全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月544
收稿 2009-02-11 修定 　2009-05-21
资助 国家自然科学基金(20776058)和 2006 年教育部新世纪
优秀人才支持计划(N CET-06 -0 64 6)。
* 通讯作者( E -ma i l : y u l j @ h u s t . e d u . c n; T e l : 0 2 7 -
8 7 7 9 2 2 6 4 )。
红豆杉脱分化过程中的遗传和表观遗传变异
李丽琴, 付春华, 赵春芳, 吴文娟, 余龙江 *
华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉 430074
提要: 采用扩增片段长度多态性(AFLP)和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析红豆杉脱分化前后基因组DNA和DNA
甲基化状态的变化。选用 32个AFLP引物组合从红豆杉植株及其愈伤组织分别扩增出 1 834个片段, 无多态性片段产生。
这说明红豆杉植株在诱导形成愈伤组织的过程中基因组DNA保持高度的遗传稳定性。另用32个MSAP引物组合从红豆
杉植株及其愈伤组织分别扩增出1 197个片段, 总扩增位点的甲基化水平由脱分化前的12.4%上升为16.2%, 表明红豆杉在
脱分化过程中的某些位点发生了甲基化。红豆杉脱分化前后的DNA甲基化模式也存在较大差异, 说明DNA甲基化对愈伤
组织形成有调控作用。
关键词: 脱分化; 红豆杉; AFLP; MSAP
Genetic and Epigenetic Variations of Taxus media L. cv. Hicksii during Pro-
cess of Dedifferentiation
LI Li-Qin, FU Chun-Hua, ZHAO Chun-Fang, WU Wen-Juan, YU Long-Jiang*
School of Biological Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
Abstract: The amplified fragment-length polymorphism (AFLP) and methylation-sensitive amplified polymor-
phism (MSAP) techniques were used to assess genetic and epigenetic variations of Taxus media during process
of dedifferentiation. 1 834 bands were amplified from Taxus media plant and its callus with 32 pairs of AFLP
primers, and no polymorphism fragments were detected. These indicated DNA genome of Taxus media kept
highly genetic stability during the process of dedifferentiation. At the same time, 1 197 bands were amplified
from Taxus media plant and its callus with 32 pairs of MSAP primers, methylation level rose from 12.4% to 16.2%,
and epigenetic changes due to methylation were detected. What’s more, methylation patterns experienced mark-
edly variation, which meant DNA methylation would play role during the process of dedifferentiation.
Key words: dedifferentiation; Taxus media; AFLP; MSAP
植物组织培养的愈伤组织形成过程中细胞的
超微结构常发生变化, 如细胞质生长很快, 细胞质
中多聚核糖体数量增加, 线粒体增加, 高尔基体和
内质网不断增加, 并不断产生囊泡(许萍和张丕方
1996)。据王亚馥和王仑山(1989)报道, 枸杞子叶
脱分化时 RNA 和可溶性蛋白含量均有明显变化。
但是, 对于基因组DNA在细胞脱分化形成愈伤组织
过程中的遗传变异情况尚不清楚。此外, 正常植物
组织和其相应的愈伤组织不仅是细胞形态和组织结
构有很大区别, 其次生代谢产物的种类和含量也有
改变。如张洁等(2006)检测红豆杉及其愈伤组织
粗提物中紫杉烷的结果表明, 2 种粗提液中紫杉烷
的种类和含量不尽相同。本文从基因组DNA的遗
传稳定性和表观遗传稳定性两个方面研究红豆杉愈
伤组织形成过程中遗传性状改变的物质基础。细
胞表观遗传是指不因DNA序列的变化而形成的基
因功能改变, DNA甲基化是表观遗传学的比较重要
的研究内容之一, 参与调控基因表达、生物防御和
生长发育。据报道, 在番茄(Messeguer 等 1991)、
玉米(Lund等 1995)、水稻(Dhar 等 1990)等植物中,
不同组织间的甲基化水平有差异, 这暗示甲基化在
器官发育和细胞分化过程中可能起作用。但是
DNA甲基化是否参与愈伤组织形成的脱分化过程
尚未见研究。本文采用扩增片段长度多态性
(AFLP)和甲基化敏感扩增多态性(MSAP)两种分子
标记技术探讨红豆杉愈伤组织形成前后的遗传和表
观遗传变异。
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材料与方法
取培养于本校苗圃、长势良好的曼地亚红豆
杉(Taxus media L. cv. Hicksii)的当年生嫩茎 (采于
2008年 7月), 分别用 75%乙醇消毒10 s, 双氧水消
毒 5 min, 0.5% 氯化汞消毒 8 min, 无菌水漂洗 5次,
切成 1~2 cm 长的小段, 接种在 MS 培养基上诱导
愈伤组织。 用于愈伤组织诱导的 MS 培养基中含
30 g·L-1 蔗糖、0.2 mg·L-1 二氯苯氧乙酸和 0. 5 mg·L-1
α- 萘乙酸, pH 5.8。愈伤组织形成后转入新鲜培
养基中继代, 培养温度为(24±1) ℃, 暗培养。
采用改良的 SDS-CTAB法从红豆杉嫩茎和新
生愈伤组织中提取 DNA。紫外分光光度计测定
DNA样品浓度。1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质
量, 检测后将样品稀释至 50 ng·µL。
AFLP分析参照Vos等(1995)文中的方法并适
当修改。取 200 ng DNA 样品用 EcoRI/MseI 限制
性内切酶(NEB) 37 ℃酶切3 h, 2 U T4 DNA连接酶
(MBI) 22 ℃连接 3 h。连接产物稀释 5 倍后采用
E00/M00引物对进行预扩增, 预扩增产物稀释20倍
作为选择性扩增 D N A 模板。选择性扩增采用
(E+3)/(M+3)引物组合, 扩增产物进行变性凝胶电泳
分离和硝酸银染色检测, 接头及引物序列见表
1 ~ 3。
MSAP 分析参考 Smykal 等(2007)文中的方法
并适当修改。取 200 ng DNA样品分别采用EcoRI/
HpaII (H)和 EcoRI/MspI (M) 2 组限制性内切酶消
化并以HpaII或MspI的识别位点(CCGG)为基础设
计一对双链接头代替AFLP技术中的MseI接头, 其
它步骤与 AFLP 技术相同, 接头及引物序列见表
1 ~ 3。
SDS-PAGE 分析中同一引物扩增产物中电泳
表 1 AFLP 和 MSAP 的接头序列
Table 1 Adapters used for AFLP and MSAP amplification
接头 序列(5’-3’)
Ad-I EcoRI CTCGTAGACTGCGTACC
Ad-II EcoRI AATTGG TACGCAGTC
Ad-I MseI GACGATGAGTCCTGAG
Ad-II MseI TACTCAGGACTCAT
Ad-I HM GATCATGAGTCCTGCT
Ad-II HM CGAGCAGGACTCATGA
表 2 AFLP 和 MSAP 的预扩增序列
Table 2 Pre-amplification primers used for AFLP and MSAP
预扩增引物 序列(5’-3’)
E+A GACTGCGTACCAATTCA
M+C GATGAGTCCTGAGTAAC
HM+T ATCATGAGTCCTGCTCGGT
表 3 AFLP 和 MSAP 的选择性扩增序列
Table 3 Selective amplification primers used for AFLP and MSAP amplification
选择性扩增引物 序列(5’-3’) 选择性扩增引物 序列(5’-3’)
E+AAG GACTGCGTACCAATTCAAG M+CAA GATGAGTCCTGAGTAACAA
E+ACA GACTGCGTACCAATTCACA M+CAG GATGAGTCCTGAGTAACAG
E+ACT GACTGCGTACCAATTCACT M+CAT GATGAGTCCTGAGTAACAT
E+AAC GACTGCGTACCAATTCAAC M+CAC GATGAGTCCTGAGTAACAC
E+AGG GACTGCGTACCAATTCAGG HM+TAA ATCATGAGTCCTGCTCGGTAA
E+AGT GACTGCGTACCAATTCAGT HM+TCA ATCATGAGTCCTGCTCGGTCA
E+AGC GACTGCGTACCAATTCAGC HM+TCC ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC
E+ACC GACTGCGTACCAATTCACC HM+TTC ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC
迁移率一致的条带被认为具有同源性, 按照相同迁
移位置上有扩增条带记为 “1”、无带为 “0”的方法
记录电泳谱带, 仅清晰、可重复的并且长度在
200~1 000 bp 范围内的扩增条带才被记录。
结果与讨论
1 愈伤组织形成过程中基因组DNA的遗传稳定性
用 32 个引物组合(Eco+8/Mse+4)对红豆杉植
株嫩茎及其愈伤组织分别扩增出 1 834 个片段, 无
多态性片段产生(图 1)。说明红豆杉植株在诱导形
成愈伤组织的过程中基因组DNA保持高度的遗传
稳定性。
此外, 分析愈伤组织形成过程中的甲基化水平
的结果表明, 红豆杉愈伤组织形成前后的DNA分别
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用限制性内切酶组合 EcoRI/HpaII (H)和 EcoRI/
MspI (M)分别消化、连接、2 次扩增, 每个引物
组合共产生 4 个泳道。32 个引物组合(Eco+8/
HM+4)检测到的片段数目从 25~50条不等。红豆
杉植株及其愈伤组织扩增的总片段数为 1 197。
其中, 总甲基化的位点数(包括全甲基化和只有一
条链甲基化的半甲基化)分别为149和194, 总扩增
位点的甲基化水平分别为12.4%和16.2%; 其中全
甲基化的带数分别为111和143, 全甲基化率分别
为 9.3% 和 11.9%。红豆杉脱分化前后无论是总
甲基化水平还是全甲基化率都显著升高。
2 愈伤组织形成过程中DNA甲基化的类型
比较红豆杉植株嫩茎及其愈伤组织 DNA 甲
基化状态并根据带型的有无出现14种扩增带型的
结果(表 4)表明, 14 种带型主要分为两大类。I 型
表 4 红豆杉脱分化过程中甲基化类型和位点数目
Table 4 Methylation patterns and number of sites in T. media during process of dedifferentiation
嫩茎 愈伤组织 甲基化变化 *
位点数目 甲基化类型
H M H M 嫩茎 愈伤组织
I 型 I-1 + + + + CCGG GGCC 923
CCGG GGCC
I-2 - + - + CCGG GGCC 3 2
CCGG GGCC
I-3 + - + - CCGG GGCC 7
CCGG GGCC
II 型 A1 + + - - CCGG GGCC 4 1
CCGG GGCC
A2 + + + - CCGG GGCC 3 8
CCGG GGCC
A3 + + - + CCGG GGCC 4 6
CCGG GGCC
A4 + - - - CCGG GGCC 3
CCGG GGCC
B1 - - + + CCGG GGCC 3 4
CCGG GGCC
B2 - + + + CCGG GGCC 2 6
CCGG GGCC
B3 + - + + CCGG GGCC 2 0
CCGG GGCC
B4 - - + - CCGG GGCC 6
CCGG GGCC
C1 + - - + CCGG GGCC 8
CCGG GGCC
C2 - - - + CCGG GGCC 8
CCGG GGCC
C3 - + - - CCGG GGCC 5
CCGG GGCC
　　H: EcoRI/HpaII 的酶切、扩增产物; M: EcoRI/MspI 的酶切、扩增产物; +: 有扩增产物; - : 无扩增产物; * 表示带下划线胞嘧啶发
生了甲基化。
图 1 红豆杉脱分化过程的 AFLP 模式
Fig.1 AFLP patterns of T. media during
process of dedifferentiation
1、3、5 分别表示以 E+AGC/M+CAC、E+AGC/M+CAA、
E+AAG/M+CAC 为引物的红豆杉植株嫩茎扩增产物; 2、4、6 分
别表示以 E+AGC/M+CAC、E+AGC/M+CAA、E+AAG/M+CAC
为引物的红豆杉愈伤组织扩增产物; 相邻的 2 个泳道为平行样品。
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为单态性位点, 脱分化前后带型模式相同, 不表现
多态性, 说明DNA在脱分化前后甲基化状态保持不
变; II 型为多态性位点, 脱分化前后带型出现差异,
显示多态性条带, 说明DNA甲基化状态在脱分化前
后发生了改变。某些片段出现在红豆杉植株嫩茎
中, 但在其愈伤组织中却消失, 而另一些片段仅在
愈伤组织中才能检测到, 这样的片段共有235条, 可
分为 A、B 和 C 3 种类型(表 4)。A 型(甲基化)有
128条片段, A1~A3在嫩茎的H和M泳道都有带, 而
在愈伤组织中仅有一条带或都没带; A4在嫩茎H泳
道有带, 但在愈伤组织中都无, 说明愈伤组织形成
过程中基因组DNA的甲基化水平增加。B型(去甲
基化)有 86条片段, 嫩茎的H和M泳道无带或仅有
其中一个泳道有带, 但愈伤组织中出现条带, 说明
在愈伤组织形成过程中甲基化水平下降。C 型表
示愈伤组织形成后甲基化水平有差异无法确定, 有
21 条带(图 2)。
以上结果表明, 在红豆杉植株形成愈伤组织的
脱分化过程中, 基因组DNA显示出高度的遗传稳定
性, 但是 D NA 甲基化水平和模式均发生改变。
DNA 甲基化是表观遗传学中参与基因的差异表
达、胚胎发育、细胞分化、染色质失活、转基
因沉默等生物学过程。检测DNA甲基化的方法有
多种, 有高效液相色谱(HPLC)法、重亚硫酸盐法、
甲基化特异性 PCR (methylation-specific PCR,
MSP)、基因测序法以及 MSAP 等分析技术。其
中MSAP分析是基于选择性PCR的一种新技术, 有
AFLP的优点, 能够检测样品DNA中大量的甲基化
位点, 多态性高, 已广泛应用于多种植物基因组
DNA 甲基化的水平和模式分析(Peraza-Echeverria
等 2001; Chakrabarty 等 2003; Lu 等 2008 )。有研
究表明, DNA甲基化在植物的生长发育过程中起调
控作用, 在不同组织或同一组织的不同发育阶段, 基
因组 DNA 的甲基化水平和模式均存在差异(Portis
等 2004; Zhao等 2007)。陈小强等(2008)已有研究
证明, 大花蕙兰子房授粉前后DNA甲基化水平和甲
基化模式均有较大差异。陆光远等(2005)的研究
证明, 油菜种子萌发过程中同时发生甲基化和去甲
基化事件, 以去甲基化占据主导地位; 该研究同时
表明, 不同器官组织的甲基化水平也有一定的差异,
油菜可能通过甲基化和去甲基化的方式调控基因的
表达, 并最终决定植株的生长发育和器官分化。这
表明植物在生长发育过程中通过DNA甲基化和去
甲基化等表观遗传方式可实现基因的有序表达。
本文用 MSAP 方法证明红豆杉细胞脱分化前后存
在DNA甲基化水平的差异, 从表观遗传学的角度探
讨了植物愈伤组织形成过程中发生的分子变化机制。
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图 2 红豆杉脱分化过程的 MSAP 模式
Fig.2 MSAP patterns of T. media during
process of dedifferentiation
a: 扩增用引物 E+AAG/HM+TAA; b: 扩增用引物 E+ACA/
HM+TCA。1: 植株嫩茎 EcoRI/HpaII 的酶切、扩增产物; 2: 植
株嫩茎 EcoRI/MspI 酶切、扩增产物; 3: 愈伤组织 EcoRI/HpaII
的酶切、扩增产物; 4: 愈伤组织 EcoRI/Msp I 酶切、扩增产物。
箭头示愈伤组织形成前后的甲基化差异条带型(表 4 )。
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