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不同方法提取余甘子果实和叶片中的黄酮混合物对麻疯树种子油的抗氧化性比较



全 文 :2013年9月 四川大学学报(自然科学版) Sep.2013
第50卷 第5期 Journal of Sichuan University(Natural Science Edition) Vol.50 No.5
收稿日期:2013-01-17
基金项目:国家自然科学基金(31100257)
作者简介:肖萍(1988-),女,河南信阳人,主要研究方向为植物天然产物.
通讯作者:王胜华.E-mail:shwang200@aliyun.com.cn
doi:103969/j.issn.0490-6756.2013.05.040
不同方法提取余甘子果实和叶片中的黄酮混合物对
麻疯树种子油的抗氧化性比较
肖 萍,王升平,郭亦然,陈 放,王胜华
(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610064)
摘 要:研究使用三种方法分别提取余甘子果实和叶片中的黄酮类混合物,并测定各混合物
中的总黄酮含量,以及对羟自由基的清除率.同时以BHA(丁基羟基茴香醚),PG(没食子酸丙
酯)和TBHQ(叔丁基对苯二酚)作为对照,比较其对麻疯树种子油的抗氧化效果.研究结果表
明:三种提取方法得到的果实或叶片的黄酮类混合物中,余甘子果实的超声波(70%乙醇,40
kHz,300W)黄酮提取物以及叶片70%乙醇浸提物对麻疯树种子油的抗氧化效果最佳,与抗
氧化剂TBHQ比较接近.
关键词:麻疯树种子油;抗氧化剂;余甘子;黄酮
中图分类号:Q946   文献标识码:A   文章编号:0490-6756(2013)05-1131-06
The comparison of the antioxidation of flavonoids extract fromEmblicafruit
and leave with different methods to Jatropha curcas seed oil
XIAO Ping,WANG Sheng-Ping,GUO Yi-Ran,CHEN Fang,WANG Sheng-Hua
(Key Laboratory of Bio-Resource and Eco-Environment,Ministry of Education,
Colege of Life Sciences,Sichuan University,Chengdu 610064,China)
Abstract:Flavonoids were extracted from the Fruit and Leave of Emblicaby three methods,and the total
content of flavonoids in each mixture was determining,as wel as the clearance rate of hydroxyl radicals.
Selected BHA,PG,and TBHQ as control,compared their antioxidant effect on Jatrophaseed oil.The
results showed that of different flavonoids extracted from Emblicafruit and leave with three methods,
the antioxidant effect of the flavonoids extracted from Emblica fruit with supersonic wave(70%ethanol,
40kHz,300W)and Emblicaleaves with 70%alcohol extration were the the best,almost as the same as
TBHQ.
Key words:Jatrophaseed oil,antioxidant,Emblica,flavonoids
1 引 言
随着全球环境意识的提高,以及能源紧张所带
来的世界经济动荡,绿色可再生能源越来越受到人
们的重视.生物柴油是指利用各类动植物油脂为原
料,经与甲醇或乙醇等物质发生酯交换反应,变成
可供内燃机使用的燃料[1].它具有优良的环保性、
低温起动性、润滑性及可再生性,是理想的石化柴
油补充燃料,对缓解当前巨大的能源和环境压力具
有很大作用[2].我国含有较丰富的油料植物资源,
第5期   肖萍,等:不同方法提取余甘子果实和叶片中的黄酮混合物对麻疯树种子油…… 
其中麻疯树种子油是制备生物柴油的理想材料.然
而由于自身含有大量的不饱和脂肪酸,在加工储运
过程中,易受氧、光照及酶的作用,发生氧化、水解
反应,导致品质降低[3].因此,寻找合适的抗氧化添
加剂,提高生物柴油的储存稳定性是大规模生产生
物柴油要面对和解决的问题[4].
抗氧化剂抗氧化活性主要表现在抑制脂质(也
可以是蛋白质或者DNA)的氧化降解、清除自由
基、抑制促氧化剂和还原能力等几方面.大多数方
法设计到直接或间接测量:(1)底物或标记底物或
氧消耗的衰减,(2)氧化底物的生成,(3)特征自由
基的形成或衰减的速度或程度.(3)是假设通过捕
获脂质自动氧化中的自由基抑制氧化的,因此集中
在检测被测抗氧化剂对自由基的捕获或抑制自由
基的能力上,而不是检测实际发生的氧化反
应[5,6].羟自由基清除法和超氧自由基清除法是实
验室常用的检测方法[7].
余甘子,又名庵摩勒(Phyllanthus emblica),
系大戟科叶下珠属落叶小乔木或灌木,产于我国南
方各省及东南亚和印度等地区[8],具有清热解毒、
消炎、止泻、消食化瘀、补益强气等功效[9].此外,余
甘子还具有阻断N-亚硝基化合物的合成[10],起到
降血脂、降血压和抗衰老等作用[11,12].研究表明,
余甘果中含有丰富的超氧化歧化酶(SOD)、VC、多
酚类物质及多糖等活性物质[13-15],具有抗炎、抗突
变、抗高血压、抗肿瘤、降血脂、降血压、保肝等功
效[16],并且已证实,余甘子强烈的抗氧化活性是其
生理功能的基础[17,18].张尔贤等对余甘子的系统
研究中发现,余甘子对酶性及非酶性体系产生的超
氧自由基和对 OH· 自由基有明显的清除作
用[19-21].
本文在了解余甘子具有抗氧化特性的基础上,
测定不同溶剂和不同提取方式提取的余甘子粗提
物总黄酮含量及对羟自由基的清除效率,筛选出最
有效的提取方式,以便最大限度的利用余甘子的抗
氧化特性.进一步比较了余甘子果实和叶片的黄酮
提取物以及常用抗氧化剂对麻疯树种子油的抗氧
化性,以期为后续对生物柴油的抗氧化剂研究提供
基础依据.
2 材料与方法
2.1 材 料
新鲜余甘子采于四川省凉山州盐源县,经本室
鉴定.
余甘子干果的获得与存贮:收集的新鲜余甘子
置于通风处阴干,粉碎,过40目筛,密封置于阴凉
干燥处.
2.2 方 法
2.2.1 余甘子的提取 本实验采用索式提取
法[22]、超声波提取法[23]和冷浸法[24]作为余甘子的
基本提取方法,以甲醇、10%乙醇、30%乙醇、50%
乙醇、70%乙醇和90%乙醇为溶剂对余甘子进行
了提取,根据公式:样品得率=样品重量/余甘子重
量×100%,计算各种溶剂和各种提取方法的样品
得率,以期能选出最佳的提取方法.
索式提取法:称取5.0g余甘子果、叶(已磨成
粉,过40目筛)各一份,分别加入50mL C2H5OH
于索式提取装置中,至回流液无色(约6~7h),将
回流液45℃旋转浓缩,定容于50mL容量瓶中备
用.
超声波提取法:称取5.0g余甘子果、叶各两
份,分别加入50mL C2H5OH和50mL 70%C2H5
OH于锥形瓶中,于100HZ及30℃条件下抽滤1
h,取滤液旋转浓缩后定容于50mL容量瓶中备
用.
冷浸法:称取5.0g余甘子果肉、叶(已磨成
粉,过40目筛)各一份,分别加入100mL 70% C2
H5OH,常温浸泡7、5、3天,合并每一次滤液,45
℃旋转浓缩,定容于50mL容量瓶中备用.
2.2.2 麻疯树种油的制备 精选适量麻疯树种
子,榨油,保存在4℃备用.
2.2.3 样品黄酮含量的测定 以芦丁为标准品绘
制标准曲线[24],准确量取各种样品溶液各1.0
mL,分别置于10mL 比色管中,依次加入5%
NaNO20.3mL,静置6min,加10% AL(NO3)3
0.3mL,静置6min,加1mol·L-1 NaOH 溶液
4.0mL,再加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,静置15~
20min,同时以30%乙醇代替样品液配制空白试
剂.在510nm波长处测定吸光度 A.测得结果带
入回归方程,求其总黄酮含量.每个样品重复3次.
2.2.4 对羟自由基清除率的测定 参考徐向荣等
人[21]的方法.
分别向麻疯树种油样中加入等量的余甘子果
实粗提物,测定其对羟自由基的清除率.
在15mL试管中加入1mmol·L-1 FeSO43
mL,3mmol·L-1 H2O23mL,再加入3mmol·
L-1 C7H6O3至刻度,37℃水浴15min,在510nm
测其吸光度A0;再加入1mL待测样品,37℃继续
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  四川大学学报(自然科学版)   第50卷
水浴15min,取出,在510nm测其吸光度AX.
清除率(%)=(Ax--A0)/A0×1000
A0为空白对照液的吸光度
AX为加入待测溶液后的吸光度[25]
每一吸光值平行测3次,取其平均值.
2.2.5 过氧化值的测定 参照国家标准 GB/
T5009.37-1996(食用植物油卫生标准的分析方
法).
分别选取余甘子果实、叶片的70%乙醇浸提
液,无水乙醇索氏提取液,70%乙醇超声波提取液,
无水乙醇超声波提取液,以及工业上常用抗氧化剂
BHA,PG,TBHQ作为抗氧化剂[4],按照0.01%
(m/v)的比例加入到麻疯树种子油里.40℃放置1
w后,开始每隔24h,取样,测定过氧化值(POV).
称取2~3g油样(准确至0.0001)于碘量瓶
中,加30mL三氯甲烷-冰乙酸混合液,使样品完全
溶解.加入1mL饱和碘化钾溶液,紧密塞好瓶盖,
并轻轻振摇0.5min,在暗处放置3min,再加100
mL水,摇匀,立即以淀粉试剂为指示剂,用0.01
mol·L-1硫代硫酸钠标准溶液滴定至蓝色消失为
终点.同时做空白实验.每个处理样品取样三次,最
后结果取平均值.
过氧化值POV(%)=
 78.8×0.1269×(V1-V0)×C×100/m
式中POV:试样的过氧化值,单位为毫克当量
每千克(meq·kg-1)
V1:试样消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液体积,
单位为毫升(mL);
V0:试样空白消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液
体积,单位为毫升(mL);
C:硫代硫酸钠标准滴定溶液的浓度,单位为
摩尔每升(mol·L-1);
m:试样质量,单位为克(g).
3 结果与分析
3.1 样品中黄酮测定
标准品浓度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg·
mL-1时,吸光度分别为 0.033、0.076、0.117、
0.161、0.201,以吸光度为纵坐标,浓度C为横坐
标,绘制标准曲线,得回归方程y=0.4086x-
0.0041,r=0.9992.
分别对不同溶剂和不同提取方式果实样品中
的总黄酮进行测定比较,详见表1.从表1中可以
看出,且同一种溶剂不同提取方式所得总黄酮含量
差异不是特别显著,但不同溶剂提取物之间总黄酮
含量存在一定差异,特别是无水乙醇提取物的总黄
酮含量较其他溶剂明显偏低.
表1 总黄酮测定结果
Tab.1 The determination of total flavonoids
索式提取法(mg·g-1) 超声波提取法(mg·g-1) 冷浸法(mg·g-1)
甲醇 61.88±0.68  55.86±4.09  70.61±5.67
10%乙醇 51.92±4.85  56.13±3.67  57.80±3.21
30%乙醇 64.09±4.56  62.15±6.71  69.45±2.04
50%乙醇 66.56±4.70  64.33±5.25  69.68±5.24
70%乙醇 69.30±3.61  76.61±6.49  75.25±4.31
无水乙醇 37.46±1.63  37.97±0.49  50.99±1.22
3.2 余甘子粗提物对羟自由基的清除作用
由图1可以看出,余甘子果实粗提物有很强的
清除羟自由基OH·的作用,但不同提取方式和不
同溶剂提取的清除率并不完全相同.同一种溶剂的
粗提物以冷浸法的清除效果最好;同一种提取方式
以70%乙醇为溶剂的清除效果最好,说明清除羟
自由基的物质具有较弱极性.结合总黄酮含量分析
得出,在一定范围内对羟自由基的清除率与总黄酮
含量呈正相关.因此,在后续实验中,以70%乙醇
为溶剂用不同方法提取余甘子叶片和果实中的黄
酮类混合物.
3.3 麻疯树种油的自氧化实验
首先,考察了未添加任何抗氧化剂的麻疯树种
油的氧化情况.由图2可以看出:在氧化初期,麻疯
树种子POV油值变化速率较缓慢,其主要原因是
油脂氧化尚处于诱导阶段,氧化速度较慢.随着时
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第5期   肖萍,等:不同方法提取余甘子果实和叶片中的黄酮混合物对麻疯树种子油…… 
图1 对羟自由基清除率的测定结果
Fig.1 The determination results of hydroxyl free radi-
cal clearance
间的延长,POV 值增加较快,油脂氧化进入加速
期,因此,较低温度保存和添加适量抗氧化剂是降
低麻疯树种子油氧化速率和延长储藏时间的重要
措施.
图2 麻疯树种子油POV随时间的变化
Fig.2 The POVof Jatrophaseed oil changed with time
3.4 三种常用抗氧化剂对麻疯树种油的抗氧化效
果比较
BHA(丁基羟基茴香醚),PG(没食子酸丙
酯),TBHQ(叔丁基对苯二酚)是生物柴油中常常
使用的三种抗氧化剂[4].因此,本实验首先考察这
三种抗氧化剂对麻疯树种子油的抗氧化效果.结果
如图3(图中标注字母表示显著性)所示:PG 和
BHA的抗氧化效果相当,无显著差异,都优于对照
组(未添加任何抗氧化剂);而从第三天开始,TB-
HQ的抗氧化效果就显著优于其他处理组和对照
组,且抗氧化作用比较稳定.因此,在后续实验中选
择TBHQ作为对照,考察其与余甘子的黄酮提取
物的抗氧化效果差异.
图3 三种常用抗氧化剂的抗氧化效果比较
Fig.3 Comparison of the antioxidation effect of three
commonly used antioxidants
3.5 余甘子果实及叶子的黄酮提取物对麻疯树种
油的抗氧化效果比较
余甘子果实及叶子的黄酮提取物对麻疯树种
图4 余甘子果实及叶子的黄酮提取物对麻疯树种油
的抗氧化效果比较
Fig.4 Comparison of the antioxidation effect of the
flavonoids extracts from Phyllanthus emblica
fruit and leave
子油的抗氧化效果则如图4(图中标注字母表示显
著性)所示.余甘子果实70%乙醇浸提物,果实
70%乙醇索氏提取物,叶片70%乙醇索氏提取物,
叶片70%乙醇超声波提取物,果实70%乙醇超声
波提取物抗氧化效果相当,均显著优于对照组.余
甘子果实70%乙醇超声波条件下的黄酮提取物和
叶片70%乙醇浸提物的抗氧化效果显著优于其他
的余甘子黄酮提取物;超声波条件下的提取物效果
略好于非超声波处理.因此,在后续实验中,选择余
5311
  四川大学学报(自然科学版)   第50卷
甘子果实70%乙醇超声波条件下的黄酮提取物和
叶片70%乙醇浸提物为对照,比较其与常用抗氧
化剂TBHQ的抗氧化效果差异.
3.6 TBHQ和余甘子黄酮提取物以及叶片浸提物
的抗氧化效果比较
比较TBHQ和余甘子果实70%超声波的黄
酮提取物以及叶片70%乙醇浸提物的抗氧化效
果,结果如图5(图中所表示字母表示其显著性)所
示.在开始测定过氧化值的前3d,三者的抗氧化效
果相当;从第4d开始,TBHQ组抗氧化效果稍稍
优于余甘子果实70%超声波的黄酮提取物以及叶
片70%乙醇浸提物,但是并无显著差异.然而,余
甘子果实70%超声波的提取和叶片70%乙醇浸提
物的抗氧化效果波动较大,在实验后期抗氧化效果
有下降的趋势.
图5 TBHQ和余甘子果实70%超声波的黄酮提取物
以及叶片70%乙醇浸提物的抗氧化性比较
Fig.5 Comparison of the antioxidation effect of TB-
HQ and the flavonoids extracts from Phylan-
thus emblica fruit with supersonic wave and
leaves with 70%alcohol extraction
4 讨 论
在余甘子叶、果实的黄酮提取物抗氧化性研究
中发现果实70%乙醇超声波条件下黄酮提取物以
及叶片70%乙醇浸提物的抗氧化效果最佳,几乎
可与常用的抗氧化剂(TBHQ)媲美,因此,二者皆
有开发为工业上生物柴油常用抗氧化剂替代品的
潜力.
从本文的实验结果可以看出,主要有两个因素
对黄酮混合物的提取有很大影响.其一是乙醇浓
度.不同浓度的乙醇溶剂极性不同,所能溶解的黄
酮类物质种类和含量也不同.据田呈瑞等[26]的研
究,70%的乙醇与黄酮的极性最相似,在此条件下
黄酮混合物的溶解度最大.高中松等[27]的研究表
明,当乙醇浓度为70%时,总黄酮类物质的得率最
高,随后当乙醇的浓度再增大(大于70%)时,总黄
酮物质的得率反而降低.其二是提取方式.超声波
的热效应可使药物组织内部温度瞬间升高,加速有
效成分的溶出,且不改变化学成分;超声的机械作
用可以加强胞内物质的释放,超声波还能使悬浮的
气体或液体的微粒沉淀和凝聚,对提高提取率和缩
短提取时间起重要作用[28].超声波法大大缩短了
提取时间,提高了有效成分的提出率和原料的利用
率.结合前人的研究,我们认为提取黄酮的最佳方
式是超声波提取法,最佳的乙醇浓度是70%.
麻疯树种子油是麻疯树生物柴油的主要原料,
提高麻疯树种子油氧化稳定性,对于提高麻疯树生
物柴油氧化稳定性具有极大的参考价值.而余甘子
提取物在少许添加量下即表现出优良的抗氧化性,
加之余甘子丰富的野生资源,将来有望进一步开发
为新型的抗氧化剂.
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[责任编辑:白林含]
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