全 文 ：收稿日期： 2012–04–23　　　　接受日期： 2012–08–14
基金项目： 福建省自然科学基金项目(2010J01091)；福建省农科院创新重点项目(2007YCXZ02)资助
作者简介： 林江波，硕士，副研究员，主要从事观赏植物生物技术研究工作。E-mail: linjiangbo1976@yahoo.com.cn
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: dymttcn@yahoo.com.cn
热带亚热带植物学报　2013， 21(2)： 141~146
Journal of Tropical and Subtropical Botany
中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)为石
蒜科(Amaryllidaceae)水仙花属多年生草本鳞茎花
卉，是中国十大名花之一。其花清新淡雅，具有很
特殊的香味，是冬季室内观赏花卉的上品。戴亮等[1]
中国水仙水杨酸甲酯合成酶基因克隆与表达分析
林江波, 王伟英, 邹晖, 戴艺民*
(福建省农业科学院甘蔗研究所 , 福建 漳州 363005)
摘要： 为了解中国水仙(Narcissus tazetta var. chinensis)花香气形成的分子机理，以花发育形成相关基因的 SSH 文库获得
的 cDNA 片段为基础，利用 RACE 技术从中国水仙花朵中克隆了水杨酸甲酯合成酶基因，命名为 NtSAMT1 (GenBank No.
JX273470)，其 cDNA 全长 1323 bp，包含 1 个 1131 bp 完整阅读框架，编码 376 个氨基酸，具有 Methyltransf_7 superfamily 蛋白
保守区，与仙女扇(Clarkia breweri) SAMT 蛋白(1m6eX)的三维结构相似。系统进化树分析表明，中国水仙与粳稻的 SAMT 蛋
白亲缘关系最近。原核表达结果表明 NtSAMT1 在大肠杆菌中能高效表达。半定量 RT-PCR 分析表明，NtSAMT1 在花蕾期就
有表达，第 1 天完全开放时各部位均有表达，以雄蕊与雌蕊的表达量最高，第 8 天已检测不到表达。
关键词： 中国水仙； 水杨酸甲酯合成酶； 基因表达
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2013.02.007
Cloning and Expression Analysis of NtSAMT1 Gene from Narcissus
tazetta var. chinensis
LIN Jiang-bo, WANG Wei-ying, ZOU Hui, DAI Yi-min*
(Sugarcane Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou 363005, China)
Abstract: In order to understand molecular mechanism of floral scent formation of Narcissus tazetta var.
chinensis, based on a fragment cDNA from different florescence suppression subtractive hybridization (SSH),
the salicylic acid carboxyl methyltransferase gene was cloned from N. tazetta var. chinensis by RACE and RT-
PCR, named NtSAMT1 (GenBank No. JX273470). The full length of NtSAMT1 cDNA was 1323 bp with an
1131 bp ORF, which encoded a protein of 376 amino acids with a conservative domain of methyltransf_7
superfamily. NtSAMT1 is similar to SAMT of Clarkia breweri (1m6eX) in three-dimensional structure. The
NtSAMT1 is predicted an unstable protein. Phylogenetic analysis showed that SAMT in Narcissus tazetta var.
chinensis had close relationship to that in Oryza sativa Japonia (BAD12867). Prokaryotic expression showed that
recombinant pGEX-NtSAMT1 had highly expression in E. coil BL21. Semi-quantitative RT-PCR revealed that
NtSAMT1 could expression in all tissues of buds, the expression in stamens and pistils was the highest at first day
after blooming and its expression disappeared at the eighth day after blooming. The expression of NtSAMT1 could
be detected in scape, petal, corolla, stamen and pistil of the first day of blooming, expression of NtSAMT1 in the
first day flowers was in order as stamen, pistil > scape > petal, corolla.
Key words: Narcissus tazetta var. Chinensis; SAMT; Gene expression
142 第21卷热带亚热带植物学报
利用色谱-质谱法(GC-MS)对漳州水仙花头香的化
学成分分析结果表明，水仙花头香中含量最高的组
分是酯类，约占 38%，其次为酮类、醇类和有机酸。
黄巧巧等[2]采用活性炭吸附丝累积采集水仙花开放
过程中不同时段的活体香气成分，鉴定了 55 种香
气组分，其中萜烯类化合物有 10 种，醇类有 9 种，
烯烃类 8 种，酮、醛类 6 种，酯类 3 种，醚类 3 种，酸
类 1 种。对水仙花开放过程中香气释放的变化规
律研究表明，在花开初期香气组分寥寥无几，随着
花的盛开，其香气成分逐渐增多，到第 12 天时，鲜花
吐香量达到最高，不同的化合物，其成熟规律不同。
水杨酸甲酯(methyl salicylic acid, MeSA)是植物
内一种重要的气态甲酯分子，是花香味的主要组分
之一[3]。MeSA 是在水杨酸甲酯合成酶(S-adenosyl-
L-Met: salicylic acid carboxyl methyltransferase,
SAMT)的催化下，由 S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)提供
甲基，由水杨酸(SA)提供羧基部分而合成的。迄
今 为 止，已 相 继 从 仙 女 扇(Clarkia breweri)[4]、金
鱼 草(Antirrhinum majus)[5]、非 洲 茉 莉(Stephanotis
floribunda)[6]、蜡梅(Chimonanthus praecox)[7]等植物
中克隆到 SAMT 基因，但还未见到有关中国水仙
SAMT 基因的研究报道。我们在构建中国水仙花发
育形成相关基因的 SSH 文库，筛选克隆中国水仙
花发育相关的 cDNA 片段的研究过程中，获得一个
编码与已知植物 SAMT 氨基酸序列有较高同源性
的 cDNA 片段。为了更好地了解中国水仙花香气
形成的分子机理，利用 RACE 技术克隆了该基因全
长 cDNA 序列，并利用生物信息学方法，对其编码
产物的序列特征、理化性质等进行预测，构建了原
核表达载体并成功诱导表达，通过半定量 RT-PCR
技术分析该基因在中国水仙各器官中的表达情况，
为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
中 国 水 仙(Narcissus tazetta var. chinensis) ‘金
盏银台’商品球购自福建省龙海市九湖镇，用清水
培养。分别取不同花期的花，用液氮冻结后，置
于 –70℃冰箱中保存备用。
大 肠 杆 菌(Esherichia coli)菌 株 HB101、 BL21
(DE3)，原 核 表 达 载 体 pGEX-4T-1 由 福 建 省 农 业
科学院甘蔗研究所基础实验室保存。克隆载体
pMD19-T，购自宝生物工程(大连)有限公司。
Ex Taq DNA 聚合酶、 BamH I、 Xho I、 Prime-
ScriptTM Reverse Transcriptase、 RNAiso Plus 和 5′-
Full RACE Kit 购自宝生物工程(大连)有限公司。
DNA 胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服
务有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有
限公司合成。
1.2 总RNA的提取与cDNA的克隆
采用 RNAiso Plus 进行总 RNA 的提取，用超
微量紫外可见光分光光度计(ND-1000)测定 260 nm
和 280 nm 下的吸光值，计算 RNA 纯度和浓度。用
PrimeScriptTM Reverse Transcriptase 进行 cDNA 第 l
链的合成。
根据从 SSH 文库中获得的 cDNA 序列，设计 5′
RACE 引物 SAMT5：5′-GCCTTTACTTCTTCCATA-
GC-3′，3′ RACE 引物 SAMT3：5′-GATAGGAAGGG-
ATGATGTGC-3′ 和 3′ adaptor 引物：5′-CTGATCTA-
GAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。
5′ RACE 按照 5′-Full RACE Kit 说明书操作，Inner
PCR 扩增程序为：94℃预变性 5 min，然后 94℃变性
30 s， 50℃退火 30 s， 72℃延伸 1 min，共 30 个循环，
最后 72℃延伸 10 min。3′ RACE 扩增程序为：94℃预
变性 5 min，然后 94℃变性 30 s， 50℃退火 30 s， 72℃
延伸 1 min，共 30 个循环，最后 72℃延伸 10 min。
PCR 产物经 1.2% 琼脂糖凝胶电泳后，切胶回
收目的片断，检验产物胶回收情况。将 PCR 胶回
收产物连接到 pMD19-T 上，转化大肠杆菌，挑选单
克隆进行扩繁，对单克隆进行 PCR 验证，挑选阳性
克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，
测序结果用 DNAMAN V 6.0 进行拼接。
1.3 序列分析与比较
将拼接结果通过 BLAST X 和 BLAST P 搜索
NCBI 的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列相似分析
及氨基酸保守结构域预测；用 ProtParam 对蛋白质进
行理化性质分析；登陆 http://swissmodel.expasy.org/，
使用自动搜索模式预测蛋白质的三级结构[8–10]。
1.4 原核表达载体的构建及表达
根 据 拼 接 结 果，设 计 1 对 引 物：SAMET1：5′-
GGGGGATCCATGAAGGTTGAAGTTGATC-3′；
SAMET2：5′-GGGCTCGAGTTATACGACATTAAA-
第2期 143
CATC-3′。在引物上下游分别引入 BamH I 和 Xho I
酶切位点，用于扩增 SAMT 基因完整开放阅读框。
PCR 扩增条件如下：94℃预变性 5 min，然后 94℃
变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，共
30 个循环，最后 72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物
和原核表达载体 pGEX-4T-1 经 BamH I 和 Xho I 双
酶切，回收基因和载体片段。将基因片段和 pGEX-
4T-1 载体片段用 T4 DNA 连接酶连接过夜，连接产
物转化感受态 HB101，涂在含有 Amp 的 LB 平板
上，挑取单克隆进行扩繁，对单克隆进行 PCR 验证
后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
将鉴定为阳性的重组原核表达质粒转化大肠杆菌
Esherichia coli BL21 (DE3)，用 IPTG 诱导表达，经
SDS-PAGE 检测，考马斯亮蓝 R-250 染色检测蛋白
表达情况。
1.5 基因表达
以等量的总 RNA 合成 cDNA 第一链，运用半定
量 RT-PCR 检测基因的表达情况。NtSAMT1 引物为
SAMT3 和 SAMT5，产物长度 471 bp，以中国水仙
ACTIN 基因(本实验室克隆，未发表)为内参，引物
分别为：ACT3: 5′-GCGGGGCATTTTGACTTTGA-3′
和 ACT4: 5′-GAGAACCTCTGGGCATCGGA-3′，
产物长度 601 bp。PCR 扩增程序为：94℃预变性
5 min，然后 94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃
延伸 40 s，26 个循环。重复 3 次，使结果一致。
2 结果和分析
2.1 5′ RACE和3′ RACE
以提取的 RNA 为模板，参照 5′-Full RACE Kit
说明书进行第一链合成，用引物 SAMT5 和试剂盒
提供的引物 5′ RACE Outer Primer 和 5′ RACE Inner
Primer 进行 PCR；用随机引物反转录的 cDNA 为
模 板，用 引 物 SAMT3 和 3′ adaptor 进 行 PCR。 将
PCR 产物用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，5′ RACE
在 900 bp 左 右 有 1 条 亮 带(图 1: A)，3′ RACE 在
900 bp 左右有 1 条亮带(图 1: B)。PCR 产物回收连
接、转化及 PCR 验证后送上海生工生物工程技术服
务有限公司测序，分析测序结果显示获得 5′ 末端和
3′ 末端。
将 3′ RACE 和 5′ RACE 的 测 序 结 果 用
DNAMAN V6.0 进行序列拼接及开放阅读框架分
析。 结 果 表 明，所 获 得 的 cDNA 全 长 有 1323 bp
(GenBank No. JX273470)，包含 1 个 1131 bp 完整阅
读框，编码 376 个氨基酸，5′ 末端非翻译区 58 bp，3′
末端非翻译区 134 bp，命名为 NtSAMT1。
2.2 开放阅读框的克隆
用随机引物反转录的 cDNA 为模板，用引物
SAMET1 和 SAMET2 进行 PCR 扩增，电泳结果显
示在 1200 bp 左右的地方有一条亮带，大小与拼接
得到的 NtSAMT1 完整开放阅读框大小一致(图 1:
C)。PCR 产物回收连接、转化及 PCR 验证后送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果
与拼接结果一致，获得带 BamH I 和 Xho I 酶切位
点的 NtSAMT1 的 ORF。
2.3 生物信息学分析
利用 NCBI 的 BLAST P 在蛋白保守区数据库
(Conserved Domain Database, CDD)对 NtSAMT1 基
因进行蛋白保守区预测，结果有 1 个与该基因匹
配 的 蛋 白 保 守 区，为 Methyltransf_7 superfamily，
E 值 为 9.47E-109；使 用 BLAST X 软 件 对 推 导
图 1 PCR 电泳结果。M. 分子量标记； A. 5′RACE； B. 3′RACE； C. 开放阅读框。
Fig. 1 PCR products by electrophoresis. M. DNA marker (100–2000); A. 5′ RACE; B. 3′ RACE; C. ORF.
林江波等：中国水仙水杨酸甲酯合成酶基因克隆与表达分析
144 第21卷热带亚热带植物学报
的 NtSAMT1 氨基酸序列进行同源性检索，结果
表 明， NtSAMT1 与 粳 稻(Oryaz sativa ‘Japonica’,
BAD12867)、蜡 梅(ABU88887)、大 豆(Glycine max，
ACF33514)的同源性均为 66%；在 http://swissmodel.
expasy.org/上 对 NtSAMT1 蛋 白 质 的 三 级 结 构
进 行 预 测，结 果 表 明， NtSAMT1 与 仙 女 扇 的
SAMT(1m6eX)蛋白质的三维结构相似，氨基酸序
列同源性为 40.69%；利用 MEGA 软件将 NtSAMT1
推导的氨基酸序列与其他 12 种物种的 SAMT 进
行聚类分析(图 2)，结果表明， NtSAMT1 与粳稻的
亲缘关系最近，同处一个分枝上。
Protparam 预 测 表 明，该 蛋 白 的 分 子 量 为
42.49 kD，理 论 等 电 点 为 5.06，负 电 荷 的 氨 基 酸
残基数(Asp + Glu)为 52，正电荷的氨基酸残基数
(Arg + Lys)为 34；脂肪系数为 82.87，总平均疏水性
为 –0.104，不稳定系数为 45.53，是不稳定的蛋白。
PROSITE 在 线 分 析 结 果 表 明，NtSAMT1 推
导的氨基酸序列中有一系列与蛋白修饰调控有
关的功能位点，包括 4 个 N-酰基化位点(14 ~ 19、
101 ~ 106、 133 ~ 138、 172 ~ 177)，2 个 N-糖基化
位 点(23 ~ 26、 366 ~ 369)，5 个 酪 蛋 白 激 酶 Ⅱ 磷
酸化位点(25 ~ 28、 41 ~ 44、 232 ~ 235、 249 ~ 252、
340 ~ 343)，3 个蛋白激酶 C 磷酸化位点(41 ~ 43、
48 ~ 50、 86 ~ 88)。
2.4 原核表达
重组原核表达质粒 pGEX-NtSAMT1 转化入大
肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)，用 1 mmol L–1 IPTG 诱
导 6 h 后，经 SDS-PAGE 电泳及考马斯亮蓝染色。
结果(图 3) 表明，携带重组质粒 pGEX-NtSAMT1 的
E. coil 菌株中出现 1 条约 68.5 kDa 的蛋白条带，而
未诱导的菌株中无相应蛋白条带。由于融合蛋白中
GST 编码的蛋白约为 26 kDa，因此，所表达的蛋白
条带大小与 NtSAMT1 预测的 42.49 kDa 基本一致。
2.5 表达分析
用半定量 RT-PCR 法对 NtSAMT1 基因在中国水
仙不同花期的表达进行分析，结果表明，NtSAMT1
在花蕾中就有表达，完全开放第 1 天的表达量最高，
第 2 天开始表达量略有下降，到第 8 天已检测不到
表达。同时，NtSAMT1 在完全开放第 1 天的花葶、
花瓣、副冠、雄蕊和雌蕊等部位中均有表达，但表达
图 2 NtSAMT1 与己知 SAMT 基因氨基酸同源性比对树状图
Fig. 2 Phylogenetic tree based on the amino acid of NtSAMT1 and twelve SAMT alignment.
第2期 145
量存在差异，以雄蕊与雌蕊的表达量最高，其次是
花葶，花瓣与花冠的表达量最低。而 ACTIN 基因
在开花的各时期的表达量基本一致(图 4)。
3 讨论
MeSA 是 植 物 花 香 味 的 主 要 成 分 之 一，在
SAMT 的催化下，由 SAM 提供甲基，SA 提供羧基
部分合成。SAMT 属于 Methyltransf_7 superfamily
成员。对仙女扇 SAMT 蛋白的三维结构已有详
细的研究[11]。本研究从中国水仙的花朵中克隆
到了 NtSAMT1 基因，推导的氨基酸序列具有一个
Methyltransf_7 superfamily 保守区，其蛋白三维结
构与仙女扇(1m6eX) SAMT 蛋白的三维结构相似。
因此，可以推断其属于水杨酸甲酯合成酶基因。
Dudareva[12]等研究了仙女扇花朵苯环型酯类
图 3 NtSAMT1 在大肠肝菌中表达的 SDS-PAGE 电泳。M. 分子量
标记； 1. 诱导前； 2. 诱导后。
Fig. 3 SDS-PAGE of NtSAMT1 expressed in Esherichia coli. M: Marker;
1. Before induction; 2. After induction.
图 4 NtSAMT1 基因的表达。1. 花蕾； 2 ~ 12. 完全开放的第 1 ~ 11 天；13. 花瓣；14. 副冠；15. 雄蕊；16. 雌蕊；17. 花葶。
Fig. 4 Expression of NtSAMT1. 1: Bud; 2 – 12. Blooming from the first to eleventh day; 13. Petal; 14. Corolla; 15. Stamen; 16. Pistil; 17. Scape.
的释放规律，水杨酸甲酯在花开放 12 ~ 24 h 的释
放量达到最高，第 2 天的前 12 h 还维持高水平，此
后开始下降；乙酸苄酯的释放高峰是在开放的 12 ~
24 h；苯甲酸苄酯的释放高峰期是在开放的 24 ~
36 h；花瓣是水杨酸甲酯和乙酸苄酯的主要释放器
官，雌蕊是苯甲酸苄酯的主要释放器官。NtSAMT1
在花蕾期就有表达，完全开放的第 1 天表达量最
高，第 2 天表达量开始稍微下降，到第 8 天已没有
表达，可见 NtSAMT1 在花期的表达模式与花朵香
气的散发过程是基本一致的。NtSAMT1 在第 1 天
完全开放的雄蕊与雌蕊的表达量最高，这可能与吸
引昆虫授粉有关[13]。
SA 是 苯 甲 酸(BA)的 一 种 衍 生 物，SAMT 并
非特异地甲基化 SA。仙女扇的 SAMT 相对特异
地甲基化 SA，也会甲基化 BA 及其它衍生物，但对
BA 及其衍生物的甲基化效率较低[4,14]。Pott 等[14]
的 研 究 表 明，非 洲 茉 莉(Stephanotis floribunda)的
SAMT 对 SA 甲基化活性是 BA 甲基化活性的 9
倍，但花朵散发出的苯甲酸甲酯的量是水杨酸甲酯
的 15 倍，这与体内含有的 SA、BA 的总量有关，
S. floribunda 花瓣中 BA 含量是 SA 含量的 1000 到
2000 倍。NtSAMT1 表达量与其编码的酶活性间的
关系及对 SA 的甲基化活性的影响还有待进一步
研究。
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