全 文 ：热带亚热带植物学报 2002，10(I)：74—76
Jounm／ Tnq,ical anti Subtropi~．al Botany
硝酸银对桑树遗传转化的作用(简报)
钟名其 楼程 富 谈建中 周金妹 张有做
． 汕头大学理学 院生物学系，广东 汕头 5I 5063；2浙江大学蚕学系，浙江 杭州 310029；
3苏州大学蚕桑 学院，江苏 苏州 215I 51)
摘要：调查了硝酸银对农杆菌介导的桑(M#rus alba L)品种“新一之濑”遗传转化的作用。在抗性筛选培
养基中添加 2 mg 硝酸银，桑口t盘褐化死亡率蹴少 7．2％，抗性芽分化率增加 3 9％，外源基因转化频率增
加 9 6％，“假阳性”转化体减少 42 5％。感染收杆菌的桑口l盘经 MS培养基培养、农杆菌液体培养和固体培
养基上划线培养等 实验证实 ，硝酸银对丁程农杆菌 LBA4404的生长具有抑制作 用 ，造可能是提高桑树转
化频率 的原因之一。
关键词 ：桑树 ；遗传转化 ；根癌农杆菌 ；硝酸银
中图分类号 ：Q943．I 文献标识码 ：A 文章编号 ：1 005—3395(2002)0I一0074—03
The Efect of Silver NRrate on Gelletic Transform ation in
W hiteM ulberry(Morus albaL．)
ZHONG Ming．qi LOU Cheng．fu TAN Jian—zhong ZHOU ing-mei ZHANG You-ZUO
(I D J) f m of Biolo~, Colege，Shrmtou~ ivenity Shantou 5I 5063，China；2 Dellar~mem of~ricuhure，
Zh~TiImg nh 州 岍，Hangzhou 310029 China；3 s c l l Ser~ldlure，s u n 柳．Suzhou 21 5I 5I，China)
Abstract：To determine the eriect ofsilver nitrate on genetic transformation,Agrobocrerium tumefacie~一
mediated 1eaves ofMorua al ev Shiniehinose were used as explants cultured on kanamycin*resistant
screeningmedium (MSbasalmedium supplementedwith 200—400mgL carbenicilinand 30—40mgL-‘
kanamycin)，to which 2 mg L。silver nitrate was added．The results showe．d that the rate ofbrowning leaf
discs infected with Agrobaz．terium tumefocien．~strain LBA4404 decreaced by 7 2％ ，regeneration
frequency of kanamycin—resistant buds increased by 3．9％ ． transformation frequency of Gly gene
increased by 9 6％ ． and the false positive transformants as detected by PCR decreased by 42．5％ ．The
experiments demonstrated that silver narrate had inhibiting effect on the growth of strain LBA4404，
which might increase tran sfonnation frequency in white mulberry．
Key words：Mulberry；Genetie transformation；,4grohacterium ￡um ， n ：Silver nitrate
近些年 ，将硝酸银应用于植物 (尤其是芸苔属)遗传转化研究 ，以提高外源基因的转化效率已
有若干报道 ，但一般都从硝酸银可促进这些植物组织培养不定芽分化来解释 41 笔者也曾证实 ，在
分化培养基添加 1-2 mgL-。硝酸银 ，对桑树 叶片培养不定芽分化具有明显促进作用 ，但 有关硝酸
银对农杆菌介导的桑树等多年生木本植物的遗传转化有何影响尚不清楚。本研究在完善桑叶片培
养植株冉生体系的基础上 ，探讨了硝酸银对农杆菌介导的桑叶盘遗传转化的影响，并就其机理进
行初步分析 ：
收稿 日期：2001—0l—l6 接受 日期 200l一05—28
基金项 目：国家自然科学基金项 目(39570556)
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第 1期 钟名其等：硝酸银对桑树遗传转 化的作用
1 材料和方法
外植体的准备 桑(．11or~ dbaL)品种“新一之濑”试管苗由浙江大学蚕学系保存。实验时，
选取试管苗上大小均一的幼嫩叶片，去除叶柄，切成 O．5 cm×1 cm叶盘作为转化的起始外植体
工程农杆菌 、培养基和试剂 工程农杆菌 Agrobacterium tumefacien．~strain LBA4404的 Ti
质粒含 kan(卡那霉素)抗性筛选标记和外源基 因 Gly(大豆球蛋 白Alablb亚基基因) 。桑叶盘转
化所用培养基与文献 相同，其中筛选培养基 MS3配方为：MS+BA 5．0 mg L。+NAA O．2 mg L +
Cab(羧 繁青霉素)200—400mg0。+kan 30-40mgL。+AgNO3 0-2mgL一。AgNOhkan和 Cab为
Sigma公司产品，其余均为国产分析纯试剂。
农杆菌活化和液体培养 从 LB平板上，挑LBA4404单菌落 ，接种于 5 ml LB液体培养基，
于 28+1 ．1 5O rrain 黑暗条件下振荡过夜培养，即为活化菌液 液体培养实验时，取 3 l活化菌液
分别接种于含不同浓度 (0—16mgL-。)硝酸银的 5ml LB液体培养基 ，振荡培养 ，每隔 2-4 h，肉眼观
察并记录培养基开始出现混浊的时间。
转化、筛选和检测 取活化菌液感染 5 min的桑叶盘 用灭菌滤纸吸去 叶盘表面多余菌液 ，
于过渡培养基中共培养 3 d，再接种到筛选培养基(含硝酸银 O一2 mgL )，每周更换一次 ，直至筛选
出抗性芽 将抗性芽繁殖和生根培养 ，并进行 PCR检测
桑叶盘表面农杆菌的生长 将农杆菌感染并吸去多余菌液后的桑叶盘直接接种于添加不
同浓度 (0-4mgL )硝酸银的分化培养基中，每个浓度接种 3瓶 ．每瓶 8—10片叶盘 ，于 28~C光照培
养箱中培养 ．调查叶盘表面出现微菌落的情况。
2 结果和分析
2．1 硝酸银对农杆菌介导的桑叶盘遗传转化的影响
桑叶盘褐化和抗性芽分化结果如表 1。筛选培养基中添加 2 mg L。硝酸银，褐化乃至死亡的叶
盘比未添加硝酸银减少 7．2％，抗性芽分化率增加 3．9％ 可见 ，硝酸银不仅能减轻农杆菌感染和抗
性筛选剂 kan对桑叶盘造成 的褐化死亡现象 ，而且对抗性芽分化也有一定促进作用 。此外调查还
发现硝酸银处理的抗性芽分化时间 比未添加硝酸银 的缩短 5—7 d。
表 1硝酸银对农杆菌感染后曩叶盘存活和抗性芽分化的影响
Table l Efect ofA O10nthe survival ofwhitemulberryleafdiscsinfected
with Agro1)tu teril~m and 0n kanamycin-resistant bud regeneration
．¨ 骨 {；lJ 乔 7和 28 d捌置 Determined after 7 and 28 days ofculture on MS medium respective
⋯ PCR捡测 Detected byPCR；括号内的数宁 勾百分章 Figuresin p~entheses are percentage；
所有数据为两次宴验的平均 All data a他the mean oftwo experiments．
对上述转化所获得 的抗性芽进行 PCR检测证实 ，添加硝酸银的外源基因转化频率比对照提高
9．6％．且“阳性”转化体的比例达 77．8％(14／18)．比对照区 35．3％(6／17)高 42．5％。可见，添加硝酸银
后“假阳性”转化体的比例大大减少。
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热带亚热带植物学报 第 】0卷
2．2 硝酸银对桑叶盘表面农杆菌生长的影响
根据叶盘表面出现微菌落的时间调查(表2)，未添加硝酸银区，叶盘培养 3 d就有微菌落出现，15 d
后，所有叶盘均长出微菌落；当添加 l mgL-。硝酸银时，微菌落开始出现的时间略有推迟(4d)，培养 15 d
后，含微菌落叶盘比未添加硝酸银时减少 21．4％；而添加 2mgL" 以上硝酸银时，微菌落出现时间推迟了
9—11 d，培养 l5 d后 ，含微菌落叶盘少于 1／3(28．6％)。可见硝酸银可延缓农杆菌感染后桑叶盘表面微菌
落的出现、且浓度大于 2mgL-。时，硝酸银对LBA4404的生长具有较强抑制作用
表 2 硝酸银对 桑叶盘表面农杆菌生长 的影响
Table 2 Efect ofAgNO onthe gro~th ofAgrob rutsrlum the surface ofwhitemulberryleafdiscs
做菌落叶盘 养 l5 d调 盘．括号内的数字为百分率 No ofleafdls∞withlitle一。。Ionywere counted
after】5 days ofculture 0n diferentiation medium．Figures in parentheses a percentage
2．3 硝酸银对液体培养农杆菌生长的影响
农杆菌液体培养时培养基开始出现混浊的时间，除 l mg L 硝酸银处理的培养基开始混浊的
时间与对照相同(8±2 h)外，其余浓度开始混浊时间都不同程度推迟(8-88 h)．且硝酸银浓度越高 ，
开始 出现混浊的时间越迟。可见硝酸银对液体培养 LBA4404的生长具有抑制作用，硝酸银浓度越
大，抑制作用越明显。
3讨论
在筛选培养基中添加 2mgL 硝酸银 ，不仅可减少桑口I-盘褐化死亡 ．促进抗性芽分化 ，而且还
能提高外源基因转化频率，尤其能减少“假阳性”转化体的比例 此外，抗性芽分化时间也缩短 5—
7 d。说明硝酸银对桑树遗传转化确有促进作用，这与油菜 、诸葛菜 】、甘蓝 等植物的报道一致。推
测硝酸银这一作用在双子叶植物中具有普遍性 ．但对单子叶植物的效果如何尚需进一步论证 。
周冀明等曾发现硝酸银对农杆菌 A208se生长有抑制作用lr．本实验也证实它对农杆菌 LBA4404
的生长具有抑制作用 我们推测硝酸银 的作用在于抑制了叶盘表面农杆菌细胞的活力 ．继而减轻
了农杆菌大量生 长对叶盘过敏性反应造成 的褐化死亡现象 ，使得叶盘生长和分化能力增强 ，从而
提高转化频率 但硝酸银对遗传转化是否有直接影响尚有待进一步研究。
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