全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (12) : 1843 - 1848
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 07 - 08; 修回日期 : 2008 - 09 - 08
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 ( 2006AA100109) ; 国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD01A18 ) ; 北京市花卉重点项目 ( YL2
HH2006001, YLHH2006002)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: m ingjunmail@ yahoo1com1cn)
喇叭水仙中百合斑驳病毒的 RT2PCR检测及序列
分析
刘　博 1 , 明 　军 13 , 刘 　春 1 , 罗凤霞 2 , 王春城 3 , 单宏臣 3 , 王晓武 1 ,
穆　鼎 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 金陵科技学院园艺学院 , 南京 210038; 3 北京园林绿化局花卉产
业处 , 北京 100029)
摘 　要 : 根据基因库中已发表的百合斑驳病毒 (L ily m ottle virus, LMoV ) 外壳蛋白基因序列设计引物 ,
通过 RT2PCR从喇叭水仙 (N arcissus pseudonarcissus) ‘Pink2charm’样品中扩增出 1条大小与试验设计相符
的 553 bp的特异性 LMoV RT2PCR带。扩增产物序列分析表明 : 与 GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核
苷酸相似性在 90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列 ABW 16938, 发现它完全存在于 GenBank
登录的 LMoV病毒外壳蛋白序列 NP2945145中 , 确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。
关键词 : 喇叭水仙 ; 百合斑驳病毒 ; RT2PCR; 病毒检测
中图分类号 : S 682　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2008) 1221843206
D etection and Sequence Ana lysis of L ily m ottle virus in N a rc issus pseudona r2
c issus from the Netherlands by RT2PCR Techn ique
L IU Bo1 , M ING Jun13 , L IU Chun1 , LUO Feng2xia2 , WANG Chun2cheng3 , SHAN Hong2chen3 ,
WANG Xiao2wu1 , and MU D ing1
( 1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 2 College of Horticulture,
J in ling Institu te of Technology, N an jing 210038, Ch ina; 3B eijing M unicipa l B ureau of Parks and A fforesta tion D ivision of F low er
Industry, B eijing 100029, Ch ina)
Abstract: L ily m ottle virus (LMoV ) was detected in N arcissus pseudonarcissus using one set of specific
p rimer by reverse transcrip tion2polymerase chain reaction (RT2PCR). A 553 bp DNA fragment was amp lified
from the samp le of‘Pink2charm’using p rimers L1 (5′2TGGGCACCTTGTGAATTAC23′) and L2 (5′2 TGCT2
GTATGCCTCTCCGTGC23′). The p rimer was designed according to the published sequence of the coat p rotein
of LMoV in the GenBank. Nucleotide sequence of the fragment ( GenBank accession No. EU167936) showed
more than 98% identity with other isolates ( GenBank accession No. : AJ748256, AJ564636, AB053256,
AF531458, AJ564637, AJ748257). Remarkably high sim ilarity in the nucleotide has been observed desp ite
of their different origins. Besides, am ino acid sequence of the amp lified virus fragments ( GenBank accession
No. ABW 16938) is overlapped by the am ino acid sequence of LMoV coat p rotein ( GenBank accession No.
NP2945145).
Key words: N arcissus pseudonarcissus; L ily m ottle virus; RT2PCR; virus detection
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园 　　艺 　　学 　　报 35卷
　　喇叭水仙 (N a rcissus pseudonarcissus) , 别名洋水仙、漏斗水仙 , 为石蒜科水仙属具肥大鳞茎的多
年生草本植物。中国从 19世纪末开始从荷兰引进喇叭水仙 (中国农业百科全书观赏园艺卷编辑委员
会 , 1996)。目前对喇叭水仙的携带病毒情况以及是否对中国水仙 (N arcissus tazetta var. ch inensis) 构
成危害等相关研究较少。
据报道 , 喇叭水仙可能存在 4种以上 PVY组病毒单独或复合侵染 (B runt, 1971; A sjes, 1976;
Bos, 1976)。随着 PVY组病毒分子结构及其功能研究的不断深入 (Langeveld et al. , 1991; Rosner et
al. , 1992; Dekker et al. , 1993) , 利用编码外壳蛋白核酸序列基因的同源性差异可以作为诊断和鉴定
PVY组病毒的依据 ( Shukla &W ard, 1989; Robertson et al. , 1991; Rosner et al. , 1992)。在我国 , 仅
见陈枝楠 (1995) 报道喇叭水仙上存在 4种以上 PVY组病毒侵染 , 它们可能是 TBV、NYSV、NSSV
和 OnYDV。
百合斑驳病毒 (L ily m ottle virus, LMoV) 是马铃薯 Y病毒属 ( Potyvirus) 的重要病毒之一 , 分布
范围较广 , 在意大利、日本、以色列、荷兰、中国台湾等地均有报道。该病毒是危害百合属和郁金香
属作物的重要病毒病原 (A sjes, 2000; Zheng et al. , 2003; 刘文洪 等 , 2004; 徐榕雪 等 , 2007) , 在
水仙上未见报道。
为掌握进口水仙病毒病情况 , 本研究中参考设计了一对特异引物 , 利用 RT2PCR技术 , 对部分进
口材料进行相关病毒的检测分析 , 首次在喇叭水仙中检测到 PVY组病毒属另一重要成员 LMoV。
1　材料与方法
111　试验材料
以 2006年从荷兰进口的喇叭水仙 (N arcissus pseudonarcissus) ‘Pink2charm’和 ‘Fortissimo’品
种 , 风信子 (Hyacin thus orien ta lis) ‘Woodstock’和 ‘Fondant’品种 , 东方百合 (O riental hybrids
lily) ‘Sorbonne’、‘Siberia’和 ‘Tiber’品种为试验材料。试验于 2007年 8月在中国农业科学院蔬菜
花卉研究所生物技术室完成。
112　试验方法
11211　总 RNA的提取 　
采用北京百泰克公司的 RNA提取试剂盒提取喇叭水仙鳞茎组织总 RNA。取 011 g植物组织用液
氮研磨 , 放入盛有 1 mL裂解液的离心管中 , 振荡混匀 , 室温静置 5 m in。4 ℃条件下 12 000 r·m in - 1
离心 10 m in, 取上清液。加 012 mL氯仿 , 12 000 r·m in - 1离心 10 m in, 取上层无色水相转移到新管
中 , 加入 1倍体积 70%的乙醇 , 混匀。得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中 , 10 000 r·m in - 1离心
40 s, 弃掉废液。加蛋白液和漂洗液以及离心的步骤均按说明进行。取出吸附柱 , 转入一个新的
RNase free的离心管中 , 根据预期 RNA产量在吸附膜的中间部位加 50μL ddH2 O (RNase free) , 室温
放置 2 m in, 12 000 r·m in - 1离心 1 m in。 - 20 ℃保存或进行 RT2PCR扩增。
11212　引物 　
根据 NCB I GenBank上已登录的 LMoV 病毒外壳蛋白基因序列设计引物 : 5′端引物 L1为 : 5′2
TGGGCACCTTGTGAATTAC23′; 3′端引物 L2为 : 5′2TGCTGTATGCCTCTCCGTGC23′。
11213　RT2PCR反应体系 　
反转录体系为 20μL。200μL试管中加入下列组分 : O ligo ( dT) 18 ( 500μg·mL - 1 ) 1μL,
total RNA 4μL, dNTPsM ix (10 mmol·L - 1 ) 1μL, ddH2 O 6μL。65 ℃水浴 5 m in并迅速置于冰上冰
浴 , 再加入下列组分 : 5 ×First2Strand Buffer 4 μL, Inhibitor ( TaKaRa) 1 μL, 011 mol·L - 1 DDT
2μL。轻轻混匀后 , 42 ℃水浴 2 m in。加 1μL (200 units) SuperScrip tTMⅡ RT, 轻轻混匀 , 42 ℃水
浴 50 m in, 70 ℃ 15 m in。
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PCR反应体系为 20μL, 包括 Taq PCR buffer (内含 115 mmol·L - 1MgCl2 ) , 200μL·L - 1 dNTPs
M ix, LMoV上下游引物各 5 pmol·L - 1 , 5μL cDNA , 1 U Taq酶。 PCR程序 : 95 ℃预变性 4 m in,
94 ℃变性 20 s, 52 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 30个循环 , 再 72 ℃延伸 5 m in, 16 ℃保存 , 最后
4 ℃结束反应。
在 9700PCR仪上进行扩增 , 进行琼脂糖 ( 110% ) 凝胶电泳 , 用 GelDoc1000凝胶分析仪 (B io2
Rad) 观测电泳结果 , 并照相记录。
11214　试验重复与 PCR扩增产物的测序 　
在得到阳性扩增后 , 全部试验重复 1次。得到的 RT2PCR扩增产物经回收纯化后 , 用 pDM182T
vector载体连接转化大肠杆菌 DH 5α感受态细胞 , 在 LB培养基上 37 ℃培养 16 h挑取白色菌落 , 碱
裂解法提取质粒 DNA , 利用 PCR技术进行阳性克隆筛选。
DNA测序由中国农业科学院重大工程试验室完成 , 采用 DNAStar的 Megalign程序和聚类法
( clustering method) 将病毒扩增片段测序结果与 GenBank数据库中已登录的其它分离物的核苷酸序列
进行同源性比较。
2　结果与分析
211　RT2PCR检测结果
如图 1所示 , 泳道 1有一条明显条带与泳道 5和泳道 7的条带位置相同 , 为检测到的喇叭水仙
‘Pink2charm’阳性材料 , 泳道 5为检测到的百合阳性材料 ‘Sorbonne’ ( EU348826) , 泳道 7为阳性
对照 ( EU348827) , 泳道 9为阴性对照。
重复试验表明 , ‘Pink2charm’确有相同大小的特异扩增条带 , 而其他品种均未扩增出特异条带。
经测序比对确定该喇叭水仙中含有马铃薯 Y病毒属病毒 LMoV。
图 1　RT2PCR检测不同材料 LM oV结果的琼脂凝胶电泳图
1. 检测到的喇叭水仙 ‘Pink2charm’阳性材料 ; 2. 喇叭水仙 ‘Fortissimo’; 3. 风信子 ‘Woodstock’;
4. 风信子 ‘Fondant’; 5. 百合阳性材料 ‘Sorbonne’; 6. 百合 ‘Tiber’;
7. 百合材料阳性对照 ; 8. 百合 ‘Siberia’; 9. 阴性对照。
F ig. 1　Agarose gel electrophoresis of RT2PCR am plif ied products for the detection of LM oV
1. N arcissus pseudonarcissus‘Pink2charm’tests positive; 2. N arcissus pseudonarcissus‘Fortissimo’;
3, 4. Hyacinthus orien ta lis‘Woodstock’and‘Fondant’; 5. O riental hybrids lily‘Sorbonne’;
6. O riental hybrids lily‘Tiber’; 7. L ily positive control;
8. O riental hybrids lily‘Siberia’; 9. Negative control.
212　序列分析
对特异引物 L1 /L2的扩增产物进行克隆测序 , 获得了 ‘Pink2charm’LMoV目的片段的核苷酸序
列 p ink2charm 2LMoV, 长度为 553 bp。
将该序列与 GenBank上已登录的病毒基因序列作 BLAST。分析发现该序列与 6个百合斑驳病毒
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多聚蛋白基因序列 AJ748256、AJ564636、AB053256、AF531458、AJ564637、AJ748257相似性均在
98%以上 , 与 9个百合斑驳病毒基因序列 AJ874695、AJ310203、 EF158108 (徐榕雪 等 , 2007 )、
AB054886、AM048875、AJ874696、AJ879511、S60810、AY464944相似性也在 90%以上。
图 2为 ‘Pink2charm’LMoV扩增片段与其它近似病毒分离物核苷酸序列的系统进化树。此外 ,
将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列 (ABW 16938) , 图 3为扩增片段蛋白序列与其它近似病毒分
离物蛋白序列比对的系统进化树。从图 3中也看出它们的相似度非常高 , 据此判定待测水仙中确有百
合斑驳病毒。该序列已在 GenBank上登录 , 序列号为 EU167936。
除此之外 , p ink2charm2LMoV与郁金香碎色病毒百合株系 ( Tulip break ing virus lily strain) 多聚蛋
白基因序列 S44147 相似性达 95% , 与郁金香带状碎色病毒 ( Tulip band break ing virus ) 序列
AB090385、AB078007、S60805相似性分别为 91%、89%和 89%。
图 2　‘P ink2charm’LM oV目的片段序列与其它分离物 LM oV核苷酸序列的系统进化树
AJ748256、AJ564636、AF531458、AJ564637、AJ748257、AJ874695、AJ310203、EF158108、AM048875和 AJ874696为百合斑驳病毒
中国分离物 ; AB053256和 AB054886为百合斑驳病毒日本分离物 ; AJ879511为百合斑驳病毒印度分离物 ;
AY464944为百合斑驳病毒韩国分离物 ; S44147来自郁金香碎色病毒百合株系 ;
AB090385、S60805、AB078007来自郁金香带状碎色病毒 ;
S60810为百合斑驳病毒分离物 ; p ink2charm2LMoV
为试验所得扩增序列。
F ig. 2　Phylogenetic dendrogram show ing the rela tion sh ip of nucleotide sequences of p ink2charm 2LM oV w ith others or ig in LM oV
AJ748256, AJ564636, AF531458, AJ564637, AJ748257, AJ874695, AJ310203, EF158108, AM048875 and AJ874696
are isolated from China; AB053256, AB054886 were isolated from Japan; AJ879511 was isolated from India;
AY464944 was isolated from Korea; S44147 was from Tulip breaking virus lily strain;
AB090385, S60805, AB078007 were from Tulip band breaking virus;
S60810 was from LMoV; p ink2charm2LMoV was
amp lified sequence in this experiment.
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图 3　‘P ink2charm’LM oV目的片段蛋白序列与其它分离物 LM oV蛋白序列比对的系统进化树
ABY60990、CAG38601、CAG38602、ABY25310为百合斑驳病毒中国分离物 ; BAB83661和
BAD02938为百合斑驳病毒日本分离物 ; ABX65301为百合斑驳病毒韩国分离物 ;
CAD92111为百合斑驳病毒英国分离物 ; AAB19407来自郁金香碎色病毒 ;
ABW16938为试验所得扩增序列蛋白。
F ig. 3　Phylogenetic dendrogram show ing the rela tion sh ip
of prote in sequences of p ink2charm 2LM oV w ith others or ig in LM oV
ABY60990, CAG38601, CAG38602, ABY25310 were isolated from China;
BAB83661 and BAD02938 were isolated from Japan; ABX65301 was
isolated from Korea; CAD92111 was isolated from United Kingdom;
AAB19407 was from Tulip breaking virus;
ABW16938 was amp lified sequence p rotein in this experiment.
3　讨论
目前已报道的水仙病毒有 20多种 (林含新 等 , 1996) , 以水仙花叶病毒 (NMV) 和水仙黄条病
毒 (NYSV ) 最普遍。本试验从水仙中检测到百合斑驳病毒 (LMoV ) 为首次报道。该病毒单独或与
其他病毒复合侵染百合和郁金香时常表现为花瓣颜色斑驳。目前 , 尚未发现待测喇叭水仙植株花朵颜
色明显异常 , 可能是病毒侵染时期较短 , 积累量不够 , 尚未表现斑驳症状 , 也可能有其他病毒存在对
其产生拮抗作用 , 使之不表现明显受害症状。种植前球的表面有黄褐色斑点 , 组培球长势受抑制。
通过该病毒测序结果与其它分离物序列的比对可知 : 该病毒的外壳蛋白基因序列与其它大部分分
离物的相似性均在 90%以上 , 证明外壳蛋白在病毒的传播和保护病毒 RNA方面起重要作用且相对保
守 (徐榕雪 等 , 2007) , 根据外壳蛋白序列设计引物能检测不同来源的 LMoV。然而 , RT2PCR扩增
的特异条带不能完全排除出现假阳性条带的可能 , 所以本试验通过测序及序列相似性分析 , 可以有效
验证真假阳性。
百合斑驳病毒 L ily m ottle virus (LMoV) 又名郁金香碎锦病毒百合株系 Tu lip breaking virus lily strain
( TBV百合株系 ) , 是危害百合的主要病毒之一 (丁元明 等 , 2004 )。目前国际病毒分类委员会
( ICTV) 将郁金香带状碎色病毒 ( TBBV ) 和百合斑驳病毒 (LMoV ) 暂定为一种病毒 ( Fauquet et
al. , 2005)。本试验所得 ‘Pink2charm’LMoV 目的片段序列与 TBV 百合株系多聚蛋白基因序列
S44147相似性达 95% , 与 TBBV外壳蛋白基因序列相似性为 91% , 与 LMoV相似性在 89%以上。根
据国际病毒分类委员会 ( ICTV ) 第 7次报告的分类标准 , 不同 Potyvirus属成员 CP氨基酸序列同源性
应小于 85% , 可以确定该分离物为百合斑驳病毒。陈枝楠 (1995) 利用简并引物 RT2PCR扩增技术 ,
结合 RT2PCR扩增片段限制性片段长度多态性 (RFLP) 分析 , 对洋水仙 14个病毒病样品进行分组检
测。结果表明洋水仙植物上存在有 4种以上 PYV组病毒侵染 , 它们可能是 TBV、NYSV、NSSV和 On2
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YDV等 , 但未能确定。本研究利用现代分子生物学手段 , 应用特异引物克隆到病毒序列并进行了序
列分析 , 确定了洋水仙上存在 PVY组成员 LMoV。
本研究通过 RT2PCR和基因序列分析比较 , 对荷兰进口水仙进行带毒情况检测 , 检测到百合斑驳
病毒 , 为以后检测其他来源的 LMoV提供依据。我国是荷兰球根花卉最大的进口国之一 , 2005年进
口各种种球超过 1亿头 ( Pieter, 2006)。随着进出口贸易的不断加大 , 入境的水仙鳞茎球数量逐年增
加 , 其携带病毒进入我国的危险也在加大。因此 , 需加强病毒检测 , 提高检测效率 , 以便采取相关措
施 , 避免对我国水仙造成危害。
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