果实 EjERF1 的转录
本丰度呈增加的趋势[20]；PbERF4 与黄瓜(Cucumis
sativus)的 CsERF1 高度同源，淹涝条件下 CsERF1
表达量明显上升，且乙烯利预处理可促进淹涝条件
下 CsERF1 的表达[21]。推测 PbERF2 和 PbERF4 在
梨中也参与抗逆过程，但其作用机理还有待于进一
步研究。
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王孟东等：‘砀山酥梨’褐皮芽变中两个ERF基因的克隆与表达分析