全 文 ：表观遗传是指不因 DNA 序列变化而发生的基
因功能改变，这种改变又可随细胞的有丝分裂和 /
或减数分裂而遗传的现象。基因组 DNA 甲基化是
表观遗传修饰的主要形式，是调节基因功能的重要
手段。植物核基因组中胞嘧啶甲基化是一种普遍
的现象，5-甲基胞嘧啶(5-m-C)水平与基因组的重
复序列水平相关。不同物种中 DNA 甲基化程度
差异较大，如小麦(Triticum aestivum)基因组中约有
33% 的甲基化胞嘧啶[1]，而银杏(Ginkgo biloba)基因
组中大约有 44% 的胞嘧啶被甲基化[2]。DNA 甲基
热带亚热带植物学报　2015， 23(5)： 527 ~ 533
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–11–17　　　　接受日期： 2015–01–27
基金项目： 国家自然科学基金项目(31170634); 海南省重大科技项目(ZDZX2013023-1)资助
作者简介： 李辉亮，男，博士，副研究员，研究方向为植物分子遗传。E-mail: lihui7532@126.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: shqpeng@163.com
巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析
李辉亮, 郭冬, 彭世清*
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101)
摘要： 为探讨巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)自根幼态无性系与供体间差异产生的原因，应用甲基化敏感扩增多态性扩增技术，
对巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组 DNA 胞嘧啶甲基化程度和模式进行了分析。结果表明，在巴西橡胶树体细胞胚发
生过程中不同阶段的 DNA 甲基化程度不同，以花药的 DNA 甲基化程度最高，体细胞胚的 DNA 甲基化水平最低。在体细胞胚
发生过程中出现了 I、Ⅱ和Ⅲ 3 种类型的甲基化多态性带型的改变，包括他们的出现与消失。因此，橡胶树体细胞胚发生过程
中可能通过 DNA 甲基化甲基化和去甲基化来调控基因的表达。
关键词：橡胶树；体细胞胚；DNA 甲基化；甲基化敏感扩增多态性
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.05.007
Changes in DNA Methylation during Somatic Embryogenesis of Hevea
brasiliensis
LI Hui-liang, GUO Dong, PENG Shi-qing*
(Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,
Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China)
Abstract: In order to understand the causes of differences between self-rooting juvenile clone and donors of
Hevea brasiliensis, the extent and pattern of cytosine methylation in genomic DNA of H. brasiliensis were studied
by using methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP). The results showed that MSAP profiles of
genomic DNA were different during somatic embryogenesis. The genomic DNA methylation of anther was the
highest among all tissues, while that of somatic embryo was the lowest. Changes in types of MSAP bands among
different tissues were frequently observed, including appearance and disappearance of types I, II, and III MSAP
bands. Therefore, the gene expression could be regulated by DNA methylation or demethylation during somatic
embryogenesis of H. brasiliensis.
Key words: Hevea brasiliensis; Somatic embryogenesis; DNA methylation; Methylation-sensitive amplification
polymorphism
528 第23卷热带亚热带植物学报
化可以引起 DNA 高级结构的变化从而引发一系列
的生物学功能，广泛参与细胞的脱分化及再分化、
染色质结构的改变和基因组印记的调节等，在调控
细胞的分化和维持细胞状态稳定中起着重要的作
用[3–7]。DNA 甲基化水平随环境条件及植物生长发
育的进程而发生变化。过高或过低的甲基化水平
都会导致植物生长发育的异常[8]。因此，DNA 甲基
化对于生物的生长发育具有非常重要的调控作用。
巴 西 橡 胶 树(Hevea brasiliensis Muell. Arg.)自
根幼态无性系是通过花药组织培养获得的一种橡
胶树种植材料，具有生长速度快、产胶量高、抗逆
性强等特性，有可能作为新一代的橡胶树种植材
料[9–11]。目前对巴西橡胶树自根幼态无性系高产机
制的研究仅限于形态学观察、排胶生理参数等，而
缺乏直接的遗传、分子生物学等方面的证据，在一
定程度上限制了巴西橡胶树自根幼态无性系在生
产中的应用和大面积推广[12]。巴西橡胶树自根幼
态无性系和供体老态无性系的遗传物质 DNA 序
列应该是相同的，组织培养在正常情况下不会改
变遗传物质 DNA 的序列，因此自根幼态无性系与
供体之间所表现出的差异，可能与表观遗传相关。
本研究利用甲基化敏感多态性扩增(Methylation-
sensitive amplification polymorphism, MSAP)方法对
巴西橡胶树花药组织培养过程中 DNA 甲基化的动
态变化进行了分析 , 以期从表观遗传的角度探讨巴
西橡胶树自根幼态无性系和供体之间产生差异的
原因 , 为研究巴西橡胶树自根幼态无性系的遗传机
制提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
巴西橡胶树‘海垦 2’(Hevea brasiliensis Muell.
Arg. ‘Haiken 2’)花药组织培养再生植株由中国热
带农业科学院热带生物技术研究所陈雄庭研究员
提供。分别采集不同发育阶段的材料，包括花药、
愈伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和
移栽大田植株芽，采集后迅速置于液氮中，于 –70℃
冰箱保存备用。
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α 由本实验室
保 存。EcoRⅠ、HpaⅡ、MspⅠ 内 切 酶、T4 DNA
连 接 酶 为 Forments 公 司 产 品。pMD19-T 载 体、
Taq DNA 聚合酶和随机引物 DNA 标记试剂盒为
TaKaRa 公司产品，DNA 凝胶回收用试剂盒购自
Tiangen 公司，α-32pdCTP 为北京市福瑞生物工程
公司产品，杂交尼龙膜为法玛西亚公司产品。
1.2 基因组DNA的提取与纯化
基因组 DNA 的提取与纯化参照王关林等[13]的
方法。取 1~2 g 材料，用液氮研磨粉碎，加入 DNA
提 取 液(含 1.5% 的 CTAB，1% 巯 基 乙 醇)，65℃
水 浴 90 min，加 入 氯 仿∶异 戊 醇(24∶1)，抽 提 2 次
后，加 RNA 酶 37℃温浴过夜，苯酚∶氯仿∶异戊醇
(25∶24∶1)进行纯化，样品 DNA 溶于 1×TE (pH 8.0)
缓冲液中，–20℃保存备用。
1.3 MSAP分析
MSAP 分 析 参 照 Xiong 等[14] 和 Portis 等[15]的
方法。分别用 EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I 组合对
基因组 DNA 进行酶切，连上接头，采用 MSAP 扩
增程序[14]进行 2 轮扩增，接头、引物序列见表 1。扩
增产物经上样缓冲液变性后，用 6% 聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测、
多态性甲基化片段从变性聚丙烯酰胺凝胶的回收
均按北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供的
方法。甲基化多态性条带统计中，清晰的条带记为
“1”，无带记为“0”。根据 EcoRⅠ/HpaⅡ或 EcoRⅠ/
MspⅠ扩增条带的差异，统计各种材料基因组 DNA
甲基化水平。再根据同一位点甲基化的差异，分析
DNA 甲基化模式的差异及 3 种 MSAP 条带类型的
转变。
1.4 多态性甲基化片段的扩增、测序
以回收片段为模板，采用原引物组合和选择性
扩增程序进行 PCR 扩增。所得 PCR 产物经纯化
回收后克隆到 pMD19-T 载体上。序列测定由上海
Invitrogen 生物技术有限公司完成。利用公共数据
库 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进 行 序 列 比
对和分析。
1.5 Southern杂交分析
用 EcoRⅠ/HpaⅡ和 EcoRⅠ/MspⅠ对花药组织
培养再生植株不同发育阶段的基因组 DNA 进行酶
切，采用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳进行分离并转膜，以
已经克隆的片段为探针进行 Southern 杂交。探针
标记按 TaKaRa 公司随机引物 DNA 标记试剂盒使
第5期 529
用说明书进行，Southern 杂交按照 Sambrook 等[16]
方法进行。
2 结果和分析
2.1 体细胞胚发生过程的DNA甲基化
从表 2 可见，采用 35 对引物分别从花药、愈
伤组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和
移栽大田植株芽的基因组 DNA 中扩增出 1549、
1537、1522、1533、1527 和 1536 条 甲 基 化 多 态
性条带，其中以花药外植体的甲基化多态性条带最
多(1549)，体细胞胚的最少(1522)。甲基化多态性
条带有Ⅰ、Ⅱ和 III 等 3 种类型，花药、愈伤组织、体
细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移栽大田植
株芽中类型Ⅰ的甲基化多态性条带分别为 1197、
1194、1192、1199、1183 和 1191；类 型Ⅱ 的 分 别
为 288、283、275、272、285 和 289；类 型 III 的
分 别 为 64、60、55、62、59 和 56。 花 药、愈 伤
组织、体细胞胚、再生植株幼芽、再生植株叶和移
栽大田植株芽 DNA 总甲基化位点的甲基化水平
分 别 为 22.724%、22.316%、21.682%、21.787%、
22.528% 和 22.461%，以体细胞胚的甲基化水平最
低(21.682%)，再生植株幼芽的次之，花药的最高
(22.724%)。
巴西橡胶树体细胞胚发生过程出现了一些组
织特异性的甲基化多态性条带(图 1)。随着体细胞
胚的发育，各阶段都会出现不同甲基化多态性带型
的改变，包括不同类型条带的出现或消失，和不同
表 1 MSAP 接头和引物
Table 1 Adapters and primers in MSAP
接头和引物 Adapter and primer 序列 Sequence (5′~3′)
接头 EcoR I CTCGTAGACTGCGTACC
Adapter EcoR I AATTGGTACGCAGTCTAC
Hpa II/Msp I GACGATGAGTCTAGAA
Hpa II/Msp I CGTTCTAGACTCATC
预扩增引物
Pre-amplification primer
EcoR I +A GTAGACTGCGTACCAATTCA
Hpa II/Msp I+T GATGAGTCTAGAACGGT
选择性扩增引物
Selective amplification primer
EcoR I+AAG GACTGCGTACCAATTCAAG
EcoR I+AAA GACTGCGTACCAATTCAAA
EcoR I+ACC GACTGCGTACCAATTCACC
EcoR I+ACT GACTGCGTACCAATTCACT
EcoR I+ATA GACTGCGTACCAATTCATA
EcoR I+ATC GACTGCGTACCAATTCATC
EcoR I+AGT GACTGCGTACCAATTCAGT
EcoR I+AGG GACTGCGTACCAATTCAGG
Hpa II/Msp I +TAA GATGAGTCCTGAGCGGTAA
Hpa II/Msp I +TAT GATGAGTCCTGAGCGGTAT
Hpa II/Msp I +TCG GATGAGTCCTGAGCGGTCG
Hpa II/Msp I +TAC GATGAGTCCTGAGCGGTAC
Hpa II/MspI +TTT GATGAGTCCTGAGCGGTTT
Hpa II/Msp I +TTA GATGAGTCCTGAGCGGTTA
Hpa II/Msp I +TTC GATGAGTCCTGAGCGGTTC
Hpa II/Msp I +TCG GATGAGTCCTGAGCGGTCG
Hpa II/Msp I +TCA GATGAGTCCTGAGCGGTCA
Hpa II/Msp I +TGC GATGAGTCCTGAGCGGTGC
Hpa II/Msp I +TGG GATGAGTCCTGAGCGGTGG
Hpa II/Msp I +TGT GATGAGTCCTGAGCGGTGT
李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析
530 第23卷热带亚热带植物学报
类型条带的相互转换，有超过 17 种以上的模式(表
3)。从花药诱导为愈伤组织时，类型 I、Ⅱ和 III 的
甲基化多态性带分别有 10、7、2 条带消失；从愈
伤组织发育为体细胞胚时类型Ⅱ的甲基化多态性
带消失最多，达 19 条，类型 III 消失的条带数为 11；
体细胞胚发育为再生植株幼芽的过程中，消失和出
现的类型 I 条带都比较多。可见，类型 I 甲基化多
态性带的变化最大(表 4)。
2.2 甲基化多态性片段的验证
为了进一步验证甲基化多态性的真实性，分别
选取一条类型Ⅱ和 III 的甲基化多态性片段作探针
进行 Southern 杂交验证。结果表明，杂交出的条带
与 MSAP 的带型一致(图 2)，表明甲基化条带多态
性的真实可靠。而多出的一些或大或小的杂交条
带可能是巴西橡胶树基因组中具有高同源性的序
列或同源的多拷贝基因，由于杂交探针序列过短造
成的非特异杂交。
2.3 甲基化片段的序列分析
随机选取 14 条组织特异性的条带进行回收，
采用相同的选择性扩增引物进行二次扩增，将扩增
产物克隆到 pMD19-T 载体上送测序公司进行测
序。通过 NCBI 在 GenBank 公共数据库中对获得
的序列进行 BLAST 比对，结果表明，有 6 个片段
与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的 ABC transporter、
ATP-binding protein、ASYMMETRIC LEAVES 2、
acyl-CoA synthetase、acyltransferase-like protein、
表 2 巴西橡胶树体细胞胚发生过程中基因组 DNA 的甲基化
Table 2 DNA methylation during somatic embryogenesis of Hevea brasiliensis
组织
Tissue
条带类型 Band type 甲基化总位点数
(Ⅱ+Ⅲ) Number
of methylated sites
总甲基化率
Total Methylation
rate (%)
内部甲基化率
Internal methylation
rate (%)
外部半甲基化率
External hemi-
methylation rate (%) Ⅰ Ⅱ Ⅲ
总数
Total
花药 Anther 1197 288 64 1549 352 22.724 18.593 4.132
愈伤组织 Callus 1194 283 60 1537 343 22.316 18.412 3.904
体细胞胚
Somatic embryo
1192 275 55 1522 330 21.682 18.068 3.614
再生植株幼芽
Bud of regenerated plant
1199 272 62 1533 334 21.787 17.743 4.044
再生植株叶
Leaf of regenerated plant
1183 285 59 1527 344 22.528 18.664 3.864
移栽大田植株芽
Bud of transplanting plant
1191 289 56 1536 345 22.461 18.815 3.646
图 1 引物组合 EcoR I+AAC-Hpa II/Msp I+TAG 在体细胞胚发生过
程的 DNA 甲基化变化。L：标准分子量； H：EcoRⅠ/HpaⅡ酶切； M：
EcoRⅠ/MspⅠ酶切； 1：花药； 2：愈伤组织； 3：体细胞胚； 4：再生植
株幼芽； 5：再生植株叶； 6：移栽大田植株芽； A、 B、 C、 D 分别表示
类型 I、Ⅱ、Ⅲ及组织特异性 MSAP 条带。
Fig. 1 Changes in DNA-methylation by combination primers of EcoR I+
AAC-Hpa II/Msp I+TAG. L: Standard molecular marker; H: Digested
by EcoR I/Hpa II; M: Digested by EcoR I/Msp I; 1: Anther; 2: Callus;
3: Somatic embryo; 4: Bud of regenerated plant; 5: Leaf of regenerated
plant; 6: Bud of transplanting plant; A, B, C, and D present MSAP bands
of type I, type II, type III, and tissue-specific band, respectively.
第5期 531
表 3 巴西橡胶树体胚发生过程中不同组织的 MSAP 模式
Table 3 MSAP patterns and their respective abundance during somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis
序号
No.
花药
Anther
愈伤组织
Callus
体细胞胚
Somatic embryo
再生植株幼芽
Bud of plant
再生植株叶 Leaf of
regenerated plant
移栽大田植株芽 Bud
of transplanting plant
MSAP 条带数
Number of MSAP bands
1 Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ 1120
2 Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ 245
3 Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ Ⅲ 65
4 Ⅰ 5
5 Ⅱ 3
6 Ⅲ 1
7 Ⅰ 3
8 Ⅱ 2
9 Ⅰ 5
10 Ⅱ 3
11 Ⅲ 2
12 Ⅰ 3
13 Ⅲ 2
14 Ⅰ 2
15 Ⅲ 1
16 Ⅰ 2
17 Ⅰ Ⅰ 2
18 Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅰ Ⅰ 2
19 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ 1
20 Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅱ 1
其他 Others 　 　 　 　 　 　 31
表 4 巴西橡胶树体胚发生过程 MSAP 条带的变化
Table 4 Changes in MSAP band type during somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis
带型变化
Band change
花药
Anther
→
愈伤组织
Callus
→
体细胞胚
Somatic embryo
→
再生植株幼芽 Bud
of regenerated plant
→
再生植株叶 Leaf
of regenerated plant
→
移栽大田植株芽 Bud
of transplanting plant
总数
Total
Ia → Id 　 10 　 6 　 12 　 17 　 5 　 50
IIa → IId 7 19 4 5 6 41
IIIa → IIId 2 11 5 3 3 24
Id → Ia 7 5 16 4 8 40
IId → Iia 3 6 5 12 7 33
IIId →IIIa 2 3 12 3 5 25
I → II 6 2 3 7 4 22
I → III 1 4 5 4 1 15
II → I 2 3 10 2 1 18
III → I 　 4 　 2 　 1 　 6 　 7 　 20
a: 出现； d: 消失。
a: Appearance; d: Disappearance.
李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析
532 第23卷热带亚热带植物学报
ATOFP1/OFP1 (Ovate family protein 1)和 protein
binding/ transcription repressor 片段具有很高的同
源性，而另外 8 个片段没有找到同源的基因片段。
3讨论
高 等 植 物 因 组 DNA 甲 基 化 程 度 因 种 类 而
异，从 4.6%~40% 不等。本研究巴西橡胶树的平
均甲基化率约为 22.25%，低于毛竹(Phyllostachys
heterocycla)的 32.12%[17]，而高于水稻(Oryza sativa,
17%)[14]和苹果(Malus pumila, 21%)[18]。李林海等[19]
应用 MSAP 技术对巴西橡胶树‘热研 8-79’的老态
和幼态无性系叶片基因组 DNA 甲基化进行了研
究 , 认为幼态无性系的甲基化率为 33.2%，老态无
性系的甲基化率为 22.9%，略高于本研究的平均甲
基化率。差异产生的原因可能与实验材料及检测
方法(如引物数量、引物的差异、银染检测条件等)等
相关。
对木本植物发育阶段的 DNA 甲基化水平和模
式已有研究报道。Fraga 等[20]报道成年期木本植物
的分生组织的甲基化水平显著高于童期和类童期
分生组织；Monteuuis 等[21]认为随着树木发育 DNA
甲基化水平和模式会发生改变。本研究结果表明，
巴西橡胶树体细胞胚发生过程中不同组织间的
DNA 甲基化水平存在一定差异，其中体细胞胚的
DNA 甲基化水平最低，为 21.682%，而花药的 DNA
甲基化程度最高，为 22.724%。在巴西橡胶树体胚
发生过程中，每个阶段都存在 DNA 甲基化和去甲
基化的情况，不同时期 DNA 甲基化或去甲基化会
分别占主导地位，从愈伤组织到体细胞胚阶段去甲
基化比较明显，这与体细胞胚再分化时需启动大量
基因表达相一致。而在后续发育过程中类型 II 或
III 的甲基化条带增加比较明显，表明部分基因正在
关闭或沉默。
对部分特异性甲基化 DNA 片段进行同源比
对，结果表明，14 个甲基化多态性 DNA 片段中有
6 个片段的基因编码区能找到同源序列，8 个找不
到同源序列，这些找不到同源序列的甲基化片段很
有可能就是基因的启动子区域或内含子区域，这与
Cervera 等[22]对拟南芥的研究结果相似。这 6 个片
段中，有与 ABC transporter 和 ATP-binding protein
基 因 的 同 源 片 段，拟 南 芥 中 ABC transporter 和
ATP-binding protein 与光形态建成和幼苗根早期发
育相关[23–24]；有与 ASYMMETRIC LEAVES 2 基因的
同源片段，ASYMMETRIC LEAVES 2 在拟南芥中
参与叶的极性建立[25]。这些与巴西橡胶树体细胞
胚发生有关的基因片段 , 可为进一步研究橡胶树体
细胞胚发生与特异基因表达调控的关系提供线索。
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图 2 DNA 甲基化的 Southern blot 验证。A: 类型Ⅱ； B：类型Ⅲ； L: 标准分子量； H: EcoRⅠ/HpaⅡ酶切； M: EcoRⅠ/MspⅠ酶切； 1: 花药； 2: 愈
伤组织； 3: 体细胞胚； 4: 再生植株幼芽； 5: 再生植株叶； 6: 移栽大田植株芽。
Fig. 2 Verification of DNA methylation by Southern blot. A: Type II; B: Type III; L: Standard marker; H: Digested by EcoR I/Hpa II; M: Digested by
EcoR I/Msp I; 1: Anther; 2: Callus; 3: Somatic embryo; 4: Buds of regenerated plant; 5: Leaves of regenerated plant; 6: Bud of transplanting plant.
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李辉亮等：巴西橡胶树体细胞胚发生过程中DNA甲基化分析