全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 329
收稿 2009-11-17 修定 　2010-03-01
资助 国家自然科技资源平台项目(2 00 5D KA21 40 3)和国家
“ 十一五 ” 科技支撑项目（2 0 0 6 B A D 0 7 A 0 4）。
* 通讯作者(E-mail: chenfang@scu.edu.cn; Tel: 028-85417281)。
麻疯树叶中过氧化物酶 JCP-1 的分离纯化和几种特性的检测
叶生亮, 蔡峰, 朱勋路, 秦晓波, 徐莺, 陈放 *
四川大学生命科学学院, 成都 610064
提要: 麻疯树叶片蛋白粗提液经硫酸铵分级沉淀, 强阴离子琼脂糖、强阳离子琼脂糖和交联葡聚糖层析, 得到一个比活
为 4 499 U·mg-1 (蛋白)过氧化物酶, 命名为 JCP-1。其分子量为 49 kDa, 等电点为pH 3.3, 最适pH为5.0~6.0。以H2O2为底物
的Km为 2.14 mmol·L-1。JCP-1具有宽泛的最适保存 pH (7.0~11.0)和较高的耐热性(80 ℃高温处理 15 min, 活性保持在 90%
以上)。30% PEG6000处理模拟干旱胁迫及 50 ℃高温胁迫麻疯树苗, 其叶片中 JCP-1活性分别提高 121%和 155%。
关键词: 麻疯树; 过氧化物酶; 纯化; 酶学性质; 稳定性; 抗逆性
Isolation, Purification and Analysis of Some Characters of Peroxidase from
Leaves in Jatropha curcas L.
YE Sheng-Liang, CAI Feng, ZHU Xun-Lu, QIN Xiao-Bo, XU Ying, CHEN Fang*
College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
Abstract: A peroxidase (JCP-1) was purified from leaves of Jatropha curcas using a multi-step process includ-
ing ammonium sulfate fractionation, Q Sepharose F F, SP sepharose F F and Superdex 75 Prepgrade
chromatography. The purified enzyme exhibited specific activity of 4 499 U·mg-1 (protein). The molecular
weight examined by SDS-PAGE was 49 kDa. The isoelectric point was pH 3.3. The optimum pH value of JCP-
1 was 5.0–6.0. The results of kinetic study showed its high affinity to H2O2 with Km value of 2.14 mmol·L-1.
JCP-1 showed a high thermal stability that it retained over 90% of the activity after 15 min at 80 ℃. The activity
was also stable at a broad pH range of 7.0–11.0. JCP-1 activity in the leaves of J. curcas increased significantly
under 30% PEG6000 or 50 ℃.
Key words: Jatropha curcas; peroxidase; purification; enzymatic character; stability; stress
植物过氧化物酶(peroxidase, POD, EC1.11.1.7)
催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应
(RH2+H2O2→2H2O+R), 以及植物体生长发育及多种
代谢途径, 是植物应答逆境胁迫酶促系统的关键酶
之一。其与超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,
SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)等共同构成植
物中自由基酶促清除系统, 清除在逆境胁迫下植物
体内产生的过剩活性氧自由基, 保护细胞膜脂结构,
进而提高植物抗逆性(Hodge等 1999; Regalodo等
2004)。POD还有一定的商业价值, 可用于合成芳
香族化合物, 去除污水中的酚类物质及食物和水中
的过氧化物等(Torres等 1997)。POD同时是医学
诊断和各种实验研究中的试剂, 广泛用于免疫组
化、酶联反应和免疫印迹等研究领域( V e i t c h
2004)。为寻求更多不同特性、对不同底物的偏
好的商业化 POD, 人们对各种植物来源 POD的研
究也日益增多(Sakharov和Aridilla 1999; Leon等
2002; Thimmaraju等 2007)。
麻疯树是大戟科(Euphorbiaceae)油料植物, 近
年来作为生物柴油的原料之一而受到广泛关注。
特别是其具有很强的抗旱、耐热和耐贫瘠能力, 可
以用于边际土地的栽培, 避免与传统作物争夺农业
用地, 因此有一定的发展前景。目前人们对麻疯树
的了解还很少, 其应答各种环境胁迫的机制尚不清
楚。为此, 本文从麻疯树新鲜叶片中纯化了过氧化
物酶(JCP-1), 并测定了其酶学性质, 对其在高温和
研究报告 Original Papers
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月330
干旱胁迫时的应答也进行了初步分析, 以期为了解
麻疯树抗逆性机制和促进麻疯树资源的综合利用提
供参考。
材料与方法
麻疯树(Jatropha curcas L.)叶片采自四川省西
昌市麻疯树种植基地。胁迫所用材料为本实验室
培养 60 d的麻疯树苗, 培养室温度为(30±2) ℃, 相
对湿度(60±5)%, 光周期 12/24 h。蛋白层析仪器
AKTA Purifier UPC、层析柱与填料均为GE公司
产品, 蛋白浓缩用Amicon Ultra-15 5K离心超滤管
为Millipore公司产品。
随机采集麻疯树成熟叶片 120 g, 用蒸馏水洗
净擦干后切成 2~5 cm的碎片, 加入 360 mL磷酸缓
冲液(20 mmol·L-1, pH 7.0), 于4 ℃条件下, 高速匀浆
10次, 每次 10 s。匀浆液不经过滤, 用磁力搅拌器
于 4 ℃条件下缓慢搅拌 8 h, 后以 10 000×g离心 30
min, 去沉淀, 上清液即为酶蛋白的粗提液。
粗提液于冰浴条件下缓慢加入硫酸铵粉末至
48%饱和度, 于4 ℃下搅拌8 h, 后以10 000×g离心
30 min; 取上清液, 加硫酸铵至 72%饱和度, 于4 ℃
下搅拌 8 h, 后以 10 000×g离心 30 min; 去上清液, 沉
淀用40 mL 1.5 mol·L-1硫酸铵溶液溶解, 后以10 000×g
离心 30 min, 取上清液即为 JCP-1粗酶液。
阴离子交换层析采用脱盐柱 Sephadex G25
(2.6 cm×10 cm)对粗酶液脱盐并将缓冲体系置换为
缓冲液A (50 mmol·L-1 Tris-HCl, pH 8.0), 再将已脱
盐的粗酶液上样到缓冲液A预平衡的HiTrap Q F
F 1 mL预装柱。上样后, 用含不同浓度NaCl (0.1、
0.2、0.3、0.6、1.0 mol·L-1)的缓冲液 A依次进
行阶段洗脱, 每个浓度洗脱体积约 8 mL。分管收
集洗脱峰(1 mL·管 -1, 下同), 经酶活性测定保留有
酶活性的组分。
阳离子交换层析采用 Sephadex G25柱(同上)
对上述步骤收集的样品脱盐并将缓冲体系置换为缓
冲液B (30 mmol·L-1 柠檬酸三钠, pH 4.0), 再将已脱
盐的样品上样到缓冲液 B预平衡的HiTrap SP F F
1 mL预装柱, 同时收集未经层析柱吸附的组分。
上样后, 用 8 mL含 1.0 mol·L-1 的NaCl缓冲液 B洗
脱。分管收集洗脱峰, 保留有酶活性的组分。
葡聚糖凝胶过滤层析用Amicon Ultra-15 5K离
心超滤管将上述步骤收集的活性组分浓缩至 500
mL, 再上样于缓冲液 A预平衡的 Superdex 75柱
(1.6 cm×60 cm), 流速 1 mL·min-1。分管收集洗脱
峰, 保留有酶活性的组分, 即得到 JCP-1纯品。
JCP活性的测定参照Sakharov和Aridilla (1999)
文中的愈创木酚法, 反应体系包括3.8 mL 3% (W/V)
愈创木酚、100 mL酶液和 100 mL的 2% H2O2。在
室温条件下, 以反应体系在每分钟内OD470值变化
1.0个单位定义为一个酶活性单位(OD·min-1; U)。
酶比活性定义为OD ·min-1·mg-1, 即U·mg-1。
最终纯化得到的蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳后, 分别用考马斯亮蓝和同工酶活性染色, 染
色参考 Ros Barcelo (1987)文中的冰醋酸 -联苯胺
法。蛋白质含量测定参照 Bradford (1976)的方法,
以牛血清白蛋白作标准曲线。JCP-1分子量的测
定参照Weber等(1972)文中的 SDS-聚丙烯酰胺
凝胶电泳法。以等点聚焦电泳测定 JCP-1的等
电点。
测定动力学常数时, 分别以 0.03~0.1 mmol·L-1
H 2 O 2为底物测定酶活性 , 根据双倒数作图法
(Lineweaver-Burk reciprocal plot)原理作图, 求得Vmax
和 K m。
将浓度为 2 ng·mL-1的 JCP-1溶液分为若干组,
分别于 3 0、4 0、5 0、6 0、70、8 0、8 2、8 4、
86、88、90 ℃条件下保温 15 min, 迅速冷却后置
于 4 ℃中, 以不经处理的酶液为对照, 室温条件下
测定相对活性, 以此检测温度对 JCP-1 活性的影
响。配制 20 mmol·L-1 (pH 3.0~11.0)的缓冲液时, 分
别选用磷酸氢二钠 -柠檬酸钠(pH 3.0~6.0)、Tris-
HCl (pH 7.0~9.0)和Gly-NaOH (pH 9.0~11.0)缓冲体
系。用这些缓冲液分别配制 JCP-1酶液, 于 4 ℃
下放置 24 h后测定酶活性, 以此检测 pH对 JCP-1
活性的影响。测定最适反应pH实验中所用的愈创
木酚和H2O2也用相应的缓冲液分别配制。
做高温及水份胁迫对 JCP-1活性的影响实验
时, 选取生长一致的麻疯树幼苗分组进行胁迫处
理。高温处理是将正常培养(30 ℃, 相对湿度为
60%)的植株移入人工气候光照培养箱中, 温度为50
℃, 相对湿度为 60%, 每天处理 5 h。水份胁迫处
理为每日向培养麻疯树的盆中浇灌 30%聚乙二醇
(PEG6000), 至盆底孔刚有液体渗出时为止。对照
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为不经处理的植株。分别于胁迫 1、2、3 d时
取其第2片嫩叶, 提取总蛋白和作同工酶电泳检测,
电泳胶每孔上样量为 20 mg。
结果与讨论
1 JCP-1 的纯化
提取麻疯树叶片总蛋白, 经非变性聚丙烯酰胺
电泳和JCP活性染色的结果显示, 麻疯树叶片中至
少存在 5种 JCP同工酶(图 1, 谱带 1)。其中有一
条带活性最强, 以软件 Bandscan 5.0对图谱进行灰
度分析的结果表明其活性约占总活性的 72.4%, 命
名为 JCP-1。
图 1 JCP-1 Native-PAGE图谱
Fig.1 Native-PAGE pattern of JCP-1
1: 麻疯树叶片总蛋白活性染色; 2: 纯化的 JCP-1活性染色;
3 : 纯化的 JCP-1 考马斯亮蓝染色。
JCP-1的进一步纯化用硫酸铵分级沉淀并结合
阴阳离子交换层析及分子筛层析进行。JCP活性
主要集中于 48%~72%饱和度的硫酸铵沉淀中, 收
集此部分蛋白进行HiTrap Q F F层析时, 最大活性
峰为含 0.1 mol·L-1 NaCl的Tris-HCl洗脱峰(图 2-a);
用HiTrap SP F F层析作进一步纯化的结果显示最
大的JCP活性出现在未被吸附的蛋白液中(图2-b);
最后, 进行Superdex 75 Prepgrade层析, 以Tris-HCl
洗脱, 洗脱体积在50~60 mL时呈现一条主峰(图2-c)。
纯化的蛋白在非变性聚丙烯酰胺电泳图谱中
与 JCP-1处于同一位置(图 1, 谱带 2、3), 因此可
以基本确定其为 JCP-1。纯化过程中各步骤收集
图 2 JCP-1 纯化过程中的层析图谱
Fig.2 Chromatography in purification process of JCP-1
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的活性组分经 SDS-聚丙烯酰胺电泳。
通过一系列的纯化步骤, 每克叶片(鲜重)可得
到 44 mg纯化的 JCP-1, 相对于粗提总蛋白 JCP活
性的回收率为 37.0% (表 1)。
2 JCP-1 的某些特性
(1)电泳图谱分析纯化得到的JCP-1经SDS-聚
丙烯酰胺电泳得到的图谱(图 3)显示, 其为单一条
表 1 麻疯树叶片 JCP-1纯化
Table 1 Purification of JCP-1 from leaves of J. curcas
纯化步骤 总活性 /U 蛋白总量 /mg 比活性 /U·mg-1 (蛋白) 蛋白回收率 /% 活性回收率 /% 纯化倍数
总蛋白抽提 64 121 866.01 7 5 100.00 100.00 1.00
硫酸铵分级分离 59 364 128.56 462 14.85 92.68 6.19
阴离子层析 37 487 15.02 2 496 1.73 58.46 33.46
阳离子层析 31 598 11.11 2 845 1.28 49.28 38.14
葡聚糖凝胶过滤层析 23 699 5.27 4 499 0.61 36.96 60.30
图 4 双倒数作图法绘制 JCP-1的酶动力学曲线
Fig.4 Lineweaver–Burk reciprocal plot for JCP-1
图 5 JCP-1对温度的反应
Fig.5 Response of temperature to JCP-1
带, 分子量为 49 kDa, 与已报道的 POD大小范围
(30~60 kDa)相符合(Srivastava和 van Huystee
1977)。等点聚焦的结果表明其等电点为 3.3, 属于
酸性 PO D。
(2)测定动力学常数的不同反应分别以 0.03~
0.10 mmol·L-1的H2O2为底物, 测定JCP-1的活性, 使
用双倒数作图以底物浓度的倒数(1/[H2O2])为横轴,
图 3 纯化过程中各步骤收集蛋白的 SDS-PAGE图谱
Fig.3 SDS-PAGE pattern of samples in purification process
1: 叶片总蛋白; 2: 48%~72% (NH4)2SO4 沉淀蛋白; 3: Q F F 层
析结果; 4: SP F F 层析结果; 5: Superdex 75 prepgrade 层析结果;
M: 标准分子量。
酶活性的倒数(1/V)为纵轴作图, 得到直线y=0.0963x+
0.2063 (图4), 计算此酶对以底物为H2O2的反应中,
其 Vmax为 4.85, Km值为 2.14 mmol·L-1, 表明 JCP-1
与底物H2O2很高的亲和力。
(3)置纯化的 JCP-1酶液分别放在 30~90 ℃处
理 15 min后, 测定其活性的结果(图 5)表明, JCP-1
对高温具有较好的耐受性。30~80 ℃对 JCP-1活
性无明显影响, 其相对活性均维持在 90%以上。
温度上升到 80 ℃以上时, JCP-1活性才急剧下降。
经 84 ℃处理后的相对活性为 58.8%, 90 ℃处理后
的酶活性已完全丧失。
一般来说, 植物POD属于高温耐受型酶, 但大
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 333
部份植物POD在70 ℃处理后, 活性就开始下降, 80
℃处理后, 活性仍能保持较高的并不常见。如甜菜
根POD经70 ℃处理15 min后的剩余活性约为70%
(Thimmaraju等2007), 柑橘POD经70 ℃处理10 min
后的剩余活性约为60% (Clemente 1998), 烟草POD
在 70 ℃处理 15 min后的残余活性仅为 50% (夏炳
乐等2002), 一般商业化使用的辣根过氧化物酶, 其
在 70 ℃条件下 11 min后大部分活性丧失(Duarte-
Vazquez等 2001)。由于麻疯树主要分布在热带亚
热带地区, JCP-1之所以表现出高温下的稳定性可
能与其适应这些地区的高温环境有关。而在工业
应用中, 良好的耐热性可以保证其在经过固定化等
高温处理之后仍能保持足够的活性, 并能在高温中
长久地保持。如果能对其耐热的结构和分子基础
进行研究, 不仅有利于更深入地了解麻疯树抗逆性
机制, 培育高抗逆作物品种, 而且对开发耐热和稳
定的商业化 POD酶又有一定的参考价值。
(4)在 pH 3.0~11.0范围内 JCP-1的最适 pH为
图 6 JCP-1反应的最适 pH
Fig.6 Optimum pH for the JCP-1 activity
图 7 JCP-1对 pH稳定性
Fig.7 Stability of JCP-1 at different pH conditions
5.0~6.0 (图 6)。一般认为, POD的最适 pH大都在
5.0~6.0之间, 如草莓、大豆、烟草、甜菜和辣
根过氧化物酶(夏炳乐等 2002; 徐芝勇等 2006;
Civello等 1995; Thimmaraju等 2007)。本文用不同
pH缓冲液保存此酶 24 h后测定其活性结果(图 7)
表明, 保存 JCP-1的最适 pH偏碱性(pH 7.0~11.0),
其在酸性(pH 3.0~6.0)缓冲液环境中稳定性较差, 且
活性随着保存液中 pH的降低而急剧下降。JCP-1
保存的pH范围显示其有独特的优点。其他物种的
POD保存的 pH范围都比较小, 甜菜根 POD为 pH
6.0~8.0, 辣根过氧化物酶为pH 4.0~6.0 (Thimmaraju
等 2007)。
(5)采用同工酶染色法检测30% PEG6000渗透
和 50 ℃高温条件下胁迫 1~3 d的麻疯树叶中 JCP-
1活性的结果(图8)表明, JCP-1活性明显增强, 并随
着处理时间的延长而增加。说明麻疯树在抵抗干
旱和高温胁迫的过程中, 其过氧化物酶, 特别是JCP-
1, 可能起相当大的作用。
图 8 PEG6000和高温胁迫对 JCP-1活性的影响
Fig.8 Effects of PEG6000 and high temperature stress on JCP-1 activity
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月334
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