全 文 ：热带亚热带植物学报 2003，l10)：15—19
Journd of Tropical and Subtropical Botany
简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选
余 艳 陈海山 葛学军水
(中国科学院华南植物研究所，广东 广州 510650)
摘要：以豆科沙冬青 mmopiptanthus mongolicus)的基因组 DNA制备 ISSR-PCR模板。通过对聚合酶链式反应(PER)
体系中模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP的用量、Taq酶的含量以及退火温度梯度进行试验，探讨筛选出清晰、多态性
高、可重复性好的ISSR引物的 PCR反应条件 。用 100个 ISSR引物进行了PCR扩增，筛选出效果较好的 l5个引物，
得到 121个位点，其中43个多态位点，多态位点比例为 36％。
关键词：ISSR；引物筛选；沙冬青
中圈分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：lo05—3395(2003)01-0015—05
Optimization of Experiment Conditions and Primer
Screening th ISSR M arkers
YU Yan CHEN Ha i—shan GE Xue—jun’
(South China Institute of Botany,the Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：A mmopiptanthus mongolicus(Leguminosae)were subjected to ISSR(Inter-simple sequence repeat)-PCR
analysis in order to investigate the genetic diversity within an d among populations．Genomic DNA ofA．mongol／cus
wasextracted astheISSRtemplate，andthe influencingfactorsofISSRwere studied an dthe experimentparameters
were optimized．By adjusting template DNA concentration,Mg concentration，dNTP and Taq polymerase contents,
an d annealing temperature，the PCR am plifcation conditions were optimized．The optimal experimen t conditions
were as folow：20 u l system containing 20 ng 1．t l～template，l0 mmol／L Tris-HCl H 9．0)，50 mmol／L KCI，
0．1％ Triton X 100，2．75 mmol／L M gCI2，0．15 mrnol／L dNTP，2％ formamide，200 nmol／L primer,1．5 U Taq
polymerase．W池 a MJ thermal cycle，optimal am plification program was l cycle of5 min at 94℃ ；35 cycles of
30 S at 94~C，45 S at 46-56~(3，an d 1．5 min at 72℃ ；l cycle of7 rain at 72~C；30 rain at 4~C，using block control
style．One hundred ISSRprimers were used to screen the suitable primers for assessing the genetic diversity ofA．
mongolicus． ofwhich 15 ISSR primers、Vitl1 high resolution an d multiple polymorphic ban ds were screened． Th e
total 121 ISSRban ds were am plified、^，itl1 15 primers．an d produced 43 polymorphic ban ds ．
Keywords：ISSR；Primer screening；Ammopiptanthus mongolicus
广泛存在的真核生物的简单重复序列 (Simple
sequence repeat，SSR)指纹，分散分布于整个基因
组。SSRDNA是短的、串联的简单重复序列，它的组
成基元是 l一6个核苷酸，其串联重复的数 目是可变
的而且呈现高度多态性，例如 (CA)n、(GAG)n、
(GACA)n等【“。Zietkiewicz等田提 出了锚定 SSR
的新策略，在 SSR的3’端或 5’端锚定 1-4个简并
碱基，避免了 SSR在基因组上的滑动，大大提高了
收稿日期：2002-07-02 接受日期：2002-11-27
’通讯作者 Correspondingauthor
聚合酶链式反应 (Polymcrase chain reaction，PCR)
扩增的专一性。这种 SSR指纹是用 SSR为引物来
扩增重复序列之间的区域，被称为简单重复序列区
间，又称为Inter-SSlL简称 ISSR。
ISSR分析技术操作简单，只需微量的DNA模
板就可进行分析。目前 DNA直接测序在尚未能大
规模开展的情况下，ISSR分析可为研究者快速高效
地提供基因组位点的多态性资料。ISSR标记技术和
RAPD原理比较相似，不同之处在于 ISSR所用引
物序列来源于简单重复序列区域，比随机扩增的多
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l6 热带亚热带植物学报 第 11卷
态 DNA(RandomamplifedpolymorphicDNA,RAPD)
引物序列长，退火温度较高p一。Qian等人[61用 RAPD
和 ISSR标记检测了疣粒野生稻(Oryza granulata)的
居群遗传结构，发现 ISSR标记比RAPD检测多态
性更为灵敏，反应系统更为稳定。ISSR技术以其操
作简单、成本低、快速、灵敏、检测多态性能力强、所
需 DNA模板的量少而倍受青睐，已成功地运用于
居群生物学的研究 q，品种鉴定 21，物种的分类系
统学比较【” 日，并作为构建遗传图谱的工具 " q。
运用 ISSR标记技术时，由于每个引物并不适合
于所有物种，而且，不同引物所要求的反应条件也
不同，因此对引物的筛选和反应条件的优化是非常
必要的。筛选出多态性强、可重复性好的引物是整
个实验成功的关键。本文以珍稀濒危植物沙冬青
(Ammopiptanthus mongolicus)的 DNA为模板 ，探讨
ISSR引物的筛选和反应条件的优化。
1材料和方法
1．1 实验材料
在内蒙古、宁夏地区采集沙冬青 mmopiptanthus
mongolicus)嫩叶，置变色硅胶中干燥保存。采用改进
后的CTAB微量法刚，提取总 DNA。选取具有地理
代表性的 6个居群(内蒙古地区4个居群，宁夏地区
2个居群)，每个居群取 2个个体，共 l2个个体的基
因组DNA作为模板，筛选具有多态位点的引物。100
个ISSR引物购自加拿大哥伦比亚大学(University of
Britsh Columbia，Set No．9，No．801-900．)。
1．2 PCR反应及其电泳
PCR反应在 PTC-200(MJ Research)PCR仪上
进行。ISSR-PCR反应程序：94℃ 5 min，1个循环；
94~C 30 S’50oC(46~C-56~C不定)45 S’72℃ 1．5 min,
35个循环；72~C 7 min，1个循环；4oC 30 min终止反
应。
Taq polymerase选用威佳科技有限公司产品。
PCR扩增产物在 1．5％的琼脂糖凝胶上电泳分离，
以上海生工生物工程有限公司 100 bp DNA ladder
(100-1 000 bp)为分子标记，溴化乙锭 (EB)染色显
带。DNA片段通过计算机凝胶成像系统(LabWorks
Software Version 3．0；UVP，Upland，CA 91786，USA)
观察、记录。
1．3 实验设计
参照 Ge&Sun 的 ISSR·PCR反应中各成份的
含量，对可能影响引物清晰度和多态性的因子：DNA
模板的含量，M 浓度，dNTP和 Taq酶含量，退火
温度，可重复性等以 3个较为通用引物(809，825，
842)为代表，进行了交叉实验。对 PCR反应体系进
行优化。以 100个 ISSR引物进行筛选并进行可重
复性试验，筛选能扩增出清晰的、可重复的且可产
生 4-15个多态性位点的引物。具体方法见结果部
分。
2 结果和分析
2．1 DNA模板浓度优化
DNA模板的含量是制约扩增产物得率及特异
性的一个重要因子，模板含量过低，分子碰撞的机
率低，偶然性大，扩增产物无或不稳定：模板含量过
高，又会相应增加非特异性产物的扩增。本实验在
O．5一l00 ng 1_ 之间设置了DNA模板含量梯度，
参照 Ge&Sun~J的ISSR·PCR反应中各成份的含量
(Primer 200 um ol／L，Taq 1．5 U，dNTP 0．1 mmol／L，
M 2 mmol／L)，退火温度为 50~C，用 3个引物
(809，825，842)进行扩增实验，结果见表 l。
表 1 模板浓度对 PCR结果的影响
Table 1 Efect oftemplate concentration O11 PCR results
引物 模板浓度 Template concentration(ng u
Primer 0
．5 3 6 10 20 60 100
实验发现，沙冬青 ISSR反应对 DNA模板含量
的许可范围较大，3—60 ng u l 的模板含量均扩增出
了基本相同的带型。当模板含量低于 3 ng ul 时无
扩增反应，高于 100 ng ul 时扩增反应不稳定。
2．2 M 浓度
Mg2+浓度是影响PCR结果的重要变量之一。
Taq DNA聚合酶是 M 依赖性酶，对 M 浓度非
常敏感。选择合适的Mg2+浓度，对PCR反应至关重
要。引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受
二价阳离子的影响，特别是其中的Mg2+浓度能影响
反应的特异性和扩增片段的产率[21。在一般的PCR
反应中，1．5-2．0mmol／LM 是比较合适的[21。我们
参照 Ge&Sunt9j的 ISSR—PCR反应中各成份的含量
(Primer 200 nmol／L，template 20 ng ul”，Taq 1．5 U，
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第 1期 余艳等：简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选 17
dNTP 0．1 mmoFL)，设计了 Mg2 浓度梯度 ，反应 中
M 浓度及实验结果见表 2。
表 2 M 浓度对 PCR结果的影响
Table2 EfectofMg2 concentrationonPCR results
引物
Primer
Mg2 (mmol／L)
1．5 2 2．375 2．75 3．125 3．5 4．5
8O9 一 +／一 + +十 一 一 一
825 —- —- —- —- —- —- —-
842 一 +／一 + +十 一 一 一
SymbolsareasinTable 1
不同的引物，不同的物种，对反应体系中Mg2
浓度要求皆有可能不同。本实验发现 2-2．75 mmol／L
的 Mg2 浓度都扩增出了清晰的带，但 2 mmol／L条
件下扩增带的产率不及 2．375和 2．75 mmol／L。而
2．375 mmol／L重复性不及 2．75 mmol／L，但可作为一
个候选梯度。低于 2 mmol／L或高于 3．125 mmol／L
时无扩增产物。
2．3 dNrIP和 Taq酶含量
底物 dNTP浓度过高，会导致聚合酶错误的掺
入，浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因 dNTP
过早消耗而使产物单链化，影响扩增效果。在 PCR
反应中，dNTP浓度应在 0．02—0．2 mmol／Lt2：~。本研究
设置了0．1、0．15、0．2 mmol／L 3个浓度梯度，结果表
明，0．1-0．15 mmol／L的dNTP含量均有扩增产物。在
0．1 mmol／L时，PCR反应的稳定性不及 0．15 mmol／L。
引物 809，842在 dNTP浓度为 0．15 mmol／L时扩增
产物效率最高，而 825无扩增。
在PCR反应中，Taq酶的使用量也是影响实验
的一个重要因素。使用高浓度的 Taq酶不仅成本过
高，而且容易产生非特异性扩增产物；Taq酶浓度过
低则会导致产物的合成效率下降。一般随机扩增反
应中，Taq酶的用量在 0．5-5 U之间[221。本实验设置
了 1 U、1．5 U、2 U、3 U4个 Taq酶含量梯度。结果表
明在 20 u l的反应体系中使用 1-3 UTaq酶含量均
有扩增产物出现，但高于 2个单位时，非特异性扩
增增强，1．5 U时扩增反应最佳。 ．
2．4 退火温度
根据上述 4个单位因子对沙冬青 ISSR实验结
果的影响程度，确定了PCR反应中各成份的基本含
量(Primer 200 nmol／L；template 20 ng la l- ；Taq 1．5 U；
dNTP 0．15 mmol／L；Mg2+2．75 retool／L)。但是引物
809，842的PCR扩增还存在着弱带、弥散背景较为
严重等问题。这种现象可能是由于退火温度均取
50℃造成的。引物碱基序列长短的不同使得引物的
退火温度也不尽相同。本研究根据前人的经验以及
Tm=4(G )+2(A+T)伫习引物退火温度的计算公式
设计了退火温度梯度反应，结果见表 3。
表 3 退火温度对 PCR结果的影响
Table 3 EfectofannealingtemperatureOilPCR results
引物
Primet
退火温度 Annealingtem perature(℃)
46 48 50 5l 52 53 56
809 一 十+ + 一 一 一 一
825 —- —- —- —- —- —- —-
842 一 + +十 一 一 一 一
Sym bolsareas inTable 1
根据 Tm=4(G )_卜2(A+T)公式计算出了引物
809，825，842的退火温度分别为 52℃、50~C、56~C，
但是 PCR反应的效果并不理想。在本实验中引物
809的退火温度为 48~C时扩增产物清晰，多态性
强：在 46、51、52、53、56~C时无扩增；在 50~C时稳定
性不如48~C。而842的最佳退火温度则是50~C，在
48~C时亦有较强的扩增。
2．5 对沙冬青的扩增
至此，PCR反应的条件已基本优化完全并固定
下来。其 20 u l的反应体系为：DNA模板 20ng ur ，
10 mmol／L Tris-HCI(pH 9．0)，50 mmol／L KCI，0．1％
Triton xl00，2．75 mmol／L M gCI：,0．15 mmol／L dNTP，
2％formamide，200nmol／Lprimer，1．5个单位 Taq
酶。由此反应体系筛选加拿大哥伦比亚大学提供的
100个引物，经最佳退火温度的调试，可重复性试验，
共筛选出 15个扩增带数大于 4、条带清晰、多态性
强、可重复性好的沙冬青 ISSR引物，从中得到 121
个 ISSR标记位点，其中 43个多态位点，多态位点
比例为 36％。平均每个引物扩增 8．07条带。15个引
物检测沙冬青的遗传多样性研究中，所产生的ISSR
标记位点清晰，反应系统稳定，检测多态性能力较
强。可用于沙冬青的正式 ISSR扩增 (表 4)。图 1、
2分别是引物 809、842对居群内蒙古杭锦旗磨石沟
和居群宁夏中卫沙坡头沙冬青的ISSR扩增带型。
3讨论
PCR扩增容易受到诸多因素的影响：如 DNA
模板的浓度与纯度，引物与 dNTP的用量、Mg2+的
浓度、扩增程序与循环周期等 【l1，所以需要优化固定
PCR反应的各种条件，以期实验得到较好的重复。
对于给定的引物和模板，PCR扩增的条带数在一定
程度上可以通过控制反应条件而得到调控。
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l8 热带亚热带植物学报 第 l1卷
图 l引物 809对内蒙古杭锦旗磨石沟 21个沙冬青个体扩增的ISSR带型
Fig．1 ISSR profiles generated by primer 809 from population in Moshigou，Hangjinqi，Inner Mongolia
M：100bpladderDNAmarker
图 2引物 842对宁夏中卫沙坡头 21个沙冬青个体扩增的 ISSR带型
Fig．2 ISSR profiles generated by primer 842 from population in Shapotou，Zhongwei，Ningxia
M ：100bp ladderDNA marker
同一引物，对于不同的物种，退火温度可能不
同，如 Huang and Sun 用 ISSR技术检测番薯时引
物 811和 888的退火温度分别为：53℃和 52~C；而
Herrera Rte4)等在运用 ISSR技术检测葡萄时这两个
引物所采用的退火温度均为 55"(3。退火温度不同，
产生错配的程度也不相同。较低的退火温度在保证
引物与模板结合的稳定性的同时，也会使引物与模
板之间未完全配对的一些位点间得到扩增，即产生
一 定的错误扩增。因此，在 Tm允许的范围内，选择
较高的退火温度可减少引物和模板之间的非特异
性结合，提高PCR反应的特异性嘲。由引物 自身特
点导致的错误配对可以通过重复实验和在分析时
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第 1期 余艳等：简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选 19
只分析那些扩增效率高、稳定性强的片段来减少这
种误差。
一 般说来，如果在大部分样品中不能产生 DNA
扩增带的引物，说明引物序列与该物种基因组 DNA
的同源性较低，就不宜用作该物种的 ISSR-PCR扩
增的引物。
致谢：承蒙郝刚博士、孙晔助理研究员、易润华博士
在实验过程中给予热情指导与帮助，谨致以衷心的
感谢。
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