全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，13(3)：253—258
如Ⅱ，7砌f ofTropicd and Subtropicd Botany
兰花蕉的遗传多样性研究
李 荣，唐源江，廖景平
(中国科学院华南植物园，广州 510650)
摘要：采用简单重复序列区间 (ISSR，Inter-Simple Sequence Repeat)分子标记技术，对采自广东省的濒危植物兰花蕉
(Orchidantha chinensis T．L．wu)的7个居群 137个个体进行遗传变异分析。用 1O个 ISSR引物共扩增出清晰谱带
101条，其中58条具有多态性，总多态位点百分率为57．43％。居群水平相对较低，多态位点百分率在 6．93％-35．64％之
间，平均为 18．24％。经POPGENE1-31数据处理，结果表明：在物种水平上Nei基因多样性为0．1254~0．1686；Shannon
信息指数为0．2000~0．2429；Nei基因分化系数为0．5481，表明54．81％的遗传变异分布在居群间，45．19％的遗传变异分
布在居群内。物种居群间的遗传一致度在 0．8855—0．9511之间。我们认为红花潭是其最适合生境，建议在此建立自然保
护区：鉴于兰花蕉居群间出现了一定程度的分化，为最大限度地保护兰花蕉的遗传多样性，建议在自然居群间进行相
互移栽，以提高群体间的基因交流。
关键词：兰花蕉：ISSR；遗传多样性：遗传结构
中图分类号：O16 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2005)03—0253—06
Study on Genetic Diversity of Orchidantha chinensis(Lowiaceae)
LI Rong， TANG Yuan—j iang， LIA0 J ing—Ping’
(South China Botanical Garden,the Chinese Academy ofSciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：Inter-simple sequence repeats 0SSR)marker was used to analyze the genetic diversity and diferentiation
of 1 37 individuals within and among 7 populations of Orchidantha chinensis，an endangered species，in Guangdong
Province．Ten ISSR primers generated 101 bands，ofwhich 58(57-43％)were polymorphic．ISSR diversity within
the population was lower than that among the populations(at species level：P 57．43％，H 0．1254，I=0．2000；at
population level：P=I 8．24％，H=0．057，I=0．0876)．Based on Nei’S G value calculated by POPGENE1．3 1，gene
diversity within populations was 0．1 254±0．1 686．Shannon information index was 0．2000±0．2429．Variation
coeficient among populations was O．5481．and that within population was O．4519．The ranger ofgentic identity
among populations was from 0．8855 to 0．95 1 1．Based on the gene diversity inform ation available for Orchidantha,
two management strategies are proposed．A conservation area is suggested to be established in Honghuatan(HHT)
where is considered to be an optimal habitat for 0．chinensis growth．And because ofthe diferentiation among the
populations，cross transplantation is suggested in order to enhance the gene flow among the populations． By this
means，the genetic diversity resources of the species could be preserved to the greatest extent．
Key words：Orchidantha；ISSR；Genetic diversity；Genetic structure
兰花蕉 (Orchidantha chinensis T．L．wu)隶属
于兰花蕉科 (Lowiaceae)兰花蕉属 (Orchidantha N．
E．Brown)，全球有 16种，1变种[1-91。兰花蕉是热带
东南亚特有类群，为单属科。主要分布在加里曼岛、
马来西亚、中印半岛及我国南部。在我国兰花蕉科
有 2种 1变种 ，即兰花蕉(D．chinensis)及其变种
长萼兰花蕉(D．chinensis Var．1ongisepala)、海南兰花
蕉(D．insularis T．L．Wu)，均是我国特有种。兰花蕉
收稿日期：2004一ll一29 接受 日期：2005—03—02
基金项 目：国家 自然 科学 基金 重点 项 目(40332021)；自然科 学基 金(39870087，30370099)；广 东省 科技 计划 项 目(2002C2013l，
2004B2O90l008)资助
通讯作者 Corresponding author
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 l3卷
现已列为国家三级保护植物【 】。然而，迄今为止对兰
花蕉的研究，主要集中在孢粉 “】、胚胎 】、解剖
学【 3，-4l、分类学[4,151、细胞学t16,171~H生殖生物学【 】等方
面，有关遗传多样性方面的研究未见报道。
物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是其
生存和发展的前提，对稀有濒危植物遗传多样性和
遗传结构进行研究，是探讨其适应性、生存力的基
础，也是分析导致其濒危机理的基础【l81。遗传多样性
的研究方法主要有蛋白质 (酶)电泳、限制性内切酶
酶切片段长度多态性分子标记技术 (RFLP)、基于
PCR技术的分子标记 (如RAPD和 ISSR)及DNA
序列分析等。简单重复序列区间 (Inter—Simple
Sequence Repeat，ISSR)扩增，是目前较常用的方法
之一。ISSR分子标记技术具有 DNA样品用量少、
操作简单、实验成本低、重复性好等优点，能为我们
提供有关基因组的丰富信息，现已广泛用于品种鉴
定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子
生态学研究中。本研究采用 ISSR分子标记技术研
究兰花蕉的遗传变异，以阐明其遗传多样性水平和
遗传结构，探讨种群遗传多样性水平与环境因子之
间的相关性，为兰花蕉的遗传多样性保护提供科学
依据。
1材料和方法
1．1实验材料
材料采自6个野生居群和 1个栽培居群，野生
居群分别来自广东信宜和阳春，其中采自信宜的有
花楼顶居群、采自阳春的有码头湾、红花潭、八甲、
圭冈、勾髻岭居群，栽培居群来自华南植物园姜园。
居群中每个体材料都取自不同的植株，并且对破坏
严重、个体较少的居群 (如信宜居群)采取了完全
采样策略。采样时采摘兰花蕉的嫩叶，置于变色硅
胶中干燥保存。材料来源和采样数见表 l。
1．2 基因组 DNA提取与 PCR扩增
采用改良的CTAB法 [191提取兰花蕉叶片基因
组 DNA。ISSR扩增反应条件经过比较和优化确定
为 20 l的PCR反应液，内含：20 ng模板 DNA，
l0 mmol／L Tris—HCL (pH=9．0)，1．5 U Taq 酶 ，
2．0 mmol／L MgCI，，0．1 mmol／L dNTPs，200 nmol／L
引物，2％甲酰胺。
PCR反应在PTC一200(M Research)PCR仪上
进行，ISSR—PCR反应程序为：94*C预变性 5 min后，
94℃ 变性 45 S，51．5℃复性 45 S，72℃延伸 1．5 min，
35个循环，72℃延伸 7 min。
PCR扩增产物在 1．5％的琼脂糖凝胶上电泳分
离，以北京天为时代有限公司的 100 bp DNA ladder
(100一l 500 bp)为分子标记，溴化乙锭 (EB)染色。
DNA片段通过计算机凝胶成像系统(Labworks
Software Version 3．0：UVP，Upland，CA91786，USA)
观察、记录。
1．3实验设计
用加拿大哥伦比亚大学 (UBC)提供序列，上
海生工公司合成的ISSR引物，7个居群中各选取 2
个模板DNA，在20 Ll反应体系中进行扩增筛选。
从 100个引物中筛选出 l0个扩增条带较多、信号
强、背景清晰的引物，用于全部 7个居群 DNA样品
的扩增。
1．4 数据统计与分析
电泳图谱 中每一条带视为一个分子标记
(marker)，并代表一个引物的结构位点。按凝胶同
一 位置上 DNA带的有无进行统计，有带的记为
“l”，无带的记为“0”。形成0／l矩阵图输入计算
机，采用POPGENE Version 1．31软件[201计算出兰花
蕉各个居群的多态位点百分率 (P)、Nei基因多样
性指数 (H)、Shannon信息指数 (I)、基因分化系数
表 1 材料来源和采样数
Table 1 Localities and number of samples of O，chinensis
维普资讯 http://www.cqvip.com
筑3 ： ÷佗熊 门遗f‘#”一 州f究
fG盯)、J 1 niJ J I l多十 度lH )、J 歼内坫l l多忏J堑
(H )段 Nei趟f々 一投J l遗传 离： 类分 采
jH JI权 州钾求⋯I均址(Unweighlcd pair—gr0
mcthod．arithmetic average，UPGMA)
2结 干l1分析
2．1兰花蕉的遗传多样性
从 ⋯)个川物IlI筛选⋯ 】0个 [SSR川物 {808，
811，834，g40，836，841．i144．888 889．890)．刈 7个
群 l37个DNA样l。 进f1 P(’R J ． Ilt rjI物
841刈¨ i,jfi 木的 I6株DNA IiI J 站 芒{
I 10个，jI物-}=r J ⋯ 祭 。 数Il从3刮 I5 1、苛，兼
一 段 几小 450一l 600 bl1之fN J，J J ⋯ J l01
条带．1 —I 彩志。『 0条 58个， 0l 57 43C~- (1i J．一 柞
水、 ．Nei JlL 彩样 l1=0 057，Shannon 息指
数 I=0 0865 物褂水’r Nei J．L 多样- fl=
255
【l_1254，Shannon f．i 指数i=0 2000．7 洋多态化点
分比率 6．93％一35．64％之『}IJ，衫态他点百分比
半 低 为八 l。居群 93％)．最 如为红花潭 ^群
(35 649k．1 Nei j．E⋯多样 干¨ Shannon ． { 数的
人小 J J 制忏多态位点 分章f 大，J、趋势 致{丧
2) 南．fi 物蚓IAJ栽培屑辟 (CP)tl{j遗传多样‘rI-
(I)0583．Shannon 息指数 ()．1；)878 栽培胼群的遗
多々样 水’ 牛¨村总遗传多样 水 女低．=
2．2兰花蕉的遗传分化
} j=cl J 群IAJ J LI^】多样。H-(¨、1、J苦l 0 f 舒化
{D盯) Il,i 群 遗传芹 芯I 遗10擎 Il f行lI比
1{=_f(G、 )( 3)Il J|¨：总 凶多样- ．¨=0l254』、J
l。· 舯 I 多fl-P1．cI 0．0509 ． _JJ遗传唑 1．
篮仃 J 群Il1 J； 流 N c)4I 23．』．￡ 分化系
数(j =(I 548I，文_J J 群fl Jf_ 定的遗f‘业计，l j
总监j¨ 0 54 81％．
1 2 3 I j M 6 7 8 9 l0 1l 12 13 1 t 15 I，
I-jI物 1441 ， li-5_、iPS MTW 、 [ 1．-‘ l6协J,Lp．PI n[SSR I 『
ISSR prolile~c1 I nindi,idual gfmm IhcM TW n·ipulalion ol ，,lil,i ， ， wilh pnnler 841
l^ 、 】一 州 I6杯 DNA l U 引Prolilc ol l nindividuaIsfromIhcM FW populalicl1
表2兰花蕉居群间的遗传变异
I able 2 The gcuclic~．anation statisticg amung n“pulBI、(r(I、(，Jl、llIl llLD MTw (P 是 I For abbre~ialilil c T bl
表 3 兰花蕉居群内基困多样性
Table Gene dix．ersi wilhin，J，Dil J1， pupulaIiHns
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 13卷
裹4兰花蕉居群问Nei遗传一致度(右上角)和遗传距离(左下角)
Table 4 Nei’S genetic identity(above diagona1)and genetic distance(below diagona1)among n chinensis population
2．3遗传距离和聚类分析
为了进一步分析群体间的遗传分化程度，计算
了Nei遗传一致度和遗传距离【21]。兰花蕉各群体间
遗传一致度和遗传距离见表 4。遗传一致度为
0．8855—0．951 1，遗传距离为0．0502—0．1216，花楼顶
(}玎LD)和栽培居群(CP)间的遗传一致度最高，勾
髻岭 (GJL)和栽培居群 (CP)间的遗传一致度最
低，说明兰花蕉居群间存在一定的遗传变异。根据
Nei遗传距离将所有居群进行UPGMA聚类，所构
建的群体遗传关系聚类图见图2。
遗传距离 Nei’s genetic distance
图2兰花蕉居群间Nei’S遗传距离的UPGMA聚类
Fig．2 UPGMA den drogram ofseven populations ofO．chinensis
based on Nei’S genetic distance
3讨论
尽管目前兰花蕉分布范围和个体数目有限，但
是从实验结果来看，在 7个居群间的多态位点百分
率 P=57．43％，Nei遗传多样性 H=12．54％，Shannon
信息指数 1=20％，比居群内的都要高(P=18．24％，
H=5．7％，1=8．76％1。这些显示出居群间相对较高的
遗传多样性水平，而居群内遗传多样性水平相对较
低，可能是ISSR分子标记技术较等位酶、RFLP、
RAPD技术可检测到更多的基因位点，发现更加丰
富的遗传信息[2-251。采用 ISSR分子标记技术，Jian
等[2o3研究银叶树(Heritiera litoralis)总的遗传多样
性为 0．2327，多态位点百分率为 83．19％；葛永奇
等[271研究银杏 (Ginkgo biloba)总的遗传多样性为
0．2408，多态位点百分率为70．45％：Ge等 研究果
角木(Ceriops taga1)总的遗传多样性为0．016，多态
位点百分率为8．96％。而兰花蕉总的遗传多样性为
0．1254，多态位点百分率为 57．43％。可见，从兰花蕉
的遗传多样性来看，在种的水平上，遗传多样性保
持着中度水平。
遗传结构是通过物种居群内和居群间的遗传
分化来体现的，基因流的大小也可以反映居群遗传
结构的大小，一般来说，基因流大的物种，种群间遗
传分化小，大的基因流可以阻止居群间的遗传分
化【捌；反之，居群间的遗传分化大∞。自然界的居群
往往不是处于理想状态，其居群遗传结构受到多种
生物学、生态学过程的影响，如繁育系统、分布范
围、种子传播机制等【3l】。兰花蕉为多年生草本植物，
能正常开花，但是成熟种子很少，种子常常在幼年
时期就已经脱落了【32]，主要通过根状茎进行营养繁
殖。因而造成了兰花蕉居群间较低的基因流动，这
可能是导致兰花蕉居群分化的因素之一。再则，
Slatkin[ 】认为Nm不足以抵制居群内因遗传漂变而引起的居群分化，
本研究中兰花蕉N 0．4123，说明基因流不足可能
是兰花蕉居群间遗传结构分化的主要原因之一。此
外，遗传漂变可使小居群内遗传多样性降低，小种
群间遗传分化增大【 ，这与我们在野外调查中所观
察到的兰花蕉居群空间分布格局呈聚集型，种群规
模小的事实相吻合，因此，遗传漂变也是影响兰花
蕉遗传分化的重要因素。
Harmrick~t】认为异交传粉植物的遗传分化系数
平均为0．20，而自交物种为0．5 1。Kumar和Rogstaol~
研究了p rc gambeli及其同属其他植物，认为
异交植物居群基因流大，种群间的遗传分化小。
Bussel[ 5】用RAPD方法分析 35种植物的遗传分化
5
∞肌酣一哪舯 。肿 一 t●_l ●■-l ～
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 3期 李荣等：兰花蕉的遗传多样性研究 257
系数，发现29个异交物种的平均遗传分化系数为
0．193，另外6个自交物种为0．625。本研究中，兰花
蕉在物种水平上遗传分化系数Gsr=0．5481，与自交
植物的平均值非常接近。
采自华南植物园的栽培居群 (CP)遗传多样性
为0．0583，多态位点百分率为 17．82％，相对兰花蕉
总遗传多样性(0．1254)和多态位点百分率(57．43％)
而言，遗传多样性显著较低，这说明华南植物园栽
培居群的来源较为单一，同时也提示我们在建立保
护区时，应尽量扩大不同居群的来源，以最大限度
地增加其遗传多样性。
遗传多样性信息是保护濒危植物的先决条件，
它有助于制定合理的保护策略，采取高效的保护措
施。保护濒危物种的关键是保护其现有居群，进行
就地保护时应选择群体遗传多样性程度较高、适宜
居群生长和更新的集中分布区建立自然保护区。就
兰花蕉而言，红花潭居群具有最高的遗传变异，应
作为优先考虑的重点保护单元。在没有远交衰退的
情况下，鉴于兰花蕉不同居群问出现了一定程度的
遗传分化，为最大限度地保护其遗传多样性，建议
对不同自然居群内的个体进行相互移栽和采种育
苗移栽，以提高居群间的基因交流。此外，根据该物
种居群内遗传多样性较低，而居群间遗传多样性较
高的特点，如果进行易地保护，则应考虑对同一居
群内的取样可以相应减少，而把重点放在对尽可能
多的居群的取样上。
致谢 中国科学院华南植物园葛学军研究员、郝
刚研究员、王小兰副研究员以及韦萧副研究员对实
验设计提出了宝贵意见；在野外采集中得到阳春市
林业局、信宜市林业局以及 中国科学院华南植物园
邓云飞副研究员的大力帮助；李忠超协助处理数
据，特此谢忱。
参考文献
【l】Larsen K．New species of Veratrum and Orchidantha from Thailand
and Laos【J】_Syst Biol，1961，50：926—944．
【2】 Larsen K．A new species of Orchidantha(Lowiaceae) from
Vietnam【J】．Adansonia，1973，2：481—482．
【3】Larsen K．A new species of Orchidantha(Lowiaceae)from Borneo
【J】．Nord J Bot，1993，13：285—288．
【4】Wu T L(吴德邻)．Lowiaceae new to the flora ofChina[J】．Acta
Phytotax Sin(植物分类学报)，1964，9(4)：335—343．(in Chinese)
【5】 Holtum R E．Th e genus Orchidantha(Lowiaceae)【J】．Gard Bul
Singap，1970，25：239-246．
【6】 Nagamasu H，Sakai S．Orchidantha ino~i(Lowiaceae)，a new
species from Borneo[J】．NordJ Bot，1999，19：149—152．
【7】WuTL，L丑rsenk FloraofChinaIMI．Beijing：Science Press，St．
Louis：Mis~uri Botanical Garden PTcss．2000．24-319．
【8】 Pedersen L B．Four new species of Orchidantha(Lowiaceae)from
sabah【J】．Nord J Bot，2001，2l：l2l-l28．
【9】 Jenjitikul T，Larsenk Orchidanthafoetide(Lowiaceae)，a new
species from Th ailand【J】．Nord J Bot，2002，22：405-408．
【lO】傅立国．中国珍稀濒危植物[M】．上海：上海教育出版社，1989．
234．
【ll】 Long H(龙活)，Wen Y Q (温颖群)．Polen morphology of
Lowiaceae from China【J】．J Trop Sub~op Bot(热带亚热带植物
学报)，1997，5(3)：6—9．(in Chinese)
【12】Wen Y Q(温颖群)，Liao J P(廖景平)．Emb~olo#cal study on
Orchidantha chinensis[J】．J Trop Sub~op Bot(热带亚热带植物学
报)，2001，9：301—305．(in Chinese)
【13】Wen Y Q(温颖群)，Liao J P(廖景平)，Wu Q G(吴七根)．Anatomy
and histochemistry ofthe seeds of Orchidantha chinensis T．L．Wu
【J】．Guihaia(广西植物)，1997，17(3)：235—241．(in Chinese)
【14】Liao J P(廖景平)，Wen Y Q(温颖群)，Wu Q G(吴七根)．Study on
vascular system an atomy of the flowers of Orchidantha chinensis
T．L．Wu【J】_J Trop Sub~op Bot(热带亚热带植物学报)，1998，6
(4)：275—282．(in Chinese1
【15】Wu T L(吴德邻)．Flora Reipubliae Popularis Sinicae Tomus 16(2)
【M】．Beijing：Science Press，l981．19—21．(in Chinese)
【16】Laser K．C~omosome cytology and relationship of the Lowiaceae
【J】_Natl Hist Bull Siam So~，1996，2l：21—24．
【17】Song J J(宋娟娟)，Tang Y J(唐源江)，Liao J P(廖景平)，et a1．
Chromosome numbers of Orchidantha(Lowiaceae)[J】．Acta Bot
Yunnan(~：南植物研究)，2003，25(5)：609—612．(in Chinese)
【l8】Spiess E B．Genes in Population【M】．2nd ed，New York：John
W iley& Sons．1 989．773-774．
【l9】Dolye J．DNA protocols for plants— CTAB total DNA isolation
【A】． In：Hewit G M，Johnston A．Molecular Techniques in
Taxonomy【M】．Berlin：Springer,1991．283—293．
【20】Yeh F C，Yang R-C，Boyle T．POPGENE．Micmsofi Windows—
Based Freeware for Population Gen etic Analysis． Release l_3 l
【M】．Edmonton：University ofAlberta，1999．
【21】 Nei M．Genetic distance between populations 【J】．Alner Natl，
1972，l06：282—292．
【22】Godwin I D，Aitken E A B，Smith L W．Application of inter simple
sequence repeat (ISSR)markers to plant genetics[J】．Electro—
phoresis，1997，18：1524—1528．
【23】Nagoaka T，Ogiham Y．Applicability of inter simple sequence
repeat polymorphism inwheatforwheatfoeuseas DNA markers
in comparison to RFLP and RAPD markers[J】．Theor Appl Genet，
1997，94：597—602．
【24】Qian w(钱韦)，Ge s(葛颂)，Hong D Y(洪德元)．Assessment of
genetic variation of Oryza granulata detected by RAPDs an d ISSRs
【J】_Acta Bot Sin(植物学报)，2000，42(7)：741—750．(in Chinese)
【25】Du J K(杜金昆)，Yao Y Y(姚颖银)，Ni z F(倪中福)，et a1．Genetic
diversity revealed by ISSR molecular marker in common wheat，
spelt， Compactum and progeny of recurrent selection 【J】． Acta
Genct Sin(遗传学报)，2002，29(5)：45-452．(in Chinese)
【26】Jian S GShi S H，Zhong Y，et a1．Genetic diversity am ong south
维普资讯 http://www.cqvip.com
258 热带亚热带植物学报 第 l3卷
China Heritiera litoralis detected by Inter·simple sequence repeats
(ISSR)analysis[J】．Genet Mol Biol，2002，13(4)：272—276．
[27】Ge Y Q(葛永奇)，Qiu Y x(邱英雄)，Ding B Y(T炳扬)，et a1．An
ISSR analysis on population genetic diversity ofrelict plant Ginkgo
biloba[J】_Biodiv Sci(生物 多样性)，2003，Il(4)：276-287．(in
Chinese)
[28】 Ge X J，Sun M．Population genetic structure of Ceriops￡
(Rhizophoraceae)in Thailand and China[J】_Wetland Ecol Manag，
200 1，9：203—209．
[29】Kumar A，Rogstad S H．A hierarchical analysis of microsatelite
DNA diversity in Gambel oak(Q rc gambelii Nut．，Fagaceae)
[J】_Mol Ecol，1998，7：859-869．
[30】Rowe G．Phylogeogrphy of the maUeoack toad Bufocala mitta in
Britain：genetic diferentiation ofnmive and translocatcd populmion
[J】_Mol Ecol，1998，7：75 1-760．
[3 l】Hamrick J L，Godt M J W．Alozyme diversity in plant species[A]．
In：Brown A H D，Clegg M T，Kahler A L，et a1．Plant Populmion
Genetics，Breeding，and Genetic Resources[M】．Sunderland，
Mass：Sinauer Associates，1990．43-63．
[32】Wu Z F(吴忠发)．Additional description ofOrchidamha chinensis
T．L．Wu[J】．Guihaia(广西植物 )，1991，Il(3)：229—230．(in
Chinese)
[33】Slatkin M．Gene flow in natural populmions[J】．Ann Rev Ecol
Syst，1985，16：393—430．
[34】Chen L Z(陈灵芝)，Ma K P(马克平)．Science about Biological
Dive~ity：Principle and Practice[M】．Shanghai：Shanghai Science
and Technology Press，2001．103．(in Chinese)
[35】Bussel J D．The distribution ofrandom amplifed polymorphic
DNA (RAPD)diversity among populations of lsotoma petraea
(Lobeliaceae)[J】_Mol Ecol，1999，8：775-789．
维普资讯 http://www.cqvip.com