全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2214~2222　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.04842214
收稿 2015-09-01　　修定 2015-12-07
资助 广西自然科学基金(2013GXNSFDA019011和2014GXNSF-
BA118102)和广西高校科研项目(YB2014009)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: honest66222@163.com; Tel: 0771-3270184)。
杧果Mn-MiSOD基因的克隆与表达模式分析
余海霞*, 罗聪*, 徐趁, 何新华**
广西大学农学院, 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 南宁530004
摘要: 本研究在前期研究基础上, 采用改良RACE技术和RT-PCR技术克隆了一个杧果Mn-MiSOD基因的全长序列。生物信
息学分析显示, 该cDNA全长为794 bp, 包含一个690 bp的开放阅读框, 编码230个氨基酸, 分子量为25.67 kDa, 等电点为
6.3。表达模式分析显示, 该基因在各个组织中均表达, 但在成熟叶片和果实中表达水平更高。低温胁迫、盐胁迫和PEG干
旱胁迫均诱导该基因的表达。热处理、柠檬酸处理、草酸处理、1-MCP处理以及热处理+1-MCP处理上调Mn-MiSOD基因
在果实中的表达水平。实验结果表明, Mn-MiSOD基因可能在杧果逆境胁迫和采后生理方面起重要作用。
关键词: 杧果; Mn-SOD基因; 逆境胁迫; 采后处理; 表达模式
Molecular Cloning and Expression Analysis of Mn-MiSOD Gene from Mango
YU Hai-Xia*, LUO Cong*, XU Chen, HE Xin-Hua**
College of Agriculture, State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, Guangxi Univer-
sity, Nanning 530004, China
Abstract: A full-length cDNA sequence of Mn-MiSOD was cloned from mango cultivar ‘SiJi’ using modified
RACE techniques and RT-PCR based on our previous study. Bioinformatics analysis showed that this sequence
consists of 794 bp with an open reading frame of 690 bp, encoding a polypeptide of 230 amino acids with a
predicted molecular mass of 25.67 kDa and theoretical isoelectric points (pI) of 6.3. Expression analysis indi-
cated that Mn-MiSOD expressed in various tissues, but high expression levels were found in mature leaves and
fruits. The expression of Mn-MiSOD could be induced by low temperature, salt and PEG stress. We also found
that the post-harvest treatment with heat water, citric acid, oxalic acid, 1-MCP and heat water+1-MCP could
up-regulate Mn-MiSOD gene expression in mango fruit. The experimental results showed that the Mn-MiSOD
gene may play important roles in adversity stress and post-harvest physiology in mango.
Key words: Mangifera indica (mango); manganese superoxide dismutase gene; stress; expression pattern
植物在生长发育过程中, 容易遭受到生物或
非生物胁迫, 比如病原物侵染、低温胁迫、高温
胁迫、高盐胁迫和干旱胁迫等。这些逆境胁迫使
植物产生大量的活性氧, 而这些物质的富集将严
重影响细胞的功能和植物的正常生长发育, 甚至
可以引起植株死亡(窦俊辉等2010)。植物在长期
的进化中, 形成了一套抵御活性氧积累的抗氧化
物酶系统, 其中超氧化物歧化酶(superoxide dis-
mutase, SOD)是植物中广泛存在的一类能够清除
活性氧的一类金属酶, 它几乎参与所有植物抵御
不利生长发育因素的生理生化反应(王星等2014)。
SOD广泛存在于各种植物中, 根据所含金属
元素的差异主要分为三类, 分别是含有金属Mn的
Mn-SOD, 主要位于线粒体中; 含有金属Cu和Zn的
Cu/Zn-SOD, 主要位于叶绿体和细胞质中; 含有金
属Fe的Fe-SOD, 主要位于叶绿体中, Fe-SOD是比
较原始的一类 , 在高等植物中比较缺乏(Miller
2004; 窦俊辉等2010)。而在海洋生物中还发现了
第四类SOD, 即Ni-SOD (Dupont等2008)。研究表
明, 前三类SOD基因均与植物逆境胁迫应答有关
(Gill等2015)。
目前一些物种的SOD基因被分离克隆出来,
并展开了较为深入的研究, 但尚未见杧果SOD基因
的研究报道。杧果作为广泛种植于热带亚热带地
区的多年生果树, 其产量与品质易受外界环境因
素的影响, 这些不利的逆境因素是否与杧果SOD基
因的表达有关呢, 目前尚不清楚。在前期研究中,
余海霞等: 杧果Mn-MiSOD基因的克隆与表达模式分析 2215
我们利用cDNA-SCoT差异显示技术从杧果逆境样
品中分离获得了一个SOD基因的cDNA片段, 长度
为285 bp, 该片段3′端包含一个ployA尾巴(Luo等
2014)。本实验将利用改良的RACE技术克隆其全
长, 对序列进行生物信息学和在逆境胁迫下的表
达模式分析, 同时还分析了SOD基因在采后不同处
理样品中的表达, 旨在为深入研究杧果SOD基因在
杧果逆境胁迫和采后方面的功能奠定基础。
材料与方法
1 实验材料与处理方法
组织表达特性材料为广西大学农学院标本园8
年生的‘四季杧’ (Mangifera indica L. cv. SiJi), 采集成
熟叶片、嫩叶、花、茎、40 d果、60 d果和80 d果
实为材料, 保存于–80 ℃冰箱用于RNA的提取。
逆境材料为1年生‘四季杧’嫁接盆栽苗, 砧木
为‘海南土杧’。设定以下3种处理。NaCl处理: 配
制300 mmol·L-1 NaCl溶液, 直接浇灌杧果苗, 直到
盆土充分吸收水分为止; PEG模拟干旱处理: 配制
30%的PEG 6000溶液, 直接浇灌杧果苗, 直到盆土
充分吸收水分为止; 4 ℃低温处理: 将苗移到人工
气候箱中进行4 ℃低温处理 , 光照强度为108
μmol·m-2·s-1, 日照长度为12 h。每个处理5株苗, 处
理后0、24、48和72 h分别采集叶片和茎段为材料,
保存于–80 ℃冰箱中用于RNA的提取。
果实采后处理材料为‘台农一号’杧果, 挑选大
小和色泽一致成熟度约八成熟的杧果, 进行5种处
理: (1)对照(清水处理); (2)热处理: 将杧果果实浸泡
于52 ℃热水中10 min; (3)柠檬酸处理: 将杧果果实
浸泡于10 mmol·L-1柠檬酸浸中10 min; (4)草酸处理:
将杧果果实浸泡于5 mmol·L-1草酸溶液中10 min;
(5)热处理+1-MCP: 热处理后将果实晾干后继续用1
µL·L-1 1-MCP密闭处理12 h; 每个处理果实20个, 重
复3次。处理后样品置于保鲜袋, 轻系袋口, 储存于
20 ℃恒温保存箱中。处理后24 h开始收集样品, 以
后每隔3 d收集一次, 共收集样品6次, 时间跨越16 d,
将样品保存于–80 ℃冰箱用于RNA的提取。
本实验中使用的主要生化试剂购自南宁恒因生
物科技公司, PCR相关耗材与试剂购自上海生工。
2 总RNA提取与cDNA合成
杧果不同处理和不同组织器官样品总RNA的
提取采用热硼酸法(Wan和Wilkins 1994)。总RNA
的质量采用紫外分光光度计和1.2%的琼脂糖凝胶
电泳分别测定其浓度和完整度。
cDNA第一链合成采用M-MLV逆转录酶, 引
物用AUP1, 第一链合成参照逆转录酶使用说明书
进行, 逆转录完成后用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检
测其效果。
3 杧果Mn-MiSOD基因全长的克隆
在实验室前期研究中, 已经获得了杧果SOD
基因的3′末端, 只需克隆基因的5′末端序列即可获
得全长。SOD基因5′末端的克隆采用本实验室改
良的RACE技术, 实验方法完全参照罗聪等(2011)
的方法。在获得基因的5′末端序列后通过拼接获
得其全长, 然后设计一对能够扩增SOD完整开放
阅读框的引物验证拼接序列的正确性。杧果SOD
基因全长序列克隆PCR反应体系体系为25 µL, 其
中10×buffer 2.5 µL、10 mmol·L-1 dNTP 0.5 µL、10
µmol·L-1上下游引物各1 µL、Dream Taq 0.15 µL、
cDNA模板1 µL, 补双蒸水至总体系25 µL。PCR反
应程序为: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s; 54 ℃
退火30 s; 72 ℃延伸60 s; 共35个循环; 最后72 ℃再
延伸6 min。PCR产物经1.6%琼脂糖凝胶电泳检
测, 对大小符合预期的条带进行切胶回收, 而后将
目的片段连接到pMD18-T载体上, 转化大肠杆菌
感受态细胞, 通过涂含氨苄青霉素的LB固体平板,
37 ℃培养16 h, 而后通过蓝白斑筛选和菌落PCR验
证, 送阳性克隆子由上海生工公司测序。本实验
所用引物见表1。
4 杧果Mn-MiSOD基因进化树及蛋白序列分析
用BoXM 2.6软件对克隆获得的序列进行拼接
和氨基酸序列推导。杧果SOD基因同源性和结构
域的预测和分析利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/)网站的Blast检索工具。蛋白质分子量和
等电点的预测利用在线工具ProtParam (http://web.
expasy.org/protparam/)。信号肽预测用SignalP 4.0
(http://www.cbs.dtu.dk /services/SignalP/)。跨膜结
构域预测采用TMpred工具(http://embnet.vital-it.ch/
software/TMPRED_form.html)。利用ClustalX 2.0
对多物种SOD蛋白序列进行多重比较分析 , 用
MEGA 4.0软件中的邻位相连法构建杧果Mn-Mi-
SOD蛋白与其他物种SOD蛋白的系统进化树。
植物生理学报2216
表1 引物序列信息
Table 1 The sequences information of primers
引物名称 引物序列(5→3) 引物用途
AUP1 GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)18 逆转录引物
AP长 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG 5端克隆引物
AP短 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 5端克隆引物
5SOD d2 TTTCAAATAATCCGGTCTCACATTC 5端克隆引物
5SOD d1 TGCTCCCAAACATCTATGCCAAGC 5端克隆引物
5SODd0 CTTCCAGAAAATTGAGTGGTTGACA 5端克隆引物
SODu ATGGCACTTCTCTCTCACGTGAC 开放阅读框克隆引物
SODd TCAGGGGCATTCTTTCTCATAC 开放阅读框克隆引物
qSODu GAAGCACCACCAGACTTACATTAC 荧光定量引物
qSODd ACCTCCGCCGTTGAACTTG 荧光定量引物
qActin1u CCCAAGGCTAACAGAGAGAAGATG 内参引物
qActin1d ATCACCAGAATCCAGCACAATACC 内参引物
sSODu TTGCTTGGCATAGATGTTTGGG 半定量引物
sSODd CCTCAAACCAATCTTAAATAAAACT 半定量引物
sActin1u GTTTCC CAGTATTGTGGGTAGG 半定量内参引物
sActin1d AGATCTTTTCCATATCATCCCAGTT 半定量内参引物
5 杧果Mn-MiSOD基因表达模式分析
Mn-MiSOD基因组织表达特性采用半定量RT-
PCR方式进行检测。分别提取不同组织样品的总
RNA, 逆转录成cDNA后, 通过紫外分光光度计测
定其浓度, 而后将各个样品配制成200 ng·µL-1作为
半定量RT-PCR的模板。以杧果Actin1基因(Gen-
Bank登录号JF737036)为内参基因(Luo等2013)。
半定量PCR反应体系与克隆体系一致。PCR反应
程序为: 95 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s; 56 ℃退
火30 s; 72 ℃延伸30 s; 共27个循环(内参为30个循
环); 72 ℃延伸6 min。取8 µL PCR产物加2 µL上样
缓冲液(已加核酸染料), 混匀后用1.8%琼脂糖凝胶
电泳检测。半定量同时进行3次重复实验。PCR仪
型号为美国ABI公司的2720型。
采用实时荧光定量技术对Mn-MiSOD基因在
杧果逆境处理和采后不同处理下的表达模式进行
检测, 分析方法采用2–∆∆CT法(Livak和Schmittgen
2001)。以杧果内参基因为Actin1, GenBank登录号
为JF737036 (Luo等2013), 所用引物详见表1。实时
荧光定量PCR仪用ABI 7500, 操作步骤和程序参照
《ABI 7300/7500实时定量PCR仪相对定量实验入
门指南》, 荧光定量反应体系参照试剂盒 SYBR®
Premix Ex Taq II (TaKaRa)说明书进行, 每个样品
重复3次。
实验结果
1 Mn-MiSOD基因全长的克隆
根据本实验室改良的5′末端RACE技术方法,
设计2条巢式下游特异引物, 第1轮PCR采用降落
PCR技术用特异引物5SODd2与AP长进行扩增, 然
后将PCR产物稀释40倍后采用巢式PCR技术用引物
5SODd1与AP短进行第2轮扩增。经过2轮PCR扩增
成功获得一条清晰的条带, 长约350 bp (图1-A), 对
获得的片段进行凝胶回收、克隆和测序, 获得一条
长330 bp的片段。通过与原序列进行拼接和分析,
发现拼接后的序列依然是片段, 离完整的5′末端还
差约270 bp。因此在获得片段的基础上, 继续设计
一条下游特异引物5SODd0, 以第二轮PCR产物稀
释40倍后为模板, 以引物5SODd0与AP短进行第3轮
PCR扩增。电泳结果显示, 又成功获得一条长度约
400 bp的片段(图1-B), 对获得的片段进行凝胶回
收、克隆和测序, 成功获得长度为376 bp的片段。
序列拼接显示, 成功获得杧果Mn-MiSOD基因的完整
5′末端序列, 包含起始密码子ATG。根据拼接的全长
序列, 设计一对能够扩增完整开放阅读框的基因特
异引物SODu和SODd, 对拼接序列进行验证, PCR扩
增结果显示获得一条长约为700 bp的单一条带(图
1-C)。经过克隆测序获得长度为693 bp的基因序列,
序列分析显示与先期获得的拼接序列完全一致。
余海霞等: 杧果Mn-MiSOD基因的克隆与表达模式分析 2217
经过序列拼接获得杧果Mn-MiSOD基因序列
长度为794 bp, 起始密码子ATG位于43 bp处, 终止
子TAG位于732 bp处, 开放阅读框长度为690 bp, 编
码230个氨基酸, 分子量为25.67 kDa, 等电点为6.30
(图2)。含量最高的氨基酸是Leu (11.30%), 其次是
Gly (8.70%), 最少是Cys (0.43%), 不含Sec和Pyl, 分
子式为C1160H1794N308O341S5。
2 Mn-MiSOD基因生物信息学分析
利用TMpred预测杧果Mn-MiSOD蛋白在第
181位到199位之间存在一个跨膜结构域, SignalP
4.0预测显示Mn-MiSOD蛋白不含信号肽。保守结
构域分析显示, 杧果MiSOD在29~110个氨基酸之
间含有一个Sod_Fe_N结构域, 在120~225个氨基酸
之间含有一个Sod_Fe_C结构域, 以上两结构均属
图1 杧果Mn-MiSOD基因PCR扩增电泳图谱
Fig.1 Amplified electrophoresis of PCR products of Mn-MiSOD in mango
A: 第一轮5′ PCR扩增; B: 第二轮5′ PCR扩增; C: 开放阅读框PCR扩增; M: DL2000 Marker。
图2 杧果Mn-MiSOD基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列
Fig.2 The complete cDNA sequence of Mn-MiSOD and its preditcted amino acid sequence
植物生理学报2218
于PLN02471多结构域, 属于Mn-SOD基因家族。
Blast同源性分析显示, 杧果Mn-MiSOD基因与
同为Mn-SOD类的基因的同源性较高, 核苷酸序列
和氨基酸序列与其他物种Mn-SOD类SOD基因相
似性分别介于81%~91%和72%~90%之间。下载与
杧果Mn-MiSOD基因有同源性的不同物种SOD蛋
白的氨基酸序列以及Fe-SOD和Cu/Zn类SOD蛋白,
利用软件MEGA 4.0构建系统进化树。进化树分析
显示, 不同类型的SOD蛋白被分为三大类, 第I类均
属于Mn-SOD类蛋白, 杧果Mn-MiSOD聚类到第I类,
与可可(Theobroma cacao, XM_007011278)、陆地棉
(Gossypium hirsutum, DQ088820)和龙眼(Dimocarpus
longan, HM773388)聚类到一起, 说明其亲缘关系较
近(图3)。第二大类为Fe-SOD类蛋白, 第三类为Cu/
Zn-SOD类蛋白。三类SOD蛋白界限清晰, 其中Mn-
SOD类蛋白与Fe-SOD类蛋白亲缘关系较近(图3)。
图3 杧果Mn-MiSOD蛋白系统发育进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of Mn-MiSOD protein of mango
3 Mn-MiSOD基因组织表达特性分析
利用半定量RT-PCR法对Mn-MiSOD基因的组
织表达特性进行分析。结果显示, 在不同组织器
官中, Mn-MiSOD基因均表达, 但存在差异。Mn-
MiSOD基因在成熟叶片中具有较高的表达水平;
而在嫩叶、花和茎中表达水平较低; 在发育中的
果实中具有较高的表达水平, 并且随着果实的不
断发育, 其表达水平逐渐上升, 在即将成熟的果实
中具有很高的表达水平(图4)。
4 Mn-MiSOD基因在逆境胁迫下的表达特性分析
利用实时荧光定量技术对Mn-MiSOD基因在
图4 杧果Mn-MiSOD基因组织表达特性分析
Fig.4 The expression patterns of mango Mn-MiSOD
gene in different organs
1: 成熟叶; 2: 嫩叶; 3: 花; 4: 茎; 5: 40 d果; 6: 60 d果; 7: 80 d果。
逆境胁迫下的表达特性进行分析, 结果见图5。4
℃低温胁迫下, 叶片中Mn-MiSOD基因的表达水
余海霞等: 杧果Mn-MiSOD基因的克隆与表达模式分析 2219
平显著下降, 处理24 h的表达水平最低, 是处理前
的0.02倍, 处理48和72 h的表达水平虽然有一些
上升, 但依然显著低于处理前; 而茎中, Mn-Mi-
SOD基因在胁迫24 h后表达水平明显下降到最低,
只有处理前的0.19倍, 而后开始缓慢上升, 72 h后
Mn-MiSOD基因的表达水平为处理前的1.91倍。
NaCl胁迫下, 叶片中Mn-MiSOD基因的表达
水平呈现先下降后上升再下降的过程, 胁迫48 h
的表达水平达到最高水平, 是处理前2.26倍; 最低
值出现在胁迫72 h时, 是处理前的0.03倍; 而茎中
Mn-MiSOD基因的表达水平随着处理时间的推移
持续下降, 胁迫72 h的表达水平下降到最低, 是处
理前的0.44倍。
PEG胁迫下, 叶片中Mn-MiSOD基因的表达
量都分别高于未处理的1.63、1.32和1.29倍; 而茎
中, Mn-MiSOD基因表达是先下降后上升再下降,
在胁迫48 h时达到表达高峰, 比未处理的高3.4倍,
最低值出现在胁迫24 h, 是未处理的0.74倍。
5 Mn-MiSOD基因在采后杧果果实不同处理下的
表达特性分析
利用不同方法处理杧果果实, 延长其保鲜期。
实验结果表明, 处理16 d, 清水处理样品颜色最黄,
果实软化程度最高, 病害程度也最重; 而柠檬酸、
草酸处理和热处理3种方式储存效果差异不大, 均
好于清水处理; 热处理+1-MCP处理效果则最好(罗
聪2012) 。
利用荧光定量技术对杧果采后不同处理方式
和处理后不同时间样品中Mn-MiSOD基因的表达
模式进行分析。实验结果(图6)显示, 清水处理(对
照)的杧果Mn-MiSOD基因在处理后表达水平即可
上升, 并且在整个处理期间表达水平均高于处理
前, 在第4天时表达水平是处理前的1.96倍, 第7天
时是处理前的6.0倍, 而后有所下降, 在第10天时是
处理前的3.82倍, 之后表达水平又开始上升, 在13
图6 不同处理对杧果果实Mn-MiSOD基因表达模式的影响
Fig.6 Effects of different treatments on expression pattern of Mn-MiSOD gene in mango fruits
图5 逆境胁迫下杧果Mn-MiSOD基因表达分析
Fig.5 Expression analysis of Mn-MiSOD under stress treatments
植物生理学报2220
d时表达水平达到最高峰是处理前的6.76倍, 在16
d时有所下降, 是处理前的6.29倍。随着处理时间
的推移, 柠檬酸处理的表达模式呈现先上升后下
降再上升的过程, 相对于对照, 柠檬酸处理明显提
高Mn-MiSOD基因的表达水平, 其表达高峰出现在
处理后第10天, 比处理第1天高6.2倍。草酸处理的
Mn-MiSOD基因表达水平先上升后有些下降然后
再上升到最高峰最后再下降, 最高峰出现在第13
天, 表达水平是处理第1天的10.28倍。热处理的
Mn-MiSOD基因在处理后的第1天出现很高的表达
水平, 在第4天时依然维持很高的表达水平, 在第7
天时表达水平有所下降, 而后开始持续上升, 在第
13天时出现表达高峰, 是处理第1天的1.95倍。热
处理+1-MCP处理的Mn-MiSOD基因在处理后的第
1天表达被显著上调, 而后急剧下降, 在第4天时
Mn-MiSOD基因表达水平极低 , 而后开始逐步
回升, 在第16天时出现表达高峰, 是处理第1天的
5.4倍。
不同处理同一时间表达模式比较分析, 处理
后第1天, 热处理Mn-MiSOD基因的表达水平最高,
是对照的7.54倍, 其次是热处理+1-MCP处理, 是对
照的4.64倍, 草酸和柠檬酸钠处理Mn-MiSOD基因
的表达水平均高于对照清水处理。第4天, 热处理
MiSOD基因的表达水平依然最高, 而热处理+1-
MCP处理却最低, 只有对照清水处理的0.005倍, 而
其他两组处理Mn-MiSOD基因的表达水平依然高
于对照。第7天, 柠檬酸钠处理Mn-MiSOD基因的
表达水平最高, 而草酸、热处理和热处理+1-MCP
的表达水平却都低于对照。第10天, 依然是柠檬
酸钠处理的表达水平最高, 是对照的3.99倍, 而热
处理的表达水平略低于对照。第13天, 对照、草
酸和热处理均达到表达最高峰, 但草酸和热处理
的表达水平分别高于对照的2.45和2.18倍, 热处理+
1-MCP的表达水平略高于对照, 而柠檬酸钠处理却
相反。第16天, 热处理+1-MCP的表达水平达到峰
值, 是对照的3.98倍, 柠檬酸处理也维持很高的表
达水平, 是对照的2.17倍, 其次是热处理略高于对
照, 而草酸处理的表达水平则低于对照。
讨　　论
SOD属于基因是一个多基因家族, 在植物中
存在多个拷贝, 比如拟南芥中存在3个Cu/Zn-SOD、
1个Mn-SOD和3个Fe-SOD (Kliebenstein等1998)。
龙眼中存在6个不同类似的SOD, 包括3个Cu/Zn-
SOD、2个Fe-SOD和1个Mn-SOD (Lin和Lai 2013)。
杨树中存在7个Cu/Zn-SOD、2个Mn-SOD和2个Fe-
SOD (Molina-Rueda等2013)。本研究首次从杧果
中分离克隆出了一个Mn-MiSOD基因, 序列分析显
示, 杧果Mn-MiSOD基因的核苷酸和氨基酸序列与
其他物种的序列相似程度非常高, 说明SOD基因在
长期的进化中较为保守。杧果基因组中是否还存
在其他类型的SOD基因, 目前尚未见报道。
组织表达模式分析显示, 银杏中GbMn-SOD
在各个组织中均表达, 但在叶片和果实中表达水
平最高(程华等2009)。莲花Mn-SOD基因也在各个
组织中表达, 但在叶片中表达水平最高(Dong等
2009)。杨树中两个Mn-SOD基因在各个组织中均
表达, 但PtMSD1.1在茎中表达水平最高, 其次是叶
片, PtMSD1.2则相反(Molina-Rueda等2013)。本研
究中杧果Mn- MiSOD基因在多个组织中均表达, 其
中在成熟叶片和果实中表达水平最高。这与银杏
GbMn-SOD的表达模式一致。以上研究表明, 植物
Mn-SOD基因可能在植物的各个组织中均表达,
逆境胁迫诱导Mn-SOD基因的表达, 而提高
Mn-SOD的活性可以增加植物对多种环境胁迫的
抵抗能力(Baek和Skinner 2010)。激素处理、渗透
压胁迫和低温胁迫处理可以不同程度提高银杏叶
片中GbMn-SOD的表达水平(程华等2009)。杨树
PtMSD1.1和PtMSD1.2在干旱胁迫下其表达水平在
各个组织中均下降, 而恢复供水后表达水平又回
升(Molina-Rueda等2013)。低温胁迫和氧化胁迫可
以显著上调荷花NnMSD1表达, 而盐胁迫和高温胁
迫抑制其表达, ABA和PEG不影响其表达(Li等
2009)。将小麦的Mn-SOD基因转入玉米, 可以提高
转基因玉米Mn-SOD的酶活性, 并减轻由逆境造成
的氧化胁迫(Du等2006)。将柽柳的Mn-SOD基因
转入杨树提高了杨树SOD活性和对盐的抵抗能力,
而将其转入棉花则可以提高棉花对干旱的抵抗能
力(Wang等2010; Zhang等2014)。本实验中, 低温
胁迫、盐胁迫和PEG均诱导杧果Mn-MiSOD基因
的表达, 但其在不同处理、不同时间点和不同组
织部位的表达水平存在差异, 说明杧果Mn-MiSOD
基因与逆境胁迫应答有关。其中PEG胁迫下叶片
中Mn-MiSOD基因的表达在各时间点均被上调表
余海霞等: 杧果Mn-MiSOD基因的克隆与表达模式分析 2221
达, 这与PEG渗透胁迫下杧果SOD酶活性上升的结
果一致(余望2002)。
杧果不耐贮运, 而热处理(Nair等2001)、柠檬
酸处理(Razzaq等2015)、草酸处理(郑小林等2007;
Razzaq等2015)以及1-MCP处理(Wang等2009)均能
够延长杧果的货架期。Ding等(2007)研究也发现
柠檬酸和水杨酸处理可以提高低温下杧果果实中
的SOD酶活性。郑小林等(2007)和Razzaq等(2015)
利用草酸处理杧果发现草酸提高杧果果实中SOD
酶活性。邵远志等(2009)用不同浓度的1-MCP处
理‘台农一号’杧果研究发现, 处理组和对照组样品
的SOD酶活性先下降, 而后逐步上升, 但处理组的
SOD酶活性明显高于对照组。贾文君等(2013)用
热处理、1-MCP以及两种方法结合的方式处理杧
果, 发现1-MCP处理、1-MCP+热处理可以提高果
实中SOD酶活性, 而热处理却稍微降低SOD酶活
性。本实验中, 杧果Mn-MiSOD基因在热处理、柠
檬酸处理、草酸处理以及热处理+1-MCP处理均
明显被上调表达 , 说明这些处理可以提高杧果
Mn-MiSOD基因的表达水平。但对照中杧果Mn-
MiSOD基因随着贮藏时间的延长表达水平上升,
而杧果SOD酶活性却随着贮藏时间的延长而降低
(贾文君等2013)。这一现象可能是由于3种不同类
型的SOD酶在杧果果实采后贮藏过程中的含量和
功能存在差异造成的。
由以上各方面可以看出, 杧果Mn-MiSOD基因
的表达水平受低温胁迫、盐胁迫和PEG模拟干旱
胁迫的诱导以及杧果采后不同保鲜方法的调控。
说明杧果Mn-MiSOD基因可能在杧果逆境胁迫和
采后生理方面起重要调控作用。Mn-MiSOD基因
在杧果逆境和采后贮藏过程中的作用尚不清楚,
这是我们下一步研究的方向。
参考文献
程华, 李琳玲, 许锋, 常杰, 王燕, 程水源(2009). 银杏锰型超氧化
物歧化酶GbMnSOD基因的克隆与表达. 园艺学报, 36 (9):
1283~1290
窦俊辉, 喻树迅, 范术丽, 庞朝友, 宋美珍(2010). SOD与植物胁迫抗
性. 分子植物育种, 8 (2): 359~364
贾文君, 李俊俊, 李文文, 李润华, 李雯(2013). 1-MCP和热处理对台
农杧果贮藏品质的影响. 保鲜与加工, 13 (3): 8~11
罗聪(2012). 杧果SCoT分子标记与逆境和重要开花时间相关基因
研究[学位论文]. 南宁:广西大学
罗聪, 何新华, 陈虎, 韦泳丽, 李明娟(2011). 一种高效获取基因5′末
端的RACE方法. 植物生理学报, 47 (4): 409~414
邵远志, 陈业渊, 高爱平, 贾文君, 李雯(2009). 1-MCP对杧果果实贮
藏品质及采后生理的影响. 食品科技, 34 (7): 44~47
王星, 刘肖飞, 周宜君, 张根发(2014). 植物SOD基因表达调控的分
子机制, 中国油料作物学报, 36 (2) : 275~280
余望(2002). 渗透胁迫对杧果叶片活性氧伤害的影响. 亚热带植物
科学, 31 (1): 32~34
郑小林, 田世平, 李博强, 徐勇(2007). 外源草酸延缓采后杧果成熟
及其生理基础的研究. 中国农业科学, 40 (8): 1767~1773
Baek KH, Skinner DZ (2010). Molecular cloning and expression of
sequence variants of manganese superoxide dismutase genes.
Korean J Environ Agric, 29 (1): 77~85
Ding ZS, Tian SP, Zheng XL, Zhou ZW, Xu Y (2007). Responses of
reactive oxygen metabolism and quality in mango fruit to ex-
ogenous oxalic acid or salicylic acid under chilling temperature
stress. Physiol Plant, 130: 112~121
Dong C, Li GL, Li ZQ, Zhu HL (2009). Molecular cloning and ex-
pression analysis of an Mn-SOD gene from Nelumbo nucifera.
Appl Biochem Biotechnol, 158: 605~614
Du J, Zhu Z, Li WC (2006). Over-expression of exotic superoxide dis-
mutase gene MnSOD and increase in stress resistance in maize. J
Plant Physiol Mol Biol, 32 (1): 57~63
Dupont CL, Neupane K, Shearer J, Palenik B (2008). Diversity, func-
tion and evolution of genes coding for putative Ni-containing
superoxide dismutases. Environ Microbiol, 10: 1831~1843
Gill SS, Anjum NA, Gill R, Yadav S, Hasanuzzaman M, Fujita M,
Mishra P, Sabat SC, Tuteja N (2015). Superoxide dismutase—
mentor of abiotic stress tolerance in crop plants. Environ Sci
Pollut Res, 22: 10375~10394
Kliebenstein DJ, Monde RA, Last RL (1998). Superoxide dismutase
in Arabidopsis an eclectic enzyme family with disparate regula-
tion and protein localization. Plant Physiol, 118: 637~650
Li W, Qi L, Lin XD, Chen HH, Ma ZQ, Wu KQ., Huang SZ (2009).
The expression of manganese superoxide dismutase gene from
Nelumbo nucifera responds strongly to chilling and oxidative
stresses. J Integr Plant Biol, 51 (3): 279~286
Lin YL, Lai ZX (2013). Superoxide dismutase multigene family in
longan somatic embryos: a comparison of CuZn-SOD, Fe-SOD,
and Mn-SOD gene structure, splicing, phylogeny, and expres-
sion. Mol Breeding, 32: 595~615
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2-∆∆Ct method.
Methods, 25: 402~408
Luo C, He XH, Chen H, Hu Y, Ou SJ (2013). Molecular cloning and
expression analysis of four actin genes (MiACT) from mango.
Biol Plant, 57: 238~244
Luo C, He XH, Hu Y, Yu HX, Ou SJ, Fang ZB (2014). Oligo-dT an-
chored cDNA-SCoT: a novel differential display method for an-
alyzing differential gene expression in response to several stress
treatments in mango, Gene, 548 (2): 182~189
Miller AF (2004). Superoxide dismutases: active sites that save, but a
protein that kills. Curr Opin Chem Biol, 8: 162~168
Molina-Rueda JJ, Tsai CJ, Kirby EG (2013). The populus superoxide
dismutase gene family and its responses to drought stress in
植物生理学报2222
transgenic poplar overexpressing a pine cytosolic glutamine syn-
thetase (GS1a). PLoS ONE, 8 (2): e56421
Nair S, Singh Z, Tan SC (2001). Heat treatments affect development
chilling injury, respiration, ethylene production and fruit quality
of mango. Acta Hortic, 553: 549~550
Razzaq K, Khan AS, Malik AU, Shahid M, Ullah S (2015). Effect
of oxalic acid application on Samar Bahisht Chaunsa mango
during ripening and postharvest. LWT-Food Sci Technol, 63:
152~160
Wan CY, Wilkins TA (1994). A modified hot borate method signifi-
cantly enhances the yield of high quality RNA from cotton (Gos-
sypium hirsutum L.). Anal Biochem, 223: 7~11
Wang BA, Wang JH, Feng XY, Lin L, Zhao YM, Jiang WB (2009).
Effects of 1-MCP and exogenous ethylene on fruit ripening and
antioxidants in stored mango. Plant Growth Regul, 57: 185~192
Wang YC, Qu GZ, Li HY, Wu YJ, Wang C, Liu GF, Yang CP (2010).
Enhanced salt tolerance of transgenic poplar plants expressing
a manganese superoxide dismutase from Tamarix androssowii.
Mol Biol Rep, 37: 1119~1124
Zhang DY, Yang HL, Li XS, Li HY, Wang YC (2014). Overexpression
of Tamarix albiflonum TaMnSOD increases drought tolerance in
transgenic cotton. Mol Breeding, 34: 1~11