全 文 ：收稿日期:2000-04-20.
作者简介:曹孟德(1964-), 男 ,博士;郑州 ,河南医科大学基础医学院(450052).
香荚兰脱分化过程中大分子物质含量的变化
曹孟德 　秦东春
河南医科大学
基础医学院
　 李家儒武汉大学
生命科学学院
　 王君健华中科技大学
生物工程系
摘要:就香荚兰组织培养过程中外植体脱分化的核酸 、蛋白质及淀粉含量的动态变化作了比较分析.研究发
现 ,脱分化过程中 DNA含量呈相对下降 , RNA 含量上升 , 总核酸含量呈上升趋势 ,蛋白质呈缓慢上升趋势;淀
粉则呈现一个积累 、消耗和再积累的过程.
关　键　词:香荚兰;组织培养;脱分化
中图分类号:Q813　　文献标识码:A　　文章编号:1000-8616(2001)03-0101-02
　　深入研究植物组织在脱分化和再分化过程中
的生理生化代谢变化 ,在理论上和实践中均有重
大意义.关于香荚兰组织培养脱分化形成愈伤组
织过程中大分子物质的动态变化情况国内外均未
见有报道 ,本文在现有工作的基础上[ 1 ～ 3]就上述
问题进行探讨.
1　试验材料与方法
1.1　供试材料与试剂
供试材料为墨西哥品种香荚兰无菌苗;所用
试剂丙烯酰胺(Acr.)及甲叉双丙烯酰胺 (Bis)分
别由ナカライテスク株式会社和 SERVA 出品;
坚牢蓝 RR为 Fluka 公司产品;Tris为 Boehringer
产品;其他化学试剂均为国产分析纯.
1.2　试验方法
A.植物材料的培养.香荚兰愈伤组织诱导及
其繁殖的培养方法见文献 [ 3] .
B.大分子物质提取与分离.在接种前和接种
后每隔 2 d取样 1 g(鲜重),甲醇固定 ,在 2 ～ 4 ℃
下用细胞匀浆器研磨成匀浆 ,用冷甲醇定容至 10
mL ,取 1mL 测定干重和提取淀粉 ,另外 9 mL 提
取核酸和蛋白质.
测定干重和提取淀粉的样品在 70 ℃下烘干
48 h , 在干燥箱中冷却后称重.称重后将样品用
5mL 95 %乙醇溶解并煮沸 20 min ,离心 (3 000
r/min ,10 min),去上清液 ,沉淀用 85 %乙醇洗两
次 ,加 2 mL 蒸馏水煮沸 15 min , 加入 0.2 mL
0.2 mol/L HClO4 后再煮 15 min ,冷却后用蒸馏
水定容至 5 mL ,用于测定淀粉含量.
测定核酸和蛋白质的样品 , 离心 (3 000
r/min ,10min),弃上清液 ,沉淀用 4 ～ 6 ℃的2 mL
甲醇 , 2mL 95 %乙醇:乙醚 (2∶1)混合液 , 1 mL
0.5 mol/L HClO4 及 2 mL 95 %的乙醇四种溶液
分先后各洗涤两次 ,再将沉淀用 2 mL 95 %乙醇
和 2mL 95 %乙醇∶乙醚 (2∶1)混合液分别煮沸
两次 , 每次 20 s.最后向沉淀中加入 2 mL 0.5
mol/L HClO4 ,在80 ℃下提取15 min ,以后每次用
1mL 0.5 mol/L HClO4 ,在同样条件下提取 5次.
合并上清液定容至 10 mL .取一半上清液测定总
核酸及 DNA 含量 , 另一半上清液用 1 mol/L
NaOH 调 pH 值至 7.0 ,测定酸溶性蛋白质含量.
沉淀用 4 mL 2mol/ L NaOH 悬浮 ,定温下放置 30
min后 ,加热到 100 ℃提取 10 min ,离心收集上清
液 ,沉淀用 1 mol/L NaOH时 ,同样条件下提取两
次 ,合并上清液 ,定容至 10 mL ,调 pH 值至 7.0 ,
测定碱溶性蛋白质含量.
C.大分子物质的测定.a.总核酸含量按
Madison等方法[ 4]用紫外吸收法测定.b.DNA含
量按 Burton 方法测定.从总核酸含量中减去
DNA含量得出 RNA含量.c.蛋白质按 Low ry 等
方法测定 ,蛋白质含量为酸溶性与碱溶性蛋白质
之和.d.淀粉含量用蒽酮法测定[ 5] .
2　结果与讨论
2.1　蛋白质含量的变化
在香荚兰含节茎段脱分过程中 ,可溶性蛋白
第 29 卷 第 3期　 　　　　　华　中　科　技　大　学　学　报　　　　　　　Vol.29　No.3
2001年　3 月　　　 　　　　J.Huazhong Univ.o f Sci.& Tech.　　　 　　 　　Mar.　 2001
DOI :10.13245/j.hust.2001.03.035
质含量 p 变化有一定的规律可循 ,总的趋势为波
图 1　香荚兰含节茎段脱分化过程中每克(干重)
外植体蛋白质含量 p 的变化
动缓慢式上升(见图 1).在培养的 0 ～ 4 d ,可溶性
蛋白质含量下降 ,表明含节茎段在脱分化开始时 ,
细胞内原有可溶性蛋白质转变为细胞分裂启动时
所需要的物质 ,此时新的蛋白质尚未合成 ,或者合
成速度小于原外植体中蛋白质的分解速度 ,因而 ,
表现为可溶性蛋白质含量呈下降趋势;4 ～ 12 d ,
可溶性蛋白质含量逐渐增高 ,在第 12 d达到高峰
6.28μg/g(每克干重外植体),这一蛋白质含量上
升的现象与含节茎段细胞启动后开始分裂及增殖
有关 ,表明当细胞开始分裂增殖时 ,细胞内合成大
量的可溶性蛋白质 ,为愈伤组织的产生奠定了物
质基础;在第 14 d时 ,可溶性蛋白质含量又降低 ,
这可能与含节茎段开始产生愈伤组织 ,而细胞内
可溶性蛋白质转变成不可溶状态 (如结构蛋白和
其他物质等)有关;14 ～ 22 d ,可溶性蛋白质含量
又呈上升趋势 ,表明在含节茎段产生大量愈伤组
织之前 ,细胞内合成和积累大量蛋白质;22 ～ 28
d ,可溶性蛋白质含量处于平稳状态 ,表明此时细
胞内蛋白质的供求达到了基本平衡.
2.2　核酸含量的变化
研究表明 ,香荚兰含节茎段外植体在脱分化
过程中总核酸含量的整体趋势是增加的 , 但是
DNA与 RNA含量的变化情况却相反.
结果显示 , DNA 含量在脱分化过程中略有下
降 ,而 RNA 含量则不断增加.细胞发生分裂 ,必
需进行 DNA复制 , DNA 绝对含量应该增加 ,但由
于在脱分化过程中 , RNA 和蛋白质的含量呈增加
势态 ,因而使 DNA 含量相对下降.崔 等[ 6]的研
究结果与此相似 ,绿豆子叶脱分化过程中总 RNA
含量的增加主要是 25S 和 18S 的 rRNA ,对照子
叶切段比形成愈伤组织的切段中自由氨基酸的含
量明显偏高 ,而结合氨基酸的含量却低 ,在形成愈
伤组织的子叶中是以合成为主.
2.3　淀粉含量的变化
用蒽酮法测定了香荚兰脱分化过程中淀粉含
量的变化 ,结果表明 ,在培养的前 2 d ,外植体中淀
粉含量上升速度较快 ,2 ～ 4 d ,淀粉含量下降 , 4 ～
12 d ,淀粉含量稍许上升 ,12 ～ 16 d ,淀粉含量又下
降.在 16 ～ 28 d ,淀粉含量又增加.淀粉作为一种
在细胞中可利用的能源和结构物质 ,在脱分化过
程中呈现出一个累积 、消耗 、再累积的变化过程.
参 考 文 献
[ 1] 曹孟德 , 秦东春 ,陈奇才等.香荚兰细胞悬浮培养产生
香兰素的研究.华中理工大学学报 , 1998 , 26(5):8 ～
10
[ 2] 曹孟德 , 李家儒 ,王君健.香荚兰细胞悬浮培养产生香
兰素条件的研究.生物技术 , 1999 , 9(1):8～ 10
[ 3] 曹孟德 , 陈奇才 ,李家儒等.香荚兰愈伤组织的培养及
其香兰素形成的研究.华中理工大学学报 , 1997 ,
25(5):79 ～ 81
[ 4] Madison J T , Thompson J F , Menuster A M E.De-
oxy ribonucleic Acid , Ribonucleic Acid , P rotein and Un-
combined Amino Acid Content o f Legume Seeds During
Embryogeny.Ann Bot., 1976 , 40(168):745 ～ 756
[ 5] 袁晓华 ,杨中汉.植物生理生化实验.北京:高等教育
出版社 , 1983.
[ 6] 崔　 , 唐定台 ,宋艳茹等.植物形成愈伤组织的激素
调节与核酸及氨基酸代谢的关系.中国科学(B 辑),
1984 (10):910 ～ 914
　
Comparison Study of the Change of the Protein , Nucleic Acid and
Starch Contents During the Callus Formation of Vanilla Planifonia
Cao Mengde　Qin Dongchun　Li Jiaru　Wang Junjian
Abstract:The change of pro tein , RNA , DNA and starch contents during the explants dedif ferentiation and
callus formation of the Vanilla planifonia is reported.It is show n that the protein , RNA contents increase in
total , but the DNA contents decrease relatively in comparison with the protein and RNA contents , and the
starch contents change f rom high level to low level , then to high level with the process of dedif ferentat ion of
V .planifonia explants.
Key words:Vanilla planifonia;tissue culture;dedifferentiation
Cao Mengde　Dr.;College of Basis Medicine , Henan Medical University , Zhengzhou 450052 , China.
102　　　 　　　　　　　　　　　　　　华　中　科　技　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　2001年