全 文 ：收稿日期： 2012–11–26　　　　接受日期： 2013–03–26
基金项目： 四川省应用基础研究项目(2012JY0107); 四川省科技条件平台项目资助。
作者简介： 秦小波，博士，主要从事植物资源与植物功能成分研究。
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: qxb_2003@163.com
热带亚热带植物学报　2013， 21(4)： 315~322
Journal of Tropical and Subtropical Botany
利用AFLP分析西南特色猕猴桃的遗传多样性
秦小波1,2,3*, 高继海3,4
(1. 四川省自然资源科学研究院，成都 610015; 2. 四川省生物资源保护与可持续利用实验室，成都 610015; 3. 四川大学生命科学学院，成都
610064; 4. 成都中医药大学药学院，成都 610075)
摘要： 为分析西南地区特色猕猴桃(Actinidia Lindl.)的遗传多样性，建立并优化了猕猴桃 DNA 多态性分析的 AFLP 体系，
AFLP 标记体系为 300 ng 基因组 DNA 用 EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ (15 U/5 U)于 37℃下酶切 2 h，加接头后的混合物稀释 5 倍用于预扩
增，预扩增产物再稀释 10 倍后进行选择性扩增。结果表明，筛选的 22 对引物进行扩增反应，共得到 979 条条带，其中多态性
条带为 649 条。采用优化的 AFLP 体系，对西南地区的 10 种猕猴桃 50 个样本进行了遗传多样性分析，包括普通品种中华猕猴
桃、美味猕猴桃，及特色品种硬毛猕猴桃、毛被猕猴桃、革叶猕猴桃、四萼猕猴桃、狗枣猕猴桃、葛枣猕猴桃、京梨猕猴桃和紫果
猕猴，结果表明种内和种间的聚类关系明显；斑果组(sect. Maculatae)和净果组(sect. Leiocarpae)的种间有聚类交叉，并呈现地理
区域性分布。
关键词： 猕猴桃； AFLP； 遗传多态性； 西南地区； 地理区域性
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.04.004
Studies on Genetic Diversity for Specialty Kiwifruits from Southwestern
Regions of China Using AFLP System
QIN Xiao-bo1,2,3*, GAO Ji-hai3,4
(1. Sichuan Academy of Natural Resource Sciences, Chengdu 610015, China; 2. Sichuan Provincial Laboratory for Natural Resources Protection and
Sustainable Utilization, Chengdu 610015, China; 3. College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 4. Chengdu University of
Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China)
Abstract: In order to understand the genetic diversity of kiwifruits in southwest of China, AFLP system for
kiwifruits was optimized. The optimum AFLP system was constructed as following: 300 ng DNA was digested
with EcoR I/Mse I (15 U/5 U) at 37℃ for 2 h, diluted by 5-fold after ligating with adaptors for the pre-
amplification, and then the production of pre-amplification diluted 10-fold was used for selective amplification.
The results showed that 979 electrophoretic bands were identified totally, of which 649 bands were polymorphic
by using 22 pairs of primers. The genetic diversity of ten kiwifruit species, including Actinidia chinensis, A.
deliciosa, A. chinensis var. hispida, A. venosa fo. pudescens, A. rubricaulis var. coriacea, A. tetramera, A.
kolomikta, A. ploygama, A. callosa var. henryi and A. arguta var. purpurea, from southwestern China, were
analysis by using the optimum AFLP system. The results indicated that there were obvious clustering relationship
among intraspecific and interspecific, and cross cluster existed in species between sect. Maculatae and sect.
Leiocarpae, related to geographic regional distribution.
Key words: Kiwifruit; AFLP; Genetic diversity; Southwestern China; Geographic region
316 第21卷热带亚热带植物学报
猕 猴 桃 属(Actinidia Lindl.)隶 属 于 猕 猴 桃 科
(Actinidiaceae)多年生藤本植物，是一种重要的水果
资源。全世界现有猕猴桃属植物 66 种，其中 62 种
原产于中国[1–3]，并在我国广泛分布。然而我国的猕
猴桃分布类群比较复杂，种间的品质也参差不齐，
差异性很大，因此猕猴桃种间亲缘关系的鉴定工作
尤为重要[4–5]。
扩增片段长度多态性(Amplified fragment length
polymorphism, AFLP)是 一 项 新 的 DNA 指 纹 技
术，它结合了 Random Amplified Polymorphic DNA
(RFLP)和 Polymerase Chain Reaction (PCR)技术的
特点，具有 RFLP 技术的可靠性和 PCR 技术的高
效性，不受环境季节条件的限制，具有反应灵敏、快
速高效、指纹多态性丰富、重复性好等优点[6]。目
前，AFLP 技 术 在 柑 橘(Citrus sp.)[7–8]、葡 萄(Vitis
vinifera)[9–10]、苹果(Malus pumila)[11–12]等果树的研究
上均有应用，对猕猴桃的 AFLP 分析也有报道，如
徐小彪[13]对猕猴桃属植物的遗传多样性及种质超
低温保存进行了研究。我国的西南地区，特别是四
川地区是我国猕猴桃的重要产区，有多种优良品种
种植，然而有关该地区猕猴桃类群分布与遗传多态
性的研究还未见报道。
本研究在优化以往 AFLP 操作的基础上，构建
了一套针对西南地区猕猴桃遗传进化关系研究的
流程，并以 10 种特色猕猴桃为材料进行了验证，获
得了比以往更丰富的多态性位点条带，为四川地区
猕猴桃遗传多态性的保存以及猕猴桃优良品种的
筛选奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
野生的猕猴桃叶片采自四川、云南和贵州省，
共 10 种猕猴桃 50 个种质材料(表 1)：中华猕猴桃
(Actinidia chinensis Planch)、美味猕猴桃(A. deliciosa
var. deliciosa)、硬毛猕猴桃(A. chinensis Planch. var.
hispida)、毛被猕猴桃(A. venosa Rehd. fo. pudescens
Li)、革叶猕猴桃(A. rubricaulis Dunn var. coriacea)、
四萼猕猴桃(A. tetramera Maxim.)、狗枣猕猴桃[A.
kolomikta (Maxim. et Rupr.) Maxim.]、葛枣猕猴桃[A.
polygama (Sieb. et Zucc.) Maxim.]、京 梨 猕 猴 桃(A.
callosa Lindl. var. henryi Maxim.)和紫果猕猴桃[A.
arguta (Sieb. et Zucc.) Planch.]。猕猴桃嫩叶采摘后
立即液氮冻存、备用。
1.2 基因组DNA的提取
按 照 天 根 公 司 DNAsecure Plant Kit (DP320)
试剂盒说明书的方法提取猕猴桃叶片基因组总
DNA。使用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 样品
的质量与浓度，用分光光度计测定 260 nm 和 280 nm
波长下的吸光值 A260 和 A280。
1.3 双酶切程序优化
AFLP 技术对模板浓度不敏感，一定范围内都
能得到理想的结果[14]，为保障试验效果，同时节约
材料，DNA 模板用量以 300 ng 为宜。
选用 EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ两种限制性内切酶(Biolabs)
表 1 西南地区特色猕猴桃材料
Table 1 Specialty Actinidia samples from southwest China
序号 No. 编号 Code 来源地 Origin 经度 Longitude (E) 纬度 Latitude (N) 海拔 Altitude (m)
中华猕猴桃 Actinidia chinensis
1 ACC-1 峨眉山 Mount. Emei 29.58 103.31 2335
2 ACC-2 绵阳 Mianyang 31.82 104.55 1529
3 ACC-3 雅安 Ya’an 29.98 102.87 1701
4 ACC-4 德阳什邡 Shifang, Deyang 31.12 104.17 1439
5 ACC-5 重庆武隆 Wulong, Chongqing 29.21 107.66 1713
6 ACC-6 贵阳息烽 Xifeng, Guiyang 27.15 106.71 1762
7 ACC-7 广元青川 Qingchuan, Guangyuan 32.44 105.73 1433
8 ACC-8 凉山会理 Huili, Liangshan 26.59 102.24 1354
美味猕猴桃 Actinidia deliciosa var. deliciosa
9 ADD-1 峨眉山 Mount. Emei 29.58 103.27 1506
10 ADD-2 重庆巫山 Wushan, Chongqing 31.04 109.98 1799
11 ADD-3 峨眉山 Mount. Emei 29.57 103.28 1621
第4期 317
序号 No. 编号 Code 来源地 Origin 经度 Longitude (E) 纬度 Latitude (N) 海拔 Altitude (m)
12 ADD-4 六盘水水城 Shuicheng, Liupanshui 26.39 105.06 1844
13 ADD-5 铜仁江口 Jiangkou, Tongren 27.76 108.33 1275
14 ADD-6 绵阳北川 Beichuan, Mianyang 31.59 104.35 1558
15 ADD-7 铜仁江口 Jiangkou, Tongren 27.73 108.30 1581
16 ADD-8 云南昭通 Zhaotong, Yunnan 27.23 103.75 1907
硬毛猕猴桃 Actinidia chinensis var. hispida
17 ACP-1 重庆奉节 Fengjie, Chongqing 30.98 109.47 1834
18 ACP-2 巴中通江 Tongjiang, Bazhong 31.71 107.16 1648
19 ACP-3 重庆城口 Chengkou, Chongqing 31.93 108.98 1816
20 ACP-4 峨眉山 Mount. Emei 29.57 103.32 1944
21 ACP-5 绵阳北川 Beichuan, Mianyang 31.81 104.44 1482
22 ACP-6 重庆武隆 Wulong, Chongqing 29.24 107.86 1699
23 ACP-7 攀枝花盐边 Yanbian, Panzhihua 26.73 101.55 1816
革叶猕猴桃 Actinidia rubricaulis var. coriacea
24 ARD-1 雅安石棉 Shimian, Ya’an 29.25 102.31 1233
25 ARD-2 贵阳息烽 Xifeng, Guiyang 27.14 106.73 1788
26 ARD-3 云南曲靖 Qujing, Yunnan 25.98 104.23 1138
毛被猕猴桃 Actinidia venosa fo. pudescens
27 AVR-1 重庆城口 Chengkou, Chongqing 31.87 109.96 1822
28 AVR-2 云南雷山 Leishan, Yunnan 26.31 108.07 1601
29 AVR-3 铜仁江口 Jiangkou, Tongren 27.71 108.32 1233
30 AVR-4 峨眉山 Mount. Emei 29.59 103.25 1744
四萼猕猴桃 Actinidia tetramera
31 AT-1 峨眉山 Mount. Emei 29.63 103.24 1611
32 AT-2 重庆巫山 Wushan, Chongqing 31.06 109.98 1831
狗枣猕猴桃 Actinidia kolomikta
33 AK-1 乐山峨边 Ebian, Leshan 29.29 103.05 1725
34 AK-2 攀枝花盐边 Yanbian, Panzhihua 26.78 101.52 1837
35 AK-3 凉山会理 Huili, Liangshan 26.56 102.29 1748
36 AK-4 雅安汉源 Hanyuan, Ya’an 29.33 102.73 1600
37 AK-5 丽江永胜 Yongshen, Lijiang 26.66 100.80 1652
38 AK-6 云南丽江 Lijiang, Yunnan 27.15 100.98 1874
葛枣猕猴桃 Actinidia polygama
39 AP-1 都江堰 Dujiangyan 30.95 103.59 1681
40 AP-2 重庆武胜 Wusheng, Chongqing 30.36 106.34 1834
京梨猕猴桃 Actinidia callosa var. henryi
41 AC-1 铜仁江口 Jiangkou, Tongren 27.84 108.77 2300
42 AC-2 遵义桐梓 Tongzi, Zunyi 28.25 106.82 2571
43 AC-3 重庆武隆 Wulong, Chongqing 29.27 107.83 1994
44 AC-4 峨眉山 Mount. Emei 29.62 103.24 1765
45 AC-5 遵义务川 Wuchuan, Zunyi 28.55 107.86 2398
紫果猕猴桃 Actinidia arguta
46 AA-1 昭通镇雄 Zhenxiong, Zhaotong 27.53 107.76 2361
47 AA-2 贵州罗甸 Luodian, Guizhou 25.61 106.64 2219
48 AA-3 曲靖会泽 Huize, Qujing 25.97 103.31 1936
49 AA-4 云南丽江 Lijiang, Yunnan 27.10 100.91 1828
50 AA-5 峨眉山 Mount. Emei 29.6 103.23 1781
续表(Continued)
秦小波等：利用AFLP分析西南特色猕猴桃的遗传多样性
318 第21卷热带亚热带植物学报
在 37℃下分别水浴 2 h、4 h、8 h 和 12 h，酶切体
系为： DNA 300 ng、EcoR I 15 U、Mse I 5 U、 100 ×
BSA 0.2 μL、2.0 μL 10 × NEB buffer 4，加水至 20 μL。
酶切产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，以猕猴桃
基因组能够完全消化并且在琼脂糖凝胶上分布均
匀为最佳效果。酶切后的混合液经 65℃水浴 10 min
后用 T4 DNA Ligase (TaKaRa)于 16℃连接接头过
夜，连接体系为： 酶切液 20.0 μL、 Mse I 接头(50 pm μL–1)
0.5 μL、 EcoR I 接 头(33 pm μL–1) 0.2 μL、T4 DNA
ligase (350 U μL–1) 1.2 μL、T4 ligase buffer 2.5 μL，
加水至25.0 μL。接头核苷酸为 Invitrogen公司合成，
序列见表 2。
表 2 使用的接头序列与预扩增引物
Table 2 Ligation sequences and pre-amplification primers
引物 Primer 序列 Sequence
接头 Adaptor
Mse Ⅰ 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′
3′-TACTCAGGACTCAT-5′
EcoR Ⅰ 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′
3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′
预扩增引物 Pre-primer
Pre-Mse Ⅰ 5′-GATGAGTCCTGAGTAAN-3′
Pre-EcoR Ⅰ 5′-GACTGCGTACCAATTCN-3′
1.4 预扩增程序优化
连接产物分别稀释 5、10、20 和 30 倍后做预
扩增 PCR。预扩增反应体系包含：稀释后的连接产
物 1 μL、预扩增引物各 1 μL、dNTP (2.5 mmol L–1)
2.0 μL、10 × PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶
0.3 μL，加水至 25 μL。PCR 反应程序为：94℃ 2 min；
然后 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，共 30 个循环；
最后 72℃延伸 5 min。预扩增引物序列见表 1。取
5 μL 预扩增产物经 1.0% 的琼脂糖凝胶检测，以出
现分布均匀且亮度合适的条带为佳。
1.5 选择性扩增引物优化
从 256 个引物对组合中筛选最佳的引物对。
PCR 扩增体系与预扩增反应体系相同，PCR 反应
程序为：94℃ 2 min；然后 94℃ 30 s，65℃ 30 s (每
个循环退火温度降低 0.7℃ )，72℃ 80 s, 共 12 个
循环；接着 94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s, 共 23
个循环；最后 72℃延伸 5 min。用变性聚丙烯酰胺
凝胶法对选择性扩增样品进行分析，采用银染法显
色[15]。以分辨率清晰并大于 50 bp 的条带为可用条
带进行统计。
本研究选择 10 种猕猴桃共 50 个种质材料，
使用等量混合 DNA 样品与硬毛猕猴桃 DNA 的
AFLP 结果进行比对，筛选出总条带数不小于 40
条，并且差异带条数不小于 20 条的引物对为最佳
引物组合，所有优化试验进行 3 次重复。
1.6 西南地区特色猕猴桃的遗传关系分析
西南地区 10 种特色猕猴桃共 50 个种质材料，
使用优化的双酶切、预扩增和选择性扩增体系进
行 AFLP 标记；根据变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，
按条带的有(记为 1)和无(记为 0)进行数据统计，
在 Excel 表格中建立谱带数据矩阵；使用 Jaccared
方法计算各材料间的遗传相似系数(GS)，并利用
NTSYS-PC 软件分析样品间的遗传关系[9]。
2 结果和分析
2.1 猕猴桃基因组DNA提取
提取高质量的猕猴桃 DNA 是进行 AFLP 标记
成功的前提，AFLP 标记对 DNA 分子的完整性和
纯度有严格要求。使用天根公司试剂盒提取 10 种
猕猴桃的基因组 DNA。从图 1 可见，经 1.0% 琼脂
糖凝胶电泳检测，所得的 DNA 完整，没有杂带；分
光光度计测定 260 nm 和 280 nm 的吸光值，A260 /
A280 约为 1.85 ~ 1.93，表明这些 DNA 样品的纯度
较好，可用于后续试验。
2.2 酶切时间的优化
酶切时间的长短影响模板 DNA 能否剪切充
分。使用 300 ng 猕猴桃 DNA 和 EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ
(15 U/5 U)双酶切体系，在 37℃下水浴 2 ~ 12 h，
经琼脂糖凝胶电泳检测，猕猴桃基因组 DNA 酶切
2 h 以上均可得到弥散的抹带状酶切产物，产物主
要集中在 500 ~ 1500 bp，说明酶切充分、正常，能满
足后续试验要求(图 2)。因此，采用 EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ
(15 U/5 U)于 37℃水浴 2 h 作为猕猴桃双酶切试验
的最适时间。
2.3 预扩增稀释倍数的优化
将酶切产物与接头连接后分别稀释 5、10、20
第4期 319
图 1 猕猴桃的 DNA 检测。M：AL 2000 DNA marker；1 ~ 23：猕猴桃 DNA 样品。
Fig. 1 Detection of kiwifruit DNA. M: AL 2000 DNA marker; 1 – 23: DNA samples of kiwifruit.
和 30 倍进行 PCR 预扩增优化试验。如图 3 所示，
各稀释倍数的模板都获得了比较稳定的涂抹状条
带，但 5 倍稀释下得到的猕猴桃 PCR 预扩增条带
分布最均匀、不同大小片段处的浓度也最均衡。虽
然 AFLP 对 DNA 的浓度要求不严格，但低于 10 ~
12 g μL–1 时得到的 AFLP 指纹样式往往不可靠[22]，
因此确定 PCR 预扩增的最适模板浓度为 5 倍稀释
的连接产物。
2.4 选择性扩增引物的优化
以往在猕猴桃的 AFLP 多态性分析时没有对
全部选择性扩增引物组合(256 对)进行优化，只做
秦小波等：利用AFLP分析西南特色猕猴桃的遗传多样性
了部分(64 对)引物筛选，并最终只有 4 ~ 8 对引物
用于正式实验[16–17]。为避免引物组合和条带统计
数目的不足而引起的多态性结果的不稳定和误差，
本研究使用西南地区猕猴桃的 256 对选择性扩增
引物组合(16 × 16)进行了优化试验，最终筛选出 22
对选择性扩增引物组合适宜西南地区猕猴桃 AFLP
多态性分析(表 3)。这 22 对引物组合对西南地区
10 种猕猴桃 50 个种质材料共扩增出 979 条条带，
其中硬毛猕猴桃的多态性条带数为 649 条，平均多
态性条带比率为 66.3%。部分电泳图谱见图 4。
2.5 西南地区特色猕猴桃的遗传关系
为验证本研究筛选出的猕猴桃 AFLP 优化体
系，并分析西南地区特色猕猴桃的遗传关系，构建
了 10 种具有地域代表性的 50 个猕猴桃种质材料
图 2 DNA 酶 切 时 间 的 优 化。M：2000 DNA marker；1 ~ 4：300 ng
DNA 分别酶切 2、4、8 和 12 h。
Fig. 2 Optimum of DNA digestion time. M: 2000 DNA marker; 1 – 4:
300 ng DNA digested for 2, 4, 8 and 12 hours, respectively.
图 3 预扩增反应体系优化。1 ~ 4：5、10、20 和 30 倍稀释的连接产物。
Fig. 3 Optimum of pre-amplification reaction system. 1 – 4: Ligation
mixture diluted 5, 10, 20 and 30 folds, respectively.
320 第21卷热带亚热带植物学报
表 3 挑选出的 AFLP 选择性引物
Table 3 AFLP selected primers
选择性引物
Selected primer
总条带数
Total bands*
多态性条带数
Polymorphic bands**
%
P1 (EACG/MCTG) 39 28 71.8
P2 (EACG/MCCC) 41 30 73.2
P3 (EACG/MCGT) 42 33 78.6
P4 (EACG/MCGG) 40 29 72.5
P5 (EACG/MCCT) 41 30 73.2
P6 (EAAC/MCAC) 54 37 68.5
P7 (EAAC/MCCA) 43 29 67.4
P8 (EAAC/MCCG) 44 22 50.0
P9 (EAAC/MCTT) 48 25 52.1
P10 (EAAC/MCCC) 46 27 58.7
P11 (EAAC/MCAA) 45 34 75.6
P12 (EAAC/MCCC) 44 36 81.8
P13 (EAAC/MCGT) 46 21 45.7
P14 (EAAC/MCGC) 47 32 68.1
P15 (EATT/MCTG) 48 37 77.1
P16 (EAGG/MCCC) 41 31 75.6
P17 (EAGG/MCCC) 46 31 67.4
P18 (EAGG/MCCG) 47 38 80.9
P19 (EAAA/MCAC) 40 20 50.0
P20 (EAAA/MCGT) 40 21 52.5
P21 (EATG/MCTG) 49 28 57.1
P22 (EATG/MCCG) 48 30 62.5
总数 Total 979 649 66.3
平均 Mean 44.5 29.5 66.3
*：猕猴桃混合 DNA； **：硬毛猕猴桃 DNA。
*：Mixed DNA of all samples; **：DNA of Actinidia chinensis var.
hispida.
图 4 猕猴桃 AFLP 选择性扩增产物的聚丙烯凝胶电泳图
Fig. 4 Polypropylene gel electrophoresis of AFLP selective amplification
for kiwifruits
的遗传结构树。从图 5 可见，50 个猕猴桃种质材
料按照种类聚类的趋势十分明显，说明本实验优化
的 AFLP 系统能够准确区分西南地区的各种特色
猕猴桃。50 个猕猴桃种质材料的遗传相似性系数
变化范围为 0.56 ~ 1.0，其中多个种类存在相似度达
100% 的 种 质(如 ADD3 与 ADD7、ADD8，ACC2
与 ADD4-8 等)，而 AT 种质猕猴桃与 ADD 系列的
遗传相似性最低。在相似系数 0.56 的水平上，西南
地区猕猴桃按照组系关系分为 3 个大类，即星毛组
(sect. Stellatae)猕猴桃(中华猕猴桃、美味猕猴桃和
硬毛猕猴桃)聚为一大类，斑果组(sect. Maculatae)
(毛被猕猴桃、京梨猕猴桃和葛叶猕猴桃)和净果组
(sect. Leiocarpae) (紫果猕猴桃、四萼猕猴桃、紫果
猕猴桃和葛枣猕猴桃)的聚类关系有交叉，表现在
狗枣猕猴桃的 AK-1 与毛被猕猴桃的 AVR-4 聚类
关系接近，而净果组的四萼猕猴桃(AT-1 和 AT-2)与
西南地区其他种的遗传距离最远，这与张田[5]和黄
宏文[18]等的研究结果相同。同属净果组的紫果猕
猴桃(AA-4)与狗枣猕猴桃(AK)也存在一定的亲缘
关系，其遗传相似性系数为 0.88，说明两个品系间
存在较近的亲缘关系。
3 讨论
AFLP 标记的操作步骤繁多，需经总 DNA 提
取、酶切连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳、银染等步骤，任何的不当操作都会直
接影响实验的结果。其中，DNA 用量、酶切时间、
连接产物稀释倍数与选择性扩增引物的筛选是影
响试验结果的重要因素，且以后三者最为重要[19–20]。
第4期 321
本文使用西南地区的特色猕猴桃 10 种 50 个种质
材料，针对 AFLP 试验中 3 个关键因子进行了优
化，最终确定了西南地区猕猴桃 AFLP 多态性研究
的体系为： 300 ng 基因组 DNA，用 EcoR Ⅰ/Mse Ⅰ
(15 U/5 U)于 37℃下双酶切 2 h，酶切产物加接头后
稀释 5 倍进行预扩增，预扩增产物稀释 10 倍后再
使用 22 对引物进行选择性扩增。
AFLP 标 记 的 对 象 是 双 酶 切 处 理 的 基 因 组
DNA，获得的指纹图谱多态性十分丰富，从分析手
段上则是统计电泳条带的数量，因此 AFLP 从操作
步骤以及结果分析方面都带有显著的生物统计学
特点[21–22]。虽然以往已有许多关于猕猴桃 AFLP
多态性分析的研究报道，都没有进行全部选择性扩
增引物对(256 对)的优化，而只进行了部分(64 对)
引物筛选，最后只有 8 对引物用于正式实验，少量
引物组合和条带数目很容易导致多态性统计分析
的不稳定性和偏差[16–17]。本研究从 256 对引物中
筛选出 22 对最适组合，利用这些选择性扩增引物
对西南地区特色猕猴桃进行 AFLP 分析，每对引物
扩增出的条带数都在 40 条以上，且多态性条带不
少于 20 条。这 22 对引物对西南地区 10 种猕猴桃
50 个种质材料共扩增出 979 条带，远远多于以往的
研究报道。使用本研究中获得的 22 条引物，保障
了猕猴桃 AFLP 多态性分析统计结果的稳定性，弥
补了以往的不足。
我国西南地区是猕猴桃的密集生长区域，星毛
组、斑果组、净果组和糙毛组(sect. Strigosae)猕猴桃
都有分布，但野生糙毛组猕猴桃不易寻找。对西南
地区 10 种猕猴桃 50 个种质材料的聚类分析结果
表明，猕猴桃 2 种普通种类和 8 种特色种类基本按
照种分别聚在一起，10 种猕猴桃间又按组系关系
各自聚类。这与徐小彪[13]的研究结果相似，说明西
南地区猕猴桃的遗传多样性差异较大。从图 5 还
可看出，四川地区的中华猕猴桃和硬毛猕猴桃在遗
传关系上成为 1 个独立小类群，表明这两个种的遗
传关系相近，可能是近年来四川地区大量引种猕猴
桃造成的。斑果组与净果组种间存在的遗传结构
交叉现象，暗示了西南地区猕猴桃分布的区域性特
点，如狗枣猕猴桃的 AK-1 与毛被猕猴桃的 AVR-4
聚类关系接近，两个样本分别分布于四川凉山的
盐源县和四川攀枝花的盐边县，地理位置十分接
近，而紫果猕猴桃的 AA-4 与狗枣猕猴桃的 AK-2、
AK-3、AK-5 和 AK-6 也存在较近的地理距离，因
此也有聚类关系的交叉现象。
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图 5 西南地区特色猕猴桃品系基于 AFLP 的 UPGMA 聚类图
Fig. 5 UPGMA map among Actinidia species based on AFLP
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322 第21卷热带亚热带植物学报
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