全 文 ：热带业热带植物学报 2006，l4(1)：55-60
Journal oJ rropi,d and Subtropical Botany
影响香根草体细胞胚胎发生和植株再生因素初探
马镇荣， 杨冰冰
(中困科学院华南植物吲
． 夏汉平
J 卅I 510650)
摘要：为了探索提高香根草( twer z／zanlo／des)遗传种质改良效率的有效途径， 步研究了影响香根草体身州胞胚胎
发生和植株再牛的若十因素。以 MS培养基为基本培养基，附加不H配比的 长素和细胞分裂素，对香根草的腋芽及
尢茁 定芽进行离体培养。结果表明，2,4．D是诱导体细胞肘 胎发生的关键因素，当培养基中H含2，4一D而不含或少含
细胞分裂素(6一BA)时，外植体经由体细胞胚胎发牛途径形成再生植株。愈伤组织诱导频率在有的品种之问差异显著，
最高的达剑 96。7％(cv．Zomba)，最低的不到30％(Cv．MalaysiaI；而有的品种之间著异 显著 (例如 CV．Kardy和 CV．
Sunshine)。胚性愈伤组织的再牛能力可以艮 保持，从未经继代培养的到持续继代第23代的胚性愈伤组织，再牛频
率都在 8O％以上，州日再牛植株的生长良好。在 3-7~C的低湍下进行分化培养时，仍然有 40，5％-50．0％不同世代的胚
性愈伤组织还保持着再牛能力。
关键词：香根草：胚性愈伤：体细胞 胎发牛；植株冉牛
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：l【J(】5—3395(2006)【)l一【)(】55一O6
Efecting Factors of Somatic
and Plant Regeneration
Embryogenesis
in Vetiver
MA Zhen—tong， YANG Bing—bing， XIA Han-Ping
( r)Ⅲ^ (~ina Botcmical~rden ．f Chinese Academy ofSc ， ，Guangzhou 510650，China)
Abstract：Axilary buds and aseptic adventitious buds of vetiver(Vetiveria zizanioides(L)Nash)were used as
explants to investigate the factors that affected somatic embryogenesis and plant generation． The explants were
cultured on MS medium supplemented with 2A—dichlorophenoxyacetic acid(2，4一D)or and 6-benzyladenine
f6．BA)．The results sho~ed the explants could regenerate via somatic embryogenesis when the medium contained
only 2 一 1 ．B ． i i
,
4 D without or with itle content of 6 A Callus nducfion frequency n diferent cultivars was
signifcantly varied，eg：CV．Zomba had highest induction frequency．up to 96．7％，k ut CV．Malaysia the lowest．，less
than 30％ ，whereas that in CV．Kandy and CV．Sunshine was almost the same．Regeneration ability in embryonic
calli could be maintained for a long time，the regeneration frequency being still over 80％，regardless of subculture
times from 0 to 23． Th e differentiation ability of embryonic cali WaS inhibited at temperature of 3-7℃ ， under
which only 40．5％一50．0％ ofthem could regenerate．
Key words：Vetiveda zizan~ides；Embryogenic callus；Somatic embryogenesis；Plant regeneration
卉 I。L Vetiveria zizanioMes(L．)Nash 水 f：保
持、 怠 境治理、退化生态系统的恢复，以及对重
属fl 染物的乍物修复和 l 壤摹质的改良等方
仃m 『l勺作用 。日前香根草的圩发利用尚存
着 ·定的局 性，需要通过遗传改 良，选育出矮
化、抗早、耐寒和绿期较长的新． 种，以适应生态lT
的需要。采用生物工程的方法，即体细胞克隆变
异或诱变、外源基凶的遗传转化等，是对香根草进
收稿日期：2005—06—27 接受13期 ：2005 11—21
基金项目： 家自然科 ±j点 项 (30370233)：美 Wallace丛因艰 会资助
通讯作 Coresponding author
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56 热带亚热带植物学报
行遗传改良的有效途径。
离体培养是生物上程法的基础，是改良任何植
物种质的技术前提；体细胞 胎发生是离体培养的
植株再生途径之一，并且是提高再生频率的有效途
径 。为了提高香根单遗传种质改良的效率，我们
对香根草体细胞胚胎发生的细胞学特点进行了研
究[6]，本文主要探讨影响其胚性愈伤产生和植株再
生的若干因素，为进行品种遗传改良提供参考。
l材料和方法
材料 香根草 Vetiveria zizanioides(L．)Nash
取自中国科学院华南植物园 草园实验琏地。供试
的材料包括 Kandy，Kamataka，Malaysia，Sunshine，
Randy，Zomba等香根草品种。离体培养采用两种外
植体，一是植株上带腋芽的节， 是南器 ’发生方
式所产生的无菌不定芽。以腋芽作外植体时，切取
带节的秆，剥去叶鞘，截取带腋芽的节，表面消毒
(70％乙醇2 min+20％次氯酸钠 10 min+0．1％氯化
求 20 min)后，把带有腋芽的节小块接种到培养基
上。以无菌不定芽作外植体时，存无茼条件下把不
定芽从试管中取 并接种到新的诱导培养基
此外，以菲胚性愈伤组织和尤茼不定势两种培
养物作为供试材料， 含不同配比的，f 岽和细胞
分裂素的诱导培养基巾进行培养，以观察体细胞
的诱导条件。
培养基 以MS[ j培养萆为基木培养基，诱导
器官发生时附加 5．0 mgL。BAP和 0．2 mgL。IBA：
愈伤组织的诱导和继代时均附加 2．0 mg L 2，4一D，
以及不同配比的其他生长调节剂；植株再q=时附加
O．1 mg L。KT，2．0 mg L‘ 6-BA和 2．0 mg L—NAA。
固体培养基含琼脂 8．O％，pH值为 5．85。
细胞学观察 把体细胞 性愈伤组织从培
养基中取出并浸泡在甲醇 冰乙酸 (3：1)吲定液
中，然后按石蜡切片的常规方法切 ，厚度为 8
m，州 Ehrich氏苏木精染色。封片后 微镜下观
察、照市H。
胚性愈伤组织的鉴别 从外柿体上诱导
愈伤组织大约需要 2-3周时间，及时把愈伤组织转
移到分化培养基或继代培养基上。 ’般每两个 继
代一次，继代 ‘次称为⋯个t}=代 ，第 n t}I=代在品种
编号后面 记作 “．n”。例如 “4—23”表 4号 -种
(Kamataka)继代第23代。
性愈伤组织是具有胚状 构的愈伤组织。朋
第 l4卷
肉眼或解剖镜观察，单个的 状结构表面光滑，成
圆球形或圆柱形，个体之问相对独立。从切片观察，
随着球形胚、盾片形胚、芽鞘形胚等发育阶段不同，
其形状也有所变化。成熟胚具两极性，胚芽端和胚
根端清楚。 非胚性愈伤组织的整体成块状，个体
表面粗糙，呈 规则形，分化率低。
植株的再分化 、移栽和定植 把胚性愈
伤组织转移到分化培养基 卜，在光照为 12 h d
(1 200 lx)、温度为 25~2℃下培养。再生植株形成
后，在生根培养基rf1培养约 2周时间，根系发达即
可盆栽。待株高长至 20 cm左右，定植到旱地里，常
浇水以保持湿润。成活后观察植株各种性状。
2结果和讨论
2．1体细胞胚性愈伤组织的形成过程
香根草的腋芽 诱 导培养基巾培养两周后开
始膨大，逐步形成愈伤组织。 性愈伤组织产生后，
可以见到 多球状突起 (I到版 I：A)。肘 性绌胞的细
胞质变浓，细胞分裂加速并形成球形胚，在显微镜
下l』J 察剑这部分绌胞着色很{=；f{( 版 h B)。香根
：的胚性细胞形态上 规I_J!『J且有棱角。图版 h B中
自。 人 一小 个球形胚，它们是甭由一个胚性细胞
分裂 成，然后各自发展成为胚性绌胞 ?这是涉
及到香根草的体细胞胚是否 ．细胞起源的问题，有
待进 ‘步 ：究。胚性细胞冈与其周围的非胚性细胞
形态 同、着色不 ，而 Il_产生明显的界线 逐步
分离开来 (图版 T：C)，直到发育成为芽鞘形胚 (图
版 I：D)。从 版 I：D看到，香根草体细胞胚具有单
子叶柿物典型的胚胎结构，在横切面结构中，每个
胚状体山胚芽鞘 (cp)、胚根鞘 (cr)及盾片 (se)组
成，还町以观察到一条着色较深的维管束 (v)连接
在胚根与盾片之间。胚芽鞘、胚根鞘、盾片及其问的
维管束组织等四个部分是一个完整的胚状体的必
备条什。本研究表明，通过离体培养 口J 以成功地诱
出完 的香根草体细胞胚。
2．2体细胞胚的诱导条件
以MS培养耩为基本培养基，没汁了 6种不同
生长素和绌胞分裂岽配比的诱导培养基，分别对两
种培养物 (=【F 性愈伤组织和无菌不定芽)作诱导
仆细胞 的试验以观察诱导胚性愈伤的效果。
从表 1看m，培养堪 附加 2，4．D， 沦6-BA
的含量是 O．5还足 1．0 mg L。，两种培养物均没有体
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第 1期 马镇荣等：影响香根草体细胞胚胎发生和植株再生因素初探 57
表 1生长素和细胞分裂素的不同配比对香根草胚性愈伤组织诱导频率的影响
Table 1 Effects ofgrowth regulators on induction frequency ofembryogenic cali ofvetiver
细胞胚的产生；当2，4．D的含量达到4．0 mg L 时，
45．8％的非胚性愈伤组织和 62．2％无菌不定芽不能
诱导出体细胞胚。对于非 性愈伤组织而吉，在附
加 2，4．D的条件 F，无论是否含有 6-BA均可诱导
出体细 胞 胚 ，且 其 诱 导 频率 以 2，4．D含 量 为
0．5 mg L 并不含6-BA的为最高(96．7％)。值得注
意的是，在2．4．D的含量为0．5 mg L 且不含 6-BA
的情况下，无菌不定芽不能诱导出胚性愈伤组织。
对于无菌不定芽而青，诱导培养基的最适配比足1．0
(2,4．D)：0．5(6-BA)，诱导频率为 77．9％，而且诱
导出来的多数胚性愈伤组织的质量都很好。
Mucciareli等嘲对香根草以及 Liu等[ 1对羊草
(Leymus chinensis)的研究表明，2，4 D的浓度对愈
伤组织的诱导有很明 的影响。从奉实验离体诱导
香根草胚性愈伤组织中，外植体对培养基 中的
2，4．D和 6-BA的反应来看，2，4．D也有栩同的效应。
当培养基中只含 2,4一D而不含或少含细胞分裂素
时，外植体 (腋芽或不定芽)可经由体细胞胍胎发
生途径形成再生植株。这 ‘结果也与凌定厚等㈣对
籼稻及 Vasil等⋯】对珍珠粟(Pennisetum americanum)
体细胞胚胎发生研究的结果基本 ‘致。
2-3不同品种的胚性愈伤组织诱导频率的差异
为了解不『 品种n勺香根 的 性愈伤组织诱
导 碍夏的 计，在卡l同士『}养条什 F， 了 5个品
种绛 复试验的愈 纵诱导师 率
胚性愈伤组织诱导频率
Induction frequency(％)
0
0
0
0
96．7
0
85．6
77．9
80．0
38．5
54．3
37 8
：E—cali=胚性愈伤组织
从表2可看出，香根草不同品种的愈伤组织诱
导频率有的无差异显著性 (如袁 2中字母相同的两
个品种)，有的具差异显著性 (如表 2中字母不同
的各品种)。诱导频率最高的达到96．7％(Zomba)；
其 次 是 83．5％(Kamataka)．而 最 低 的 不 到 30％
f Malaysia)。但是，尽管愈伤组织诱导频率各不相
同，所有品种的愈伤组织都能产生体细胞胚 (图版
I：E)。在实验中观察到，胚件愈伤组织诱导频率的
高低与腋芽的发育时期也有一定的关系 (资料未
示)，这对于利用特定发育时期的不同品种开展实
验，提供了依据。
表2香根草不同品种愈伤组织诱导频率的差异
Table 2 Calus induction frequency ofvetiver culdvars
数摒为两个孽复试验、接种 15 d厉的统计结果； LSD
(O O5)分析，J司一栏巾不同： 母表示差异显著。Data are means of
two experiments in duplicate，which were obtained after inoculation
for l 5 days． Means within column with diferent leters are
signifcant at the P=0．05(LSD test)
数枷一 一 眦0。。。盯。 ∞ 如如一 =善 陛o
一一。。盯。 ∞如一 一
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58 热带亚热带植物学报 第 14卷
2．4低温对体细胞胚植株再生的影响
香根草属于热带亚热带植物，其本身不具备抗
寒的能力，这是香根草在北方生长的主要限制因
子。通常情况下，把胚性愈伤组织转入分化培养基
以后，在 12 h d 光照 (1 200 lx)和 25+2℃下培养。
为了试图通过施加低温选择压以选育耐寒种质，把
3批不同世代的胚性愈伤组织放在 3—7℃ (光照
上)的培养箱里培养，持续时间分别为98 d、90 d、
82 d(表 3)。
表 3表明，在 3—7℃的条件下，部分胚性愈伤组
织不再分化甚至死亡，但有 40．5％一50．0％胚性愈伤
组织还保持着再生能力。由于每一块具再生能力的
胚性愈伤组织所产生的植株不止 l株，因此得到的
再生植株数比分化愈伤组织块数多，甚至多出一倍
以上。此外，在本实验中还看到，分化频率的高低与
低温处珲的大数以及胚性愈伤组织的世代不相关。
3—7℃的低温对香根草胚性愈伤组织的分化有
一 定的影响。这对于离体筛选抗寒种质提供了有益
的启示。然而，经过低温处理所获得的再生植株与
正常植株相比，在生理生态指标上有何异同?假如
把处理的温度下降到 0—3。C，其再生能力是否仍然
保持?经过低温胁迫而获得的体细胞克隆是否在抗
寒、抗冻能力上比较强?这些问题有待于进一步探
讨。
表3 3-7℃低温处理对香根草Karnataka胚·l生愈伤组织再生频率的影响
Table 3 Efects oflow temperature(3-7℃)treatment on regenemtlon frequency ofembryogenic cali ofvetiver cV，Kamataka
E．cali=胚性愈伤组织 Embryogenic calus
2．S体细胞胚的植株再生能力
将胚性愈伤组织转入分化培养基， 周即呈绿
色并逐渐萌发出芽。在分化初期，可观察到胚性愈
伤组织上布满了绿点。这些绿点逐渐发育成为不定
芽，诱导出根之后即成为完整的小植株。许多研究
已经证明，体细胞胚性愈伤组织在继代条件下，胚
性结构及植株再生能力可以长期保持_l2，”]。而香根
草体细胞胚的这种再生能力更强。图版 h F及 G显
示，从未经继代培养的 (俗称“0代”)到继代 23代
的各个世代的胚性愈伤组织，再生植株的生长情况
都非常良好。表 4显示连续继代两年的胚性愈伤组
织最近半年的再生能力。
凌定厚等l14]证实，水稻胚性愈伤组织的分化成
苗率囚继代次数的增加而有所下降。Lu等 ]所获得
的-l 米 性愈伤组织的分化能力只保持了 个月。
而本实验表明，香枞草胚性愈伤组织连续继代两年
(以 更长时间，数据未显示)，它们的再生能力仍
然没有明显的下降。这种特性在其他禾本科植物(如
水稻1上末见报道。利用香根草的这种特性开展突变
体的离体筛选和遗传转化等方面的研究，是十分合
适的。
衰4继代时间对香根草Randy胚性愈伤组织再生频率的影响
Table 4 Efects ofsubculture duration on regeneration frequency ofemb~yogenic calli ofvetiver cv．Randy
数据为最近半年中每两个月 ‘}久的统计 Datawere collected everymonthsinthelast sixmonths：E-cali=胚性愈
伤组织 Embryogenic calus
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第 1期 马镇荣等：影响香根草体细胞胚胎发牛和植株再牛因素初探 59
致谢 在本文修改过程中，承蒙马国华研究员热
情帮助．谨致谢忱!
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图版说明
版 I：
A．胚性愈伤组织纵七U，可见球状突起(s)：×l00
B．愈伤组织内部形成两个球形胚：×l00
C．球形胚与其周围的细胞产牛明显的界线并逐步分离：xlO0
D．芽鞘形胚由胚芽鞘(cp)、胚根鞘(cr)、盾片(sc)以及连接在胚根鞘
与盾片之间的维管束组成(v)：×lo0
E．肉眼可见的体细胞胚胎：x40
F，G．未经继代培养(0代)的(F)和继代第 23代体细胞胚的(G)再牛
植株．
Explanation ofplate
P1ateI：
A． Longitudinal section of embryonic calus， showing the spherical
tubercle(s)；×IO0
B．Two globular embryos form ed in the callus；×1 00
C．An obvious spacing line between globular embryo and surrounding
cells；×1 00；
D．Coleoptile embryo consisting of coleoptilc(cp)，coleorrhiza(er)，
scutelum(sc)and vascularbundles(V)connecting cr and sc；xlO0；
E．Macroscopic somatic embryos；x40
F，G．Regenerated plants from somatic embryos non-subcultured(F)
and subcultured for 23 generations(G)．
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热带、I 热带
镇荣等： 版 I MA Zhen—rong et a1．：Plate I
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