全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，l1(1)：23-26
Joumd of Tropical and Subtropical Botany
羊奶果不同发育阶段根瘤的细胞
结构及固氮、吸氢活性
刘育梅 黄维南 黄志宏 刘剑秋2
(1．福建省亚热带植物研究所，福建 厦门361006：2．福建师范大学生物工程学院，福建 福州 350007)
摘要：比较羊奶果根瘤三个不同发育阶段的显微、亚显微结构和固氮、吸氢活性的差异，探讨了根瘤结构与功能的关
系。结果表明：早期侵染方式为皮层细胞间隙侵染，此期的内生茵是一种分枝、具隔膜的茵丝体，早期侵染细胞有脂体
存在。成熟根瘤含茵细胞明显多于幼瘤和衰老瘤。成熟根瘤具有大量泡囊，成熟泡囊具分隔、双层壁结构。衰老瘤泡囊
分隔消失，不呈双层壁结构。成熟根瘤的固氮、吸氢活性明显高于幼瘤和衰老瘤。
关键词：羊奶果；根瘤；亚显微结构；固氮活性；吸氢活性
中圈分类号：Q939．132．04 文献标识码：A 文章编号：1005-3395(2003)01-0023—04
Cellular Structure of Root Nodules ofElaeagnus conferta
Roxb．and Nitrogen Fixation Acti ty
LIU Yu．mei ，2 HUANG Wei-nan HUANG Zhi-hong LIU Jian-qiu
(1． Jan Institute of Subtropical Botany，Xiamen 361006，China；2．Bio-englneerirtg Cot~e， Normal University，Fuzhou 350007，China)
Abstract：The ultrastructure ofroot nodules ofE／aeagnus confertaRoxb．and the activities ofnitrogen fixation and
hydrogen uptake were studied． The results show that Frank／a hyphae exist at early stage in intercellular space in
nodule cortex． Th e filamentous hyphae are branched、^，ith septa． Lipid bodies are distributed in infected young
cells．Th e number of infected cells in mature nodules is much larger than that of youn g and senescent nodules．
Apicalendophytichyphae swelltoform lots ofvesicleswhichare septatean ddouble-walled．Vesiclesare suggested
t0beimportatantinnitrogenfixation．In senescentnod ules．thevesiclesdisintegrate．Nitrogenfixationandhydrogen
uptake activitiesin maturenod uleismuchhigher than that in youn gan d senescentnod ules．
Key words：E／aeagnus conferta；Rootnodule；Ultrastructure；Nitrogen fixation activity；Hydrogen uptake activty
羊奶果(Elaeognus conferta Roxb．)(密花胡颓子、
南胡颓子、大果胡颓子)是胡颓子科胡颓子属的多年
生常绿灌木，野生于热带密林中，适应性强，生长迅
速，果实营养丰富，是一种有发展前景的热带淡季
水果。羊奶果也是药用植物和非豆科结瘤固氮植物，
其根瘤是由放线菌中的弗兰克氏菌(Frankia)侵染结
瘤的。有关羊奶果的根瘤内生菌的亚显微结构已有
研究报道【1 ，但羊奶果根瘤不同发育阶段的细胞结
构和固氮功能的关系，则尚未见报道。本文用光镜
收稿 日期：2002-04-08 接受日期：20o2—D9一lO
基全项目：福建省科委资助项目。
福建省亚热带植物研究所植物生理室及福建农业科学院电镜
室黄进华等同志协助工作，谨致谢意。
和透射电镜方法观察研究了羊奶果幼瘤、成熟瘤、
衰老瘤的显微和亚显微结构，并测定了其固氮、吸
氢活性，比较根瘤在不同发育程度上结构的变化，
同时探讨其根瘤结构与功能的关系。
1材料和方法
材料 羊奶果幼瘤、成熟瘤、衰老瘤取 自厦门
福建省亚热带植物研究所实验地的多年生植株。
光镜观察 新鲜根瘤洗净后，用 溶液
固定，石蜡包埋，切片厚度 10 m，PAS-苏木精染
色嘲，加拿大中性树胶封片，OlympusH显微照相。
透射电镜观察 新鲜根瘤洗净后，经 2．5％戊
二醛和 l％四氧化锇双重固定后，酒精逐级脱水，环
京 耄
维普资讯 http://www.cqvip.com
24 热带亚热带植物学报 第 11卷
氧丙烷过渡，Epon812包埋 ，Sorval MT-6000型超
薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，
用 JEM—IOOCX／I型透射电镜观察。
固氮酶活性 依照乙炔还原法测定[4]。
吸氢酶活性 参照汪化等方法IS]，用 103型气
相色谱仪热导检测器测定。
2 结果和分析
2．1外部形态
根瘤菌刺激皮层细胞不断分裂，在羊奶果侧根
上形成珊瑚状的根瘤簇，根瘤一般是短椭圆形或棒
状，每个根瘤最初含有 2-3个瘤瓣，瘤瓣顶端无瘤
根 (nodule root)，属桤木型根瘤同。瘤瓣顶端白色，
其余部分深灰色，横切面浅褐色，有一圈带红色的
含菌组织，纵切面观，顶端为分生组织，下方分化出
维管束和皮层组织，皮层中的侵染细胞，从瘤瓣顶
端到基部，呈逐渐发育成熟的趋势。幼瘤较小，根瘤
顶部为乳白色或略显黄色，成熟瘤较大，为黄棕色，
衰老瘤呈深褐色。
2．2 细胞结构
光镜下(图版 I：1-3)，经 PAS一苏木精染色后，
含菌细胞被染蓝黑色，未染菌的皮层细胞被染成紫
色。幼瘤染菌的细胞较少 (图版 I：1)，成熟瘤的较
多 (图版 I：2)，衰老瘤的染菌和未染菌细胞都有部
分解体 (图版 I：3)。电镜下 (图版 I：4-9)，可见根
瘤菌在皮层细胞之间穿行 (图版 I：4，5)，根瘤菌的
这种早期侵染方式为胞间隙侵染。此期的内生菌是
具有隔膜的分支菌丝，直径约 0．3-0．7 laITI，其细胞
壁为电子密度较高的单层壁，体内核物质分散，没
有明显的细胞核结构，这与前人在一些胡颓子科植
物根瘤内生菌的报道 8】一致。电镜观察表明，成熟
瘤 (图版 I：6，7)中有许多泡囊，泡囊是菌丝增殖到
一 定程度后，在菌丝及其分枝的末端膨大形成的，
是 Frankia不断发育分化的结果，泡囊呈椭圆球形，
直径比菌丝大，约 1．9-2．4 ltm,成熟泡囊电子密度
高，内外壁之间产生明显的“空区”，内层壁内伸形
成许多隔，隔随机产生，泡囊分成大小形状不规则
的亚单元，亚单元有条纹体，由电子明暗相间的条
纹组成。电镜下的幼瘤菌体呈黑点样，幼瘤的侵染
细胞中，细胞核膨大，并分叉变成指状核，细胞中可
见有脂体存在，这与沙棘早期侵染细胞类似 。衰老
瘤内部已有部分解体，泡囊分隔逐渐消失，泡囊内
出现空腔，泡囊壁不呈双层壁结构 (图版 I：8，9)。
2．3 固氮 、吸氢活性
我们于 2001年 11月和 2002年 3月多次取样
测定不同成熟度的羊奶果根瘤固氮活性，表 1的结
果显示，成熟瘤的固氮活性最高，幼瘤次之，衰老瘤
的活性很低，甚至测不出。不同时期取样的根瘤固
氮活性也不同，l1月份取样的根瘤固氮活性显著高
于 3月份取样的，这和我们过去研究的结果一致【堋，
即根瘤固氮活性的变化和季节有关，其规律是夏秋
(6-11月)活性较高，冬季与早春由于根瘤大多衰
败，新瘤刚形成，且气温较低，活性也较低。表 2表
明，羊奶果根瘤离体6 h后的固氮活性仍维持在一
定水平上，且变化不大。
裹 1 羊奶果不同成熟度根瘤固氯活性
Table l Nitrogenfixationactivity(ptoolC~I-h g’FW h- )ofroot
nodulesatdiferentdevelopmental stages
测定日期 幼瘤 成熟瘤 衰老瘤
Date Young nod ules Mature nodules Senescent nodules
2001-ll-28 3．4906 11 j I46 —
2OO2-3-2l 1．1775 2．0l38 O．O30o
加 C2}{2后反应 3 h，每个样品为 3-4个重复．Threehoursafter
reaction、vitlC2H2．Threeorfourreplicatesineachdetermination．
裹2 离体时间对羊奶果根瘤固氮活性的影响
T曲 le 2 E臁 ct ofduration ofexcised root nod ules on
nitrogen fixationactivty(PmolC#L gIFW h-’)
材 料 离体时问Durationofexcised rootnodulesCa)
Materials
测定时间：2002．3．22，每个样品3-4个重复．Determined on
22March,2002．Thineorfour ~ alicatesineachdetermination．
羊奶果根瘤具有吸氢酶【 01，可回收固氮过程中
放出的 Hz，重新获得能量，从而提高固氮效率。从
表 3可见，与不同成熟度的根瘤固氮活性的趋势一
样 ，成熟瘤的吸氢活性最高，幼瘤次之，衰老瘤最
低。
． 裹 3 羊奶果不同成熟度根瘤的吸氲活性
Table3 Hydrogenuptakeactivity (ptoolH2 g FW min‘ )
of ro tnod ulesat dif~entdevelopmen tal stages
tq-Materi s
幼瘤 Youngnodules O．61 O．26 O．11 O．05
成熟瘤 Mature nodules O．81 O．34 O．22 O．14
衰老瘤 Senescentnodules 0．37 0．14 0 0
2002．3．29测定，每个样品 3个重复．Determinedon29March,
20o2．Three~plicatesin eachdetermination．
维普资讯 http://www.cqvip.com
第 1期 刘育梅等：羊奶果不同发育阶段根瘤的细胞结构及固氮、吸氢活性
3讨论
在已出现有泡囊结构的植物根瘤中，泡囊都是
菌丝顶端膨大发育形成的，且大多数是在成熟根瘤
中出现。组织化学的研究表明，用四氯唑盐处理的根
瘤切片，还原产生的大量的三苯基甲酯(formazane)
结晶均集中于泡囊，证明泡囊是根瘤中还原性最高
的部位【”】，而氮分子的固定要求很强的还原条件，这
是认为泡囊含有固氮酶的缘故。Van Straden等[】习报
道，从桤木 lnus glutinos 分离的一簇泡囊，在适
当的培养条件下可显示固氮活性。Vanden等㈣用香
杨梅 (Myrica gale)内生菌接种香蕨木 (Comptonia
peregrina)，产生的有效瘤和无效瘤的最明显区别
是后者缺乏泡囊，因此可认为泡囊是固氮的场所。
王慧英等[】41根据杨梅的实验结果，也认为泡囊的大
量出现可能是提高固氮活力的标志。本文的结果表
明羊奶果的成熟瘤固氮活性较幼瘤、衰老瘤高，在
结构上最明显特征是产生了大量的泡囊。这也支持
了“泡囊是固氮场所”的结论。
Newcomb[ 用冰冻蚀刻法证明，牛奶子根瘤泡
囊的“空区”是由 12-15个薄层组成，这些薄层 由
脂类构成，在常规制样中容易被抽提，一般认为这
些脂质层是泡囊内固氮酶的防氧屏障。从本文结果
看，在羊奶果成熟根瘤的成熟泡囊中，也存在这种
“空区”。在衰老瘤的残留泡囊中，“空区”消失，可
能是由于泡囊内固氮酶的防氧屏障丧失，导致固氮
能力明显下降，甚至消失。
羊奶果成熟瘤的固氮活性较幼瘤和衰老瘤高，
且在离体后能在较长时间内维持一定水平，这除与
泡囊结构有关外，可能与其具有吸氢酶活性也有
关，因吸氢酶能回收固氮过程中放出的H 。通过对
H 的氧化，保护固氮酶免受氧的损伤，并可消除细
胞内过量H 对固氮作用的抑制[】q，从而提高固氮效
率。
参考文献
【l】WangHY(王慧英)，HuangW N(黄维南)．Theultrastructure of
endophyte and the infection thread in root nodule of E／aeagnus
cD， rtaRoxb-【A】In：YouCB，Chen ZL．AgriculturalBiotech-
nology【M】．Beijing：China Sci Techn Press,1992．787—788．(in
Chinese)
【2】Wang H Y(王慧英)，Huang W N(黄维南)．Submicroscopic struc-
toreofinfectionthreadandinfectedcellin rootnodulesofE／aeog-
n cD， rta【J】．Subtrop Plant Res Commun(亚热带植物通讯)，
1995，24(1)：1-3．(in Chinese)
【3】Li Z L(李正理)．Technology of Plant Sectioning[M]．Beijing：
Science PTess．1978．67—69．(in Chinese)
【4】Shanghai Society for Plant Physiology(上海植物生理学会)．Hand-
book of Phytophysiological Experiment[M]．Shanghai：Shanghai
Sci Techn Press，1985．259-264．(in Chinese)
【5】WangH(汪化)，SongHY(宋鸿遇)．AHruptakehydrogenasein
Rhizobium oaragdiin relationto nitrogenfixation【J】．ActaPby-
tophysiol Sin(植物生理学报)，1984，10(1)：63—71．(in Ch se)
【6】Zcng D(曾定)．The Biology ofNitrogen Fixation【M】．Xiamen：
Xiarnen UnivPres，1987．183—212．(inChinese)
【7】 Research Group of Symbiotic Nitrogen Fixation,Laboratory of
Nitrogen Fixation，Shanghai Institute of Plant Physiology (上海植
物生理研究所共生固氮组)．Investigations on sym biotic nitrogen
fixationofnon-leguminousplant I．Thefine structureofthe root
nodulesofE／aeagnus叨．ActaBot Sin(植物学报)，1977，l9(4)：
247—251．(in Chinese)
【8】WangHY(王慧英)，HuangW N(黄维南)，CaiKQ(蔡克强)，The
submicroscopic structure ofthe endophyte ofE／aeagnus conferta
Roxb_【J】Acta Phytophysiol Sin(植物生理学报)，l993，l9(1)：
6l一65．(in Chinese)
【9】0u D M (曲东 明)，Wang S(王双)，Hart S H(韩善华)．Nitro-
gen-fixing rot nodules and its Frankia~ndophyte ofHippopho~
rh~nnoides L_【J】Acta Bot Boreal-Occident Sin(西北植物学报)，
1998，18(1)：60-65．(in Chinese)
【10】 CaiKQ (蔡克强)，LanG (蓝谷)，HuangW N (黄维南)．
Nodulation and nitrogen fixation in E／aeagnu* conferta ．
Subtrop Plant Res Commun(亚热带植物通讯)，1990，19(2)：6-
10．(in Chinese)
【11】AnguloAF，VanDijkC，Quisp~1A．Sym bioticinteractionsin
non-leguminous rot nodules 【A】．In：Nutman F S．Sym biotic
Nitrogen Fixation in Plants【M】．Cambridge England：Cam bridge
University Press,1976．457—484．
【12】Van StmdenJ，AkkernzRnsADL，RoelfsenW．Nitrog~aseactivity
ofendophyte suspension derived fmm root nod ules ofAlnus，Hip—
pophae s脚 Jle andM~／*a slap．【J】Nature，1977，266：257—
258．
【13】Vanden BoschKA，Tormy JG．Host-endophyteinteraetionsin
efectivenodulesinducedbythe endophytcofMyrica gate【J】．Can
J Bot,1983，61：2898-2909．
【14】WangHY(王慧英)，HuangW N(黄维南)．Observation onthe
structureandulWastructure ofrotnoduleandnitrogen ase activity
inMytica rubra ．ActaPhytophysiol Sin (植物生理学报)，
l99O，l6(2)：153—157．(in Chinese)
【15】NewcombW，Baker D，Torrey JG．On~genyandfine structureof
efective rootnodules oftheautumnolive (E／aeagnus umbelata)
【J】．Can J Bot,1987，65：80-94．
【16】YouCB(尤崇杓)，JiangYM(姜涌明)，SongHY(宋鸿遇)．Bio-
logical Nitrogen Fixation【M】．Beijing：Science Press，1987．129—
162．(inChinese)
图版说明
图版 I
l一3光学显微镜，4-9透射电子显微镜。
l勘 瘤。示未侵染细胞 (UC)和侵染细胞 (IC)；x40
2．成熟瘤。示维管束 (VIi)：x40
维普资讯 http://www.cqvip.com
热带亚热带植物学报 第 11卷
3．衰老瘤。未侵染细胞 (UC)和侵染细胞 (Ic)都有部分解体；x40
4．幼瘤。菌体透过细胞壁 (Cw)侵入皮层细胞；x4 000
5．幼瘤。皮层细胞中可见有脂体 (L)存在；×14 000
6．成熟瘤。出现大量泡囊 (V)；x4 000
7．成熟瘤。示菌丝 (H)和泡囊(V)的双层壁之间的“空区”(ETR)；×
lO0o0
8．衰老瘤。泡囊(V)不呈双层壁结构，泡囊逐渐解体；x5 000
9．衰老瘤。示泡囊内出现空腔或内容物解体．×10 000
Explanation ofplate
PIateI
1-3 light microscope，4-9 transmission eleclron microscope．
1．Youngnodules，showinguninfectedcels COC)andinfectedcels
012)；x40
2．Maturenodules，showingvascularbundle(VB)；x40
3．Senescentnodules．Bothuninfected celsCOC)andinfectedcels0c)
aledegeneratingpar~y；x40
4．Young nodules．Frankk~penetrate cel walls(C of nodule
cortex；x4000
5．Youngnodules ．Lipidbody(L)existingin infectedcells；×14000
6．Maturenodules，showingnunlcrou$vesicles(V)：x4000
7．Mature nodules，showing the electron transparent region(ETR)
betweenthedoublewalsofhyphae(H)andvesicle(V)：×10000
8．Senescent nodules．Double walls disappear andthe vesicles 69 are
degenerating；x5 000
9．Senescentnodules，showingdegen eratedvesicles．×10000
维普资讯 http://www.cqvip.com
刘育梅等：羊奶果小同发育阶段根瘤的细胞结构及同氮、吸氢活性
LIU Yu-mei et a1．：Celular Structure of Root Nodules ofElaegn~confera
Roxb．and Nitrogen Fixation Activity
See explanation at the text
版I
Platel
维普资讯 http://www.cqvip.com