全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 631
收稿 2009-09-14 修定 　2010-05-14
资助 国家自然科学基金(40676079、40976078)和广州市植
物抗逆基因功能研究重点实验室开放基金。
* 通讯作者(E-mail: jrxia@gzhu.edu.cn; Tel: 020-39366937)。
微藻碳酸酐酶的特性及其环境调控
黄瑾 1, 夏建荣 1,*, 邹定辉 2
1广州大学环境科学与工程学院, 广州 510006; 2华南理工大学环境科学与工程学院, 广州 510006
提要: 本文概述微藻碳酸酐酶的性质、种类、分布、分离纯化和环境调控的研究进展, 并对未来有关微藻碳酸酐酶研究中
需要探讨的问题作了展望。
关键词: 微藻; 碳酸酐酶; 环境调控
Characteristics and Environmental Regulation of Carbonic Anhydrase in
Microalgae
HUANG Jin1, XIA Jian-Rong1,*, ZOU Ding-Hui2
1School of Environmental Science and Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China; 2College of Environmental
Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China
Abstract: The advances in the characteristics, type, distribution, purification and environmental regulation of
carbonic anhydrase in microalgae are outlined, and further researches for better understanding carbonic anhy-
drase in microalgae are prospected.
Key words: microalgae; carbonic anhydrase; environmental regulation
碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)是一种含
Zn2+的金属酶, 在CO2和HCO3-相互转化的可逆反
应中起催化作用; 在水合作用时, CO2在酶活性中
心与 Zn-OH反应, 而在脱水作用时, HCO3-与 Zn-
H2O反应。此酶最初是在哺乳动物的红细胞中发
现的, 并随后在鱼类、无脊椎动物、植物和微生
物中相继发现。尽管催化同一化学反应, 但其在不
同有机体中所起的生理作用存在较大差异, 它可以
涉及离子交换、呼吸作用、pH 稳定性、二氧化
碳浓缩机制以及光合作用的各个方面( D i e t e r
1998)。微藻是水体(包括湖泊、水库和海洋)环境
中主要的初级生产者, 其光合固碳量约占全球总光
合固碳量的 50%, 长期以来, 微藻光合固碳作用的
研究一直是水生生物学和藻类学工作者非常关注的
一个问题。与陆生高等植物一样, 核酮糖 -1,5-二
磷酸羧化氧化酶(Rubisco)也是藻类固定 CO2的关
键酶, 藻类中 95%以上的有机碳均是Rubisco所固
定的。水体中微藻的光合固碳受两大天然因素的
制约, 一方面, 微藻的 Rubisco对 CO2的亲和力远
比陆生高等植物的要小; 另一方面, 因为 CO2在水
中的扩散速率比空气中要慢一万倍, 水体中CO2的
供应少。但是水体中微藻的光合效率很高, 甚至比
陆生高等C4植物还要高, 其主要原因是其细胞内存
在二氧化碳浓缩机制(CO2 concentrating mechanism,
CCM) (Badger和 Price 1992; Raven等 2008; Martin
和 Tortell 2008)。藻细胞既可以间接地通过质膜
主动转运HCO3-进入胞液, 在细胞内通过碳酸酐酶
的作用将HCO3-转变为CO2; 也可以直接通过胞外
CA催化细胞表面的HCO3-转变为CO2, CO2再以扩
散作用进入细胞内, 经胞内和胞外CA的作用保持
细胞内有稳定浓度的 CO2供给 Rubisco, 使藻细胞
在 CO2浓度限制的环境中维持较高的光合作用效
率。由此可见, CA在藻类植物碳运输和碳代谢中
起着非常重要的作用。本文简要介绍微藻碳酸酐
酶的种类、定位、性质及其受到环境因子调控的
综　述Reviews
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月632
研究进展。
1 微藻CAs的种类
单细胞微藻中有许多形式的CAs (Badger 2003;
Moroney等 2001)。至今已发现 5种独立的类型,
包括 α-、β -、γ -、ζ- 和 δ-CA。尽管它们主要
序列没有明显的相似性, 但其活性位点大多结合 1
个对其酶活性很重要的锌原子(Moroney等 2001;
Soto等 2006)或者镉原子(Lane和Morel 2000; Lane
等 2005; Soto等 2006), 而且催化机制也都比较相
似(Badger 2003)。大多数 α-CAs都是分子量为 30
kDa左右的单体, 其酶活性部位的锌原子都有 3个
保守的组氨酸残基和 1个水分子与之配位, 一般对
磺胺类抑制剂很敏感(Karlsson等 1995)。所有的
有活性的β-CAs既有单体, 也可以是含有 1个保守
的组氨酸残基及2个半胱氨酸残基的杂合体, 杂合
体中各残基分别与锌原子结合。γ-CAs的结构与
α-CAs和β-CAs明显不同, 它是由相同亚单位组成
的同型三聚体, 含有 3个锌原子。与 α-CAs相似,
γ-CAs活性部位的锌原子也有 3个组氨酸残基和 1
个水分子与之配位, 但是其组氨酸残基含有2个单
独的亚基。γ - C A s 也对磺胺类物质高度敏感
(Badger 2003)。近几年来在微藻中又陆续发现了
新的 CA种类, 包括 ζ-和 δ-型 CAs。ζ-CAs存在于
海链藻(Thalassiosira weissflogii和 Thalassiosira
pseudonana)中, 与 α-、β-、γ-CAs不同, 它是一
种含镉的CA, 具有镉结合位点且镉原子与2个或更
多个硫醇盐结合, 与高等植物中的含锌 CA的金属
结合位点有2个半胱氨酸残基和1个组氨酸残基相
类似(Lane等 2005; McGinn和Morel 2008)。δ-CAs
是从海洋颗石藻(Emiliania huxleyi)中鉴定出来的。
2 微藻CAs的分离与纯化
探索合适的CA分离纯化方法对进一步研究其
性质非常重要。芳香磺胺类物质是有效的CA特异
性抑制剂, 早在20世纪60年代, 磺胺米隆(sulfamylon,
对位氨甲基磺胺药物)就已经作为亲和层析的非水
溶性填料(sulfamylon sepharose, 即 p-aminometh-
ylbenzene sulfonamide-agarose, p-AMBS)用于CA纯
化。在温和的条件下, 用含有 CA抑制剂的洗脱液
能将 CA洗脱下来, 以此达到分离纯化 CA的目的
(Whitney 1974)。Yang等(1985)方法的大致流程是:
高速离心收集微藻细胞→30%~65%硫酸铵分级沉
淀→透析除盐→p-AMBS亲和层析→透析除盐得到
纯化的CA。此后很多研究者对这一方法进行了一
定程度的改良, 如Satoh等(1998)分离纯化耐热性小
球藻(Chlorella sorokiniana) CA的方法过程大致是:
DEAE-纤维素A-500离子交换层析→与HPLC系统
连接的Econo-PacQ离子交换层析→ p-AMBS亲和
层析; Satoh等(2001)按照Yang等(1985)的方法研究
三角褐指藻胞内 CA的生理和分子特性时, 在硫酸
铵分级沉淀后, 将样品依次通过DEAE-sephacel离
子交换层析和p-AMBS亲和层析, 最后脱盐浓缩获
得纯化的 CA蛋白。总的来说, CA的分离纯化最
终少不了 p-AMBS亲和层析这一步。
3 微藻CAs的性质
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的CA是
真核藻类中研究得最广泛的。已经发现莱茵衣藻
中存在6种编码CA的基因, 包括3种α-CAs和3种
β-CAs (Kucho等 2003; Mitra等 2004; Ynalvez等
2008), 其中 2种 α型胞外 CAs (Cah1和 Cah2)的核
编码基因已得到鉴定, 它们的氨基酸序列有 91.8%
的相似性, 与动物CA有 20%的相似性。每个基因
都编码2个分子量大小不同的多肽, 即先翻译成分
子量为 41.6 kDa的前体, 随后加工成 1个糖基化的
分子量为 35~37 kDa的大亚基和 1个分子量为 4.1
kDa的小亚基(Mitra等 2004)。Cah1的转录受 2个
调节区域控制: 1个在高浓度CO2条件或黑暗条件
下抑制转录的沉默子区域和1个在低浓度CO2和光
照条件下激活转录的增强子区域, 增强子区域中的
2个增强子都有一段在激活中起主要作用的短而保
守的DNA序列, 并且有与增强子相合的DNA结合
蛋白(Kucho等 2003)。定位于叶绿体中类囊体膜
内侧的α-CA (Cah3), 其分子量为29.5 kDa, 这种蛋
白在细胞匀浆中主要以不溶性片段出现, 只有用高
浓度氯化钾冲洗膜后才可溶解, 纯化的Cah3对硫铵
类抑制剂很敏感(Hanson等 2003)。另外, 莱茵衣
藻2种线粒体β-CAs (β-ca1和β-ca2)的氨基酸序列
之间有97%的相似性, 各由1个反向重复序列构成
(Giordano等 2003)。叶绿体β-CA Cah6与其他 2种
线粒体 β-CAs不同, 核苷酸序列数据表明 Cah6的
cDNA包含一段 264 bp的开放阅读框架, 它所编码
的多肽的导肽序列能够将蛋白靶定到叶绿体基质上
(Mitra等 2004)。
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CAs在海洋微藻如三角褐指藻(Phaeodactylum
tricornutum)、威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)、
中肋骨条藻(Skeletonema costatum)以及海洋颗石藻
(Emiliania huxleyi)中均有报道。三角褐指藻的
PtCA1属于 β型CA, 分子量约为 26 kDa, 有 1个完
全保守的锌结合区域, 由核基因编码。编码PtCA1
的 cDNA序列(ptca1)含有 282个氨基酸, 拥有一段
138 bp的前体序列(pre138), pre138编码一段 46个
氨基酸的N端序列(Pre46AA), 推测 Pre46AA可作
为 PtCA1的引导信号, 引导 PtCA1在细胞中的定
位。成熟的 PtCA1蛋白由 236个氨基酸组成, 但
不含有Pre46AA (Tanaka等 2005; Sakaue等2008)。
三角褐指藻的另一种β型CA为PtCA2, 其cDNA有
一个 819 bp的开放阅读框架(它编码一个 273个氨
基酸的多肽), 其编码基因 PtCA2与 PtCA1有 83%
的相似性; PtCA2的氨基酸序列拥有完全保守的Zn
结合残基。PtCA2 N末端的 19个氨基酸序列是一
种内质网靶定信号, 蛋白可能定位在一种细胞器或
周质空间中(Harada和Matsuda 2005; Kitao等
2008)。威氏海链藻中有一种含锌的CA (TwCA1),
通过克隆其相应的cDNA (twca1)后, 发现其序列与
其他藻类CA不同, 编码分子量约为34 kDa的蛋白,
TwCA1氨基末端的氨基酸序列由起始蛋氨酸和其
下游的 72个氨基酸残基组成。这些差异可能由于
存在一个短期的信号序列, 可以引导酶进行正确的
细胞定位(Roberts等 1997)。威氏海链藻中还存在
一种含镉的 ζ-CA (CdCA1), 其蛋白分子量约为 69
kDa (Lane等 2005)。从中肋骨条藻已分离鉴定出
位于细胞膜外侧的CA, 其分子量约为30 kDa (Nimer
等 1999)。颗石藻中含有 2种独特的 CA, 分别属
于γ和δ类的CA (分别为γ-EhCA2和δ-EhCA1) (Soto
等2006), δ-EhCA1的cDNA编码一种含有702个氨
基酸的蛋白, 分子量为 77.3 kDa, 含有 373个氨基
酸的跨膜N端区域和329个氨基酸的C端开放阅读
框架。γ-EhCA2蛋白有 235个氨基酸, 分子量为
24.9 kDa。在评价颗石藻CA的生物学作用问题上,
以前的研究都认为这些酶在多种非光合或与钙化不
相关的功能中起作用, 而忽视了这些 CA在碳代
谢、离子转运、pH 动态平衡和钙化的中间过程
中所表现出来的作用。至于这些 CA的进化、结
构和机制差异尚待进一步研究(Soto等 2006)。
4 微藻CAs的定位
根据CA在细胞内外的分布差异, 可分为胞外
CA (extracellular CA)和胞内CA (intracellular CA)。
胞外 CA常分布于细胞的周质空间(periplasmic
space), 胞内 CA的分布常因细胞种类的不同而不
同, 现已发现的有: 叶绿体 CA (chloroplast CA,
cCA)、线粒体 CA (mitochondria CA, mCA)和细胞
质 CA (cytoplasm CA, cpCA) (Nimer等 1998)。
4.1 周质空间CA (periplasmic CA, pCA) 一般天然
海水的 pH为 7.8~8.3, 其中的无机碳以碳酸氢根形
式为主, 而游离的 CO2浓度很低, 不足以维持微藻
的光合作用, pCA能使海洋中大量的HCO3-转化为
CO2, 因而使得微藻细胞可充分利用胞外无机碳
(Dieter 1998)。
4.2 叶绿体CA (chloroplast CA, cCA) 用传统方法
很难测出 cCA活性, 一般用 18O交换质谱以及 77K
荧光光谱和免疫学技术联合才可检测出 cCA的存
在(van Hunnik等 2001; Park等 1999; Villarejo等
2001)。莱茵衣藻的一种 α-CA (Cah3)定位于类囊
体膜内侧, 与光系统 II (PS II)相耦联, 其CCM的启
动和维持依赖于PS II介导的电子传递所引起的跨
类囊体膜的 pH梯度, 因此可以推测类囊体膜介导
的 CCM是由 PS II驱动的, 并由与 PS II相耦联的
CA催化(Park等 1999; Villarejo等 2001)。Cah3的
主要功能是催化类囊体内腔的HCO3-水解, 可为定
位于叶绿体蛋白核中的 Rubisco提供充足的 CO2。
大部分绿藻的 Rubisco存在于蛋白核中, cCA可能
与蛋白核结构相关联, 就象蓝藻有些胞内CAs特异
定位在接近 Rubisco的羧体中一样。普通小球藻
(Chlorella vulgaris)有一种与蛋白核有关的胞内CA,
可能在其CCM机制和适应低浓度CO2的过程中起
作用(Villarejo等 1998)。
4.3 线粒体CA (mitochondria CA, mCA) 有实验
表明, 线粒体 CA可能参与为磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶催化反应提供HCO3-, 也为氮同化提供碳骨架
(Giordano等 2003)。莱茵衣藻的 β-CAs (β-ca1和
β-ca2)可能在呼吸作用和光呼吸的CO2循环中起作
用, 将线粒体中的CO2转化为HCO3-, HCO3-流回到
细胞质, 再转运到叶绿体基质中。
4.4 细胞质CA (cytoplasm CA, cpCA) cpCA的种
类相对较少, 至今只发现在少数种类的植物中存在,
植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月634
如在单细胞绿藻 Coccomyxa中发现定位于细胞质
中的 β-CA, 此酶的天然形式是一种分子量大小为
100 kDa的同型四聚体(Dieter 1998), 但其生理作用
尚不清楚。
5 环境调控对微藻CAs的影响
CA在微藻光合固碳中具有比较重要的作用, 其
活性与光合效率直接相关, 微藻中 CA活性的调控
一直是 CA研究中的一个重点问题。CA活性受多
种环境因素的调控, 如 CO2浓度、光照、pH值、
温度以及金属元素等。
5.1 CO2浓度 单细胞微藻有多种形式的CA, 其表
达受环境中 CO2水平的影响(Badger 2003)。小球
藻(Chlorella saccharophila)在低CO2浓度条件下, CA
受诱导, 胞外活性明显升高, 而在较高 CO2条件下
活性受抑制(Beuf等 2000; Williams和 Colman
1993)。莱茵衣藻 Cah1在高浓度 CO2 (5%)培养下
表达受抑制, 转入低浓度 CO2 (0.04%)后, 1 h内此
酶的表达被激活(Karlsson等 1995; Kucho等2003);
而Cah2在低浓度CO2条件下表达很少, 在高浓度CO2
条件下有轻微的增加(Karlsson等 1995)。小球藻
(Chlorella vulgaris)从高浓度 CO2 (5%)转移到低
浓度 CO2 (0.03%)后, 胞内 CA活性 6 h内增加了
6~7倍(Villarejo等 1998)。莱茵衣藻 β-cCA (Cah6)
在低浓度 CO2 (空气)条件下的表达仅有轻微提高
(Mitra等 2004), 而它的 2种 β型mCA (β-ca1和 β-
ca2)的表达明显受生长过程中CO2浓度的影响, 即
在低浓度CO2下被大量诱导, 而在高浓度CO2下则
受抑制(Giordano等 2003)。三角褐指藻中一种定
位于叶绿体基质中的 β-CA (PtCA1)在大气 CO2浓
度水平下培养是引发ptca1的转录所必需的(Harada
等 2005)。通过改变周围的 CO2浓度, 在转录水平
上调控其编码基因的表达, 即通过滤空气培养的细
胞中 CA基因转录水平比 5% CO2培养的细胞高
5~10倍(Satoh等 2001)。中肋骨条藻的 pCA只有
当CO2浓度低于5 mmol·m-3时才能检测到(Nimer等
1998)。
5.2 光照 莱茵衣藻 CA活性的诱导与光合作用中
的能量流动速率有关, 有人推测光在 CA转录水平
上的调节中是必需的, 同时还发现 CA转录调节过
程中存在一种蓝光的促进机制(Dionisio-Sese等
1990)。高光强对于铜绿微囊藻(Microcystis aeru-
ginosa)的生长并不是最有利的,但是CA活性仍然受
高光强所诱导(王山杉等 2006)。Harada和Matsuda
(2005)将三角褐指藻从 5% CO2条件下转入通空气
(0.035% CO2)培养后, 不论在光照还是在黑暗条件
下, 都会引发其β-CA (PtCA1)基因ptca1的转录, 但
黑暗条件下的mRNA含量比光照条件下减少50%,
表明 CO2浓度是引发 ptca1转录的必需条件, 而光
照影响则能调控其转录强度。
5.3 pH 一些淡水微藻, 如莱茵衣藻、小球藻(Chlor-
ella saccharophila、Chlorella regularis 和Chlorella
ellipsoidea), 它们的pCA诱导和活性在酸性条件(pH
4.5)下均受到抑制(Fett和 Coleman 1994; Gehl等
1990; Shiraiwa等 1991; Williams和Colman 1993)。
Beuf等(2000)比较了酸性和碱性条件下绿球藻
(Chlorococcum littorale)的 pCA活性, 发现 pH可能
只影响其CA活性水平, 而不能阻止CA酶的诱导。
Janette和 John (1994)认为酸性 pH下的胞外 CA活
性之所以明显低于碱性pH下的则是由于pH值影响
无机碳的存在形式。在酸性 pH条件下, 培养液中
无机碳主要以CO2形式存在, 有足够的CO2进入细
胞内, 因此胞外 CA活性低; 在碱性 pH条件下无机
碳主要以HCO3-形式存在, 必需依靠胞外 CA催化
HCO3-方可转化成 CO2, 以满足细胞的需要。测定
莱茵衣藻在不同pH值下pCA的活性变化表明, 在
pH 7.2时的 pCA活性最高, 而 pH 5.5时 pCA活性
明显低于 pH 7.2时和 pH 9.0时的活性(陈雄文等
2000); 高 pH下培养的铜绿微囊藻有较高的 CA活
性, 当 pH为 9.0时, CA活性约是 pH 8.0时的 2倍(王
山杉等 2006)。pH值对 CA活性的调节作用, 可能
是通过 pH控制水中CO2的供应来实现的。当然也
有可能是 pH的直接作用, 对此问题尚待进一步研
究。
5.4 温度 水温不仅会影响微藻的生长和呼吸速率,
而且还会影响水中氧的溶解度, 同时也会影响 CA
的活性。例如, 在逐渐降低CO2浓度从3%到0.04%
的条件下, 随着温度的升高, 小球藻(Chlorella
vulgaris)的 CA活性明显上升, 在 32~37 ℃下达到
最大值(Shiraiwa和Miyachi 1985)。高温(30 ℃)下
培养的铜绿微囊藻具有较高的胞外 CA活性(王山
杉等 2006)。
5.5 金属元素 锌是 CA的组成元素, 因此微藻的
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CA活性对锌很敏感。锌浓度会影响固氮鱼腥藻
(Anabaena azotica)的 CA活性(王山杉等 2002); 当
Zn2+浓度从 0增加到 12 pmol·L-1时, 中肋骨条藻的
pCA和胞内CA活性也随之增加(Hu等2003)。Lane
和Morel (2000)报道, 海洋硅藻的CA受低浓度CO2
的诱导, 诱导水平依赖于 Zn2+的浓度。在海洋硅
藻中, 金属元素钙、镉、锌在功能上可以互相替
代, 以维持藻的最佳生长和 CA在 CCM中的作用
(Lane和Morel 2000; Lane等 2005; Xu等 2008)。
6 结语
以淡水绿藻莱茵衣藻和海洋硅藻三角褐指藻
为模式藻类研究CA在藻类光合固碳和无机碳浓缩
机制中作用已取得了一定的进展, 但还有许多问题
仍值得进一步探讨: (1)一些具有重要生态学意义的
藻类, 特别是水华蓝藻和海洋赤潮藻类爆发的时候,
水体中CO2浓度变得很低, 其光合固碳可能更需要
依赖 CA的存在和作用, 爆发过程中藻类的后期生
存也可能与 CA有密切关系, 因此研究水华蓝藻和
海洋赤潮藻类CA的功能及其表达调控的分子机制
对揭示其生存策略具有重要的生态学意义; (2)研究
微藻 CA酶蛋白分子结构与酶活性的关系, 特别是
以其他金属离子取代锌离子后可能造成CA结构和
活性的变化, 从而影响微藻在环境中的生存; (3)现
有CA的环境调控研究一般都是从单个环境因子获
得的结果, 而环境因子的综合效应研究较少, 因此
多种环境因子对微藻CA的协同调控作用研究也值
得重视。
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