全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 424~428　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0464424
收稿 2014-11-06　　修定 2015-03-14
资助 江苏省自然基金面上项目(BK20130503)、江苏省博士后
基金项目(1102132C)和江苏高校优势学科建设工程资助
项目。
* 通讯作者(E-mail: weihongsun2009@163.com; Tel: 0511-
88797059)。
干旱胁迫下番茄叶片碳酸酐酶活性的变化
孙卫红1,*, 吴秋霞1, 温新宇1, 何华纲1, 吴沿友2, 丁佳俊1, 封丽娜1
江苏大学1食品与生物工程学院; 2农业工程研究院, 江苏镇江212013
摘要: 碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)催化CO2的可逆水合反应, 是参与CO2传导而进入羧化位点的重要光合酶, 其活性高
低对植物水分利用及光合作用有较大影响。为了研究干旱胁迫下番茄CA表达活性变化对植株光合作用及水分利用的影
响, 本文利用Northern杂交检测番茄叶片的胞质CA基因在干旱胁迫下的表达; 测定干旱胁迫下番茄叶片CA活性、光合速
率和叶片水势变化。结果表明, 番茄叶片胞质CA基因受干旱胁迫诱导; CA活性随着干旱胁迫时间延长而发生由低至高再
回落的变化, 且变化规律基本与CA基因相似。番茄叶片的净光合速率和水势随着干旱程度和处理时间延长而降低。在
75%的土壤相对水分含量条件下, 植株的CA活性、光合速率及水势变化不明显。可见番茄叶水势和光合速率与CA表达活
性之间存在一定的变化趋势相似性。
关键词: 干旱胁迫; 番茄叶片; 碳酸酐酶活性
Changes of Carbonic Anhydrase Activities in Tomato Leaves under Drought Stress
SUN Wei-Hong1,*, WU Qiu-Xia1, WEN Xin-Yu1, HE Hua-Gang1, WU Yan-You2, DING Jia-Jun1, FENG Li-Na1
1School of Food and Biological Engineering; 2Institute of Agricultural Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu
212013, China
Abstract: Carbonic anhydrase (CA) catalyzes the reversible hydration of CO2, and it is an important photosyn-
thetic enzyme which take part in the CO2 conduction and get into the carboxylation site. The CA activity has a
great effect on photosynthesis and water use efficiency. In order to study the effect of expression of CA gene on
the plant photosynthesis and plant water potential in tomato (Lycopersicon esculentum), the expression of cytoso-
lic CA gene in tomato leaves under drought stress were determined by Northern blotting. And the CA enzyme ac-
tivity, photosynthetic rate and water potential in tomato leaves under drought stress were also determined. The re-
sults showed that the expression of cytosolic CA gene in tomato leaves was induced by drought stress. With the
time of drought stress, the CA activity increased and then fell, and the changes were basically similar to that of CA
gene expression. Net photosynthetic rate and water potential of tomato leaves decreased with the degree of drought
and the treatment time. However, the CA activity, net photosynthetic rate and water potential changed slightly with
the soil relative water content of 75%. The results indicated that there was a certain corresponding relationship be-
tween the changes of water potential and photosynthetic rate in tomato leaves and the change of CA activity.
Key words: drought stress; tomato (Lycopersicon esculentum) leaves; CA activity
研究报告 Original Papers
干旱胁迫对植物造成的伤害是多方面的, 可
以导致叶片蒸腾量过大, 细胞失水, 膜脂过氧化,
严重时会导致作物死亡(Reddy等2004)。土壤及大
气干旱造成叶片气孔失水关闭, 以保持叶片内相
对较高的水势, 但同时又严重阻碍了CO2进入叶肉
细胞, 降低了植物的光合作用, 影响了作物产量。
碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA, EC 4.2.1.1)催化
CO2的可逆水合反应(Khalifah 1980), 它能快速地
将HCO3
-转化成H2O和CO2, 可以弥补水分逆境后
植物缺水和CO2的缺失。作为参与CO2传导而进入
羧化位点的重要光合酶, CA活性高低对光合作用
有较大影响(Kaul等2011; Diamantopoulos等2013)。
在C3植物中, CA可通过促进CO2的液相扩散调节
对光合起作用(Burnell等1990; Moroeny等2011), 而
适量升高的CO2浓度能够提高植物的光合能力和
水分利用效率(孙卫红等2013)。在低CO2的胁迫环
孙卫红等: 干旱胁迫下番茄叶片碳酸酐酶活性的变化 425
境中, 利用CA保持Rubisco周围高浓度的CO2水平
对于植物维持光合系统的最适功能是至关重要
的。此外, 研究证明缺少CA基因βCA1和βCA4的拟
南芥突变体对空气中CO2的响应被削弱, 而过量表
达这两种基因的植物则表现出较高的水分利用效
率(Hu等2010)。研究证明诸葛菜的CA活力大于几
乎所有的被测十字花科植物, 这种较高的CA活性
可能与卡斯特地区植物耐干旱贫瘠适应性有一定
的关系(吴沿友等2006), 而番茄的CA是否具有同
样的机制至今未见报道。
番茄是中国的主要蔬菜作物, 经常会受到干
旱胁迫等逆境伤害, 干旱胁迫会影响番茄的产量
甚至营养品质(Sun等2014)。在植物CA作用机制
的探索中, 有研究表明逆境胁迫下烟草Rubisco和
CA的表达呈现出一致性(Vats等2011), 玉米叶片中
PEPCase和CA表达上亦有紧密相关性(Badger 2003),
说明在水分逆境条件下CA活性对光合速率有一定
调节作用(Shao等2014), 其对水分逆境的响应程度
可以作为作物生长及水分灌溉的指标之一。
本研究分析番茄叶片胞质CA基因(ScCA)在干
旱胁迫下的表达情况及CA活性变化, 以及干旱胁
迫下CA表达活性与植株的光合效率和水势变化之
间的关系, 为作物节水灌溉技术的应用提供理论
依据。
材料与方法
1 植物材料与干旱胁迫处理
植物材料种植在江苏大学玻璃温室内, 温度
为(25±5) ℃, 光照强度平均约为1 000 μmol·m-2·s-1,
相对湿度(75±5)%。以番茄(Lycopersicon esculen-
tum Mill.) ‘中蔬6号’植株为试材。种子在育苗盘培
育2周后移栽于温床中定植生长, 采用黄土添加约
1/5的炉渣和腐熟鸡粪等混合有机基质培养, 栽培
基质约50 cm深度。
从定植后21 d开始处理(此时为对照, 记为0
d)。按土壤相对含水率不同, 设3个水分处理: 土壤
相对含水率(relative water content, RWC) (75±5)%
为正常对照、(50±5)%为干旱处理、(25±5)%为严
重干旱处理。滴灌系统灌溉, 每天10:00和15:00测
定栽培基质水分, 取土样于实验室利用称重法测
定土壤相对含水率。同时采用手持式HH2水分仪
(Delta-T Devices 英国)与ML2探头(Delta-T Devices
英国)测定, 滴灌补充水分确保不同处理的土壤水
分含量基本稳定。处理5 d后测定各个指标。3次
重复, 每个重复以10株测试。
2 干旱胁迫下番茄叶片ScCA基因的表达
干旱胁迫处理番茄植株, 处理时间分别为0、
1、2、3、4和5 d。取顶部以下3~4层叶片, 提取叶
片总RNA, RNA的提取采用Trizol (Invitrogen)抽提
法, 详细步骤按试剂说明书进行。Northern杂交方
法参照《分子克隆实验指南》 (Sambrook和Russell
2010), RNA (25 μg)用甲醛变性凝胶电泳分离, 电泳
完毕后将RNA转移至尼龙膜上, 交联固定RNA。
于65 ℃预杂交12 h, 42 ℃杂交36 h。其中构建探针
的引物序列为5 CCCTTAGCTTCATCATCAACG 3
和5 TTAGAGTGCAACAGAAGGAGT 3 (用a[32P]
dCTP标记)。于–80 ℃放射自显影后, 磷屏成像。
3 干旱胁迫下番茄植株叶片CA活性测定
取各个处理时期的叶片于液氮冷冻处理后放
于超低温冰箱中保存, 用于CA活性测定。采用电
化学法, 利用自制的pH锑微电极测定CA活力(施倩
倩等2010)。反应系统在冰箱中保持0~2 ℃, 用锑
微电极监测反应体系的pH值变化。根据该时间电
位曲线得到酶存活和失活条件下单位pH值下降的
时间t1和t0, 酶活性用WA-U表示(其中WA=t0/t1–1)。
4 干旱胁迫下番茄植株叶片光合速率测定
采用便携式光合作用系统(CIRAS-2, PP Sys-
tems, Boston, USA)测定植株净光合速率(Pn)。于
上午10:00时测定 , 待测植株先在光照强度100
µmol·m-2·s-1下适应30 min, 后在800 μmol·m-2·s-1下
适应15 min, 于叶温25 ℃、CO2浓度360 μmol·mol
-1
条件下测定Pn值。
5 干旱胁迫下番茄植株叶片水势变化测定
在进行光合参数测定的同时, 叶片水势测定
采用PSYPRO (Water Potential System, South Lo-
gan, Utah, USA)露点水势仪进行。
6 数据处理方法
每个处理及测定至少3个重复, 结果以平均值±
误差表示。图表中显示的值是平均值±SD, P≤
0.05为差异显著。
实验结果
1 干旱胁迫下番茄叶片ScCA基因的表达分析
图1显示番茄叶片ScCA基因的表达随着不同
植物生理学报426
RWC而变化。在50%及25% RWC胁迫处理5 d, 番
茄ScCA基因的表达量高于75% RWC正常生长条
件下的表达量(图1)。这表明番茄ScCA基因的表达
受干旱胁迫诱导。
图2显示, 在50% RWC的干旱胁迫下, ScCA基
因的表达量逐渐增加, 第3天达到最高, 以后逐渐
降低, 表明番茄叶片ScCA基因的表达随时间延长
变化。
图1 不同干旱胁迫下番茄叶片ScCA基因的表达
Fig.1 Expression of ScCA in tomato leaves
under different drought stress
2 干旱胁迫下番茄叶片胞质CA的活性变化
图3所示, 在不同干旱胁迫下, 番茄植株叶片
图2 不同干旱胁迫时间下番茄叶片ScCA基因的表达
Fig.2 Expression of ScCA in tomato leaves in
different time under drought stress
图3 干旱胁迫下番茄叶片CA活性变化
Fig.3 Changes of CA activities in tomato leaves
under drought stress
的CA活性随着时间而变化。在50%和25% RWC
胁迫下, 植株的CA活性均先升高后降低。在25%
RWC胁迫下, 番茄的CA活性急剧上升, 第2天就达
到高峰, 之后则下降。而50% RWC胁迫的CA活性
则缓慢上升, 第3天达到峰值, 之后也急剧下降。
从第3天起, 50% RWC胁迫的CA活性都高于25%
RWC胁迫的。75% RWC正常条件下, 植株的CA活
性略有上升, 变化量不明显。
3 干旱胁迫下番茄叶片光合速率变化与水势变化
如图4-A所示, 不同干旱胁迫的番茄叶片Pn都
呈下降趋势。25% RWC胁迫的番茄Pn急剧下降,
50% RWC胁迫的番茄Pn下降程度比较缓和, 而75%
RWC条件下的Pn略微下降, 第4天略有上升, 变化
不明显。
不同干旱胁迫下番茄植株叶片的水势与番茄
叶片Pn保持一致的变化趋势(图4-B)。而在75%
RWC条件下, 植株的水势几乎没有变化。
图4 干旱胁迫下下番茄叶片净光合速率和水势的变化
Fig.4 Changes of Pn and water potential in tomato leaves under drought stress
孙卫红等: 干旱胁迫下番茄叶片碳酸酐酶活性的变化 427
讨　　论
在胁迫环境下, 植物体内的某些耐逆功能酶
能够对逆境胁迫作出一定的响应。本文研究结果
表明干旱胁迫诱导CA基因的表达及CA活性升高
(图1~3), 其它研究如盐胁迫等也有类似的结论(Li
等2010)。在严重干旱胁迫下, 番茄植株叶片的Pn
与水势随着土壤干旱程度加剧和处理时间延长而
下降(图4-A), 可见, 番茄的生长对水分胁迫反应敏
感。干旱胁迫使植物体内水势下降, 气孔关闭, 光
合速率减弱, 产量降低(Munne-Bosch和Penuelas
2004; Reinfelder 2011)。在逆境光合过程中, 正是
CA催化进行可逆的CO2水合反应, 降低了CO2在叶
肉细胞中的扩散阻力, 促进其向Rubisco扩散, 有效
地将CO2转化为HCO3
-, 为羧化反应提供底物, 从而
尽量维持较高的光合作用(图3~4)。
在一定的水分胁迫下, 番茄植株胞质CA的基
因表达量及其酶活性与其光合速率和水势变化趋
势之间存在一定的相似性(图1~4)。75% RWC条
件下第5天番茄叶片ScCA基因几乎没有被诱导表
达, 其相应CA活性较低, 但能持续维持较高的净光
合速率水平和较高的水势, 生长情况良好, 可见
75% RWC可能是番茄植株的最佳生长条件之一
(Sun等2014)。50% RWC干旱胁迫下, ScCA基因从
开始表达(逆境下CA调控光合的开始)到第3~4天
表达量达到最高峰(CA达到最大光合调控能力),
再回到初始对照水平(CA对光合的调控能力及对
叶片水势的调控能力急剧下降)。之后, CA活性再
继续下降, 则CA对光合的调控能力失控, 水势急速
下降。在25% RWC重度干旱胁迫第5天, 番茄植株
ScCA基因表达量虽高于其在75% RWC条件下的
测定值, 但其酶活性已降低, 植株膜系统受损, 植
株外观形态改变, 光合能力快速下降。
综上所述, 以CA活性变化作为植物灌溉指标,
能更准确反映植物的光合速率和水势变化情况。
如50% RWC干旱胁迫第5天, 应进行灌溉(达到75%
RWC即可), 此时没有光合产量损失及水势胁迫和
膜系统损伤, 否则会有无法弥补的光合产量损失;
在这之前的灌溉则会造成水分浪费。当然, 这是
在温度和湿度条件基本恒定的温室内测定得出的
结论。如果是针对大田作物 , 应该针对不同季
节、不同温度条件下, 利用CA活性变化所对应的
土壤含水率为灌溉指标, 比以植株的外观形态变
化为指标更具有节水灌溉和达到高产的优势。利
用CA活性变化对大田作物实际生产的应用验证研
究正在进行中, 目前研究表明, 春季5月(19~26 ℃)
大田番茄植株在50% RWC干旱胁迫的研究结果基
本符合温室条件的试验结论。
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