全 文 ：核 农 学 报 , 一
通少 助 。 油 “考吹孙如
玉米组蛋白 和 、 基因的克隆
欧阳研 敖光明
北京农业大学生物学院 北京
本 文 以 入 为克隆载体 , 构 建 了玉 术 。。 二 少 基 囚 组 文库 , 通过
人工 合成的探针进行原位杂 交和斑 点杂 交 , 从 文库中筛选到州、含有组蛋 白 。基因
的阳 性克隆 。 另外 , 通过 多聚酶涟式反应 , 从 玉 米核 中 扩增 了组蛋 白
‘ 墓囚 。 这 些基因可 以 在转基因植物研 完中作为辅 助 序列 提 高外源基因 的整合频
率 舀
关键词 玉术 组蛋 白基 因 多聚晦链式 反应
一
基 囚组 文库
前 言
组蛋 白 是染色质的重要构成成分 , 广泛存在于真核生物中 。 按其氨基 酸 的
组成不 同 , 分力 ,
、 ‘ 、 、 和 五类 〔‘ 。 其中 和 、的保守性 最强 , 物种之
间差别甚小
。
组蛋 白基 因与 相似
,
显示出一科有序重复排列的基囚簇结构 , 属多拷贝基因 〔 」。
植物 ,扣也有报道组蛋 自基囚处于连锁状 态 〔“ 一 “ 〕。 但足 随着生物进化 程 度的提高 组蛋 白基
因的排列方式表现出多样性和 复杂性 。 组蛋 白基因一般不含内含子 。 虽然也发现
有 内含子的报道 〔竺’, 但不是 普遍现 象
。 组蛋 白基 因的转录 产物 人 , 迄今除发现酵母 的
‘ 有 了 外 〔 ” , 是唯一不含 的真核生物 。
吴瑞认为组蛋 白基因作为 目的基因的辅助序列 , 可 以提高转化频率 〔“ 」。 基于此种设想 ,
我们克隆和扩增了玉米组蛋 白 和 ‘基因
, 以作外源基因导 入植物的辅助序列之用 。
材 料 与 方 法
’
材料 试验用菌利 、
、 。 、 。 。、
万 切 等来 自术实验室
。 玉米品种 由北京农业大学农学系提供 。
方法 总 的提取 参照曾以 申〔吕 、 陶金洲 〔“ 」等的方法进行 。 取 玉 米幼苗 在液
抓中磨碎 , 力」 缓冲液 一 一 、
、 , 。
。
·
蛋 白酶 在 ℃下保温 后加 至终浓度达 , 再在 ℃下保温 。
以 。。。 离心 , 取上清掖用氯仿 异戊醇 、 抽提 次 , 加 倍 休 积 乙醇 , 用
玻璃棒搅 出丝状沉淀 。 沉淀溶于无菌水中
, 再加 乙醇用玻璃棒搅 出沉淀
,
如此重复 一 次至
此文于 引 年明 旧 收到
玉米组蛋白 和 ‘基因的克隆
液相清澈为止 。 将此沉淀离心后 冷冻干燥 , 溶于 无菌水中 , 于 ℃保存待用 。
一 片段的制备 按 《 分子克隆手册 》 ’‘ 。 所述方法进行 。
载体的制备 的提取基本按 〔‘ ’ 」
、 ‘ “ 等的方法进行
,
稍
有修改 , 取过夜培养的 悬 浮 液 , 加 噬 菌体悬 浮 液
效价 和 预热至 ℃的 培荞液 含 , 在 下 静 置 后
连续振 荡 一
, 至菌液呈半适明并有丝状沉淀物 产 生
。
在 ℃下 离心 ,
取 上清 液并加 至 的浓度 , 加 至终浓度 。 在 ℃下放置 后
离心 , 除去上清 液 , 并用滤纸吸尽残液
。 将沉淀溶于 溶液
、
、 一 , 、 ‘ , “ ‘力 和 至终
浓度各为 坦 ℃下保温 , 再加蛋 白酶 至
、
。 一 , 于 盯 ℃保 温 后用酚抽
提 次 , 用氯仿 异戊醇 , 再抽提 次
, 乙醇沉淀 , 冷冻干燥后溶于 无菌水中
。 川
和 工将 切 出左右臂
。
包装蛋 白的提取
,
按 等 〔‘ 。 ’的方法进行 。
连接反应 载体和 片段按不 同重量 比进行连接 根据包装后产 生噬 菌斑的多少确
定 合适的比例后 进行大量连接
。 大量连 接的反应休系为 时 溶液 , 时 缓冲
液 一 , , , ,
· 、
‘连接酶 , 总反应休积为 时 , 于 ℃下反应 玩
,
体外包装 从 一 ℃取出包装蛋 白 , 在冰浴 中缓慢溶化
, 溶解后加到尚未溶解的超声 波
提 取物 中 用毛细管轻轻搅拌均匀 , 待完全溶解后力入 连接好的 , 混合后室温下静置
, 再加 时 溶液和 滴氯仿 , 稍加振荡后 离心 除去细胞碎片
‘
取 适 量 上清液加 到
件 式 新鲜菌液中 , ℃一 ·
’
培养 后
·
力
一
终 ℃的琼脂 , 丰魂平 板于 ℃
培养 。
探针的制 备 由本室合成含 个核普酸的寡聚物 , 技华美生物技木公司所编文献 〔‘“ 的
反应条件进行“ “ 末端标记作为探针 。
原位和斑
创
点杂交 原位杂交按 等 〔‘ “ 」的方法进行 。 斑 执杂交按 仁‘ 」的
方法进行 。
多聚酶链式反应 由本室合成 个核着酸组成的
、 并与 ‘基 因两端 互补的片
段作为引物 , ’以核 片段为模板进行 ‘ 基因的体外扩增 。 反应条 件内 在‘
·
离
心管中依 次加入无菌水落 卜
、 “ 引物 各 林 约 卜
、
模板
人 协 约 林
、
酶反应缓冲液 卜 、
’
石蜡油 林 , 总体积 卜
下处理 后加 入 酶 , 按 矛” ℃ 的顺序循环反
应 个周期 , 在 ℃处理 停止反应
, 于 ℃保存待用 。
结 果 与 讨 论
一 玉米总 。 的提取
本实 验中采用 法和 曾以 申法〔‘ ’提取总 的 结 果 相 似
,
一
长度 大于 入 ,
。 ’。 。。 氏 卿 。一
, 紫外吸收 曲线呈 典型核酸吸 收 峰 , 纯 度 达
到要求 图
。
前者操作简便
、
, 并且 分子大小较集中
, 但是得率低 , 除去 费时
费力 后者得率高
,
’
得到 后不必进行后处理 , 可 直接用于都分酶解 , 但 条带拖尾
核 农 学 报 卷
一 一官一 一一 一 , 喇 , 州 , , , 卜户尸 , 口十
。
。
。
钱 货
图 玉米 的紫外吸收曲线 一 。。
己
图版 的酶切 图谱
〕
一 、 ‘、 入 ” 入
较长 , 需多次用酒精沉淀 。
二 一 片段的获得
玉米总 经 部分酶解 , 大多数 片 段 都
在 一 之间
。
三 载体的制备
本实验 中以 悬浮噬菌体后 再 和 , 比其他方法 ‘“ , ’丢 在 细 菌 裂解后
再加上述两种酶节省酶量 , 并 且反应更好
。 用 沉淀噬菌体后 , 彻底 除 净管壁的 残
留液是 非常重要的一步 。 否则会影 响以后 的酶切反应
。
在 的 提 取中 , 以 蛋 白酶 处
理并结合酚 氯仿抽提 , 比超速离心纯化噬菌体或 的方法 简便
一
可以得到理想的酶切效
果 图版 。
四 连接
、
包装和里组噬菌体数的侧定
根据载体与目的片段重量比所得噬菌斑数的实验结果 表 表明 , 载 体 与目的片段以
表 截体与 目的片段皿且 比对连接效果的影晌二
载体 目的
每平皿 的噬菌斑数
重量比效果最好 。 本实验中所得 文库为
, 所用 公式 一 一
〔’‘ ’ 基因组为‘
· ““ 。‘“
。 式中 , ”为希望获得的概率 , ‘为 单个重 黔在基 因 组内所 占百分率 , 为必须得到的重组休数 目 随机取噬菌斑酶切得到的插 产、片段长度平均
为 来计算 , 要得到复盖整个基因组的概率为 纬时 , 文库 只需要 “ , 因此构
硼 里米组蛋白 。和 基因的克隆 艺
,
。
。
。
尸一、一
。 「弓
图版 互 反应合成的 基因
皿 ‘
入 ” , 一
图版皿 部 分重 组子的 电泳结果
班
一。 一
建的文库 已满足要求 。
五 原位杂交和斑点杂交
经两次原位杂交得到 个阳医克隆
, 进一步斑点杂交得到 个阳性克隆 。
六 采用 技术扩增组蛋 白 ‘基 因
经过 个多聚酶链式反应周期后 , 取一 部 分反应液进行琼脂情凝胶 电泳 , 在约 。。 处出
现 条明显的带 , 与 ‘ 基 因大小相符 图版
。 此外 , 在 。。 处还出现 条带 , 可 能是 两
个引物并非完全特异 , 在染 色体组 中还有其它 互 补之处 , 由非特异扩
‘
增 造成
。
扩增
出来的 ‘基因经末端补齐与 的 切 点 平 端 连 接 后 , 转 化 叮
,
在 一 和
卜 琼脂板上筛选
, 白色菌落经水煮法提取出质粒 , 电泳结 果 图版 表明
, ‘片段 已
插入 中 。
参 考 文 献
〔 〕 , , 耳 ,
〔 〕敖光明译 发育和基因 。 科技出版社 , 。
〔 〕 考, , ,
, 二 , , 一
〔 〕 , 亡 亡 ,
‘ 。 , , 一。 一 峪
〔 〕吴声程等 水稻组蛋 白 基因的分离和组织结构分 析
。
遗传学报 , , 一
。
〔 〕 , 一 夕 , 优 少 夕人。 翻川
已 , 一 , 了
〔了〕 , 二 , , ,
儿 一
泥 扭 刁 爪 油 纽已 昌认介‘
。。 一
〔幻 曾以申 几种植物 的纯化及其某些性质 。 生物化学与生物物理学报 , , 一 。
的 陶金洲等 水稻基因文库的构建 。 生物工程学报 , , 一
〔一。〕 , , ,
〕 , 一 。
, ,
〔一 〕 , ,
一
〔 〕华美生物工程公司 现代分子生物学研究技术
〔 〕 , , ,
一生 。 、
, , 一 一
。
,
血
。夕 ‘ 夕 , 夕 落。之‘ 。泣 ‘ , 。夕
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