全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月388
植物的异黄酮合酶(IFS)
郑晓宣, 徐荣艳, 陈家宽, 南蓬 *
复旦大学生命科学学院, 生物多样性与生态工程教育部重点实验室, 上海 200433
Isoflavone Synthase in Plant
ZHENG Xiao-Xuan, XU Rong-Yan, CHEN Jia-Kuan, NAN Peng*
Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, School of Life Sciences, Fudan University,
Shanghai 200433, China
提要: 植物异黄酮是在植物次生代谢过程中产生的一类多酚混合物。其对植物自身防御病虫害和诱导根瘤形成以及人类
预防或治疗激素相关的多种疾病都有作用。异黄酮合成的关键酶是异黄酮合酶(isoflavone synthase, IFS)。本文就异黄酮
的代谢途径、IFS催化机制、基因克隆和转基因的研究进展作简单介绍, 并讨论了 IFS基因与根瘤菌之间可能的关系。
关键词: 异黄酮; 异黄酮合酶; 代谢途径
收稿 2009-11-03 修定 　2010-03-08
资助 国家 “863”计划(2009AA02Z308和 2007AA02Z332)、
国家基础科学人才培养基金(J0630643)和教育部博士点
新教师基金(2 00 70 24 61 56 )。
* 通讯作者(E-mail: nanpeng@fudan.edu.cn; Tel: 021-
6 5 6 4 2 9 5 7 )。
植物异黄酮是一类多酚化合物, 主要存在于豆
科蝶形亚科植物的次生代谢产物中。异黄酮类化
合物不仅在植物代谢过程中具有组织、发育和环
境因子特异性, 参与植物生态防御、抵御病菌感染
的作用(Dixon和Paiva 1995), 而且对人体激素有关
的一些疾病(如乳腺癌、骨质疏松、更年期综合
症等)也有很好的预防和治疗效果。例如, 大豆中
主要的活性异黄酮化合物染料木素(genistein, 5,7,
4’-三羟基异黄酮, 又名金雀异黄素)和大豆苷元
(daidzein, 7,4’-二羟基异黄酮)在结构上与哺乳动物
的雌激素——雌二醇相似, 具有雌激素的活性基
团——二酚羟基, 它可与动物体内的雌激素受体结
合发挥弱雌激素效应, 故又称为植物雌性激素(Davis
等1999)。染料木素还可抑制癌细胞血管的新生和
癌前期细胞的DNA合成过程, 从而阻止癌细胞的发
育(Peterson和 Barnes 1996), 通过 ER (雌性激素受
体)而增加骨保护素mRNA的表达和蛋白质分泌, 抑
制骨吸收, 防止骨质疏松的发生(Viereck等 2002)。
异黄酮的合成源自黄烷酮合成途径中的中间
代谢产物, 而将普遍存在于各种植物中的黄烷酮代
谢途径引入异黄酮代谢途径的关键酶就是异黄酮合
酶(isoflavone synthase, IFS)。因此, IFS的功能、
催化反应机制、在代谢途径中的作用以及作为信
号分子诱导根瘤的形成是研究异黄酮类化合物代谢
的基础和关键。基于这些问题, 本文介绍这方面的
研究进展。
1 IFS 在异黄酮类化合物合成中的作用
黄烷酮代谢途径是一个复杂的代谢网络(图1),
包含许许多多的酶, 如 CHS、CHI、F2H、F3H、
IFS等。这些酶有的相互竞争某一相同底物, 有的
相互协调共同促进, 每一种代谢产物的合成都是其
中多种酶作用的结果。异黄酮的生物合成只是其
中的一个分支, IFS作为异黄酮生物合成途径的关
键酶, 与黄烷酮代谢途径中的许多酶的相互作用必
然会影响到异黄酮的合成。迄今已发现通过 IFS
酶催化合成的植物异黄酮化合物近百种, 主要有染
料木素、大豆苷元和黄豆黄素(glycitein)以及它们
的糖苷衍生化合物。
Akashi等于 1997年成功地克隆出 IFS和 F2H
两个酶基因, 为了比较重组酵母和植物细胞与黄酮
底物的反应活性, 他们又就激发处理的甘草细胞微
粒对甘草素(2S-liquiritigenin)的催化活性进行了检
验。TLC扫描的数据表明, 除了预期的 2,7,4’-三
羟基异黄酮之外, 还有一种强烈的放射性化合物
专题介绍 Special Topic
植物生理学通讯 第 46卷 第 4期, 2010年 4月 389
licodione (一种黄酮类化合物)。这些混合物经酸
处理后, 基本上转化为大豆苷元和 7,4’-二羟基黄
酮。另外, 用脱水酶代替酸处理这些混合物则能产
生更多的异黄酮和黄酮产物。从上述实验可以看
出, 虽然 IFS与F2H作用于同一底物并引向不同的
代谢途径, 但它们之间似乎并不没有明显的竞争关
系(Akashi等 1999)。
Yu等(2000)的研究表明, 在含有 IFS基因的转
基因烟草中, 染料木素的积累与苯丙烷类代谢途径
(phenylpropanoid pathway)中相关酶活性强弱有关。
在确定转入烟草植株的IFS基因和其编码的蛋白具
有活性的情况下, 分别测定烟草花和叶中的染料木
素和花色素苷(anthocyanin)含量的结果表明, 烟草
花中的染料木素的含量明显比叶子中多, 而花色素
图 1 异黄酮代谢途径 (Aoki等 2000; Latunde-Dada等 2001)
CHS: 査尔酮合酶(chalcone synthase); CHR: 査尔酮还原酶(chalcone reductase); CHI: 査尔酮异构酶(chalcone isomerase); F2H: 黄
烷酮 2-羟化酶(favanone 2-hydroxylase); F3H: 黄碱酮 3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase); F6H: 黄酮类 6-羟化酶(favonoid 6-
hydroxylase); FS: 黄酮合酶 I (flavone synthase I); IFS: 异黄酮合酶(isoflavone synthase); HID: 2-羟基异黄酮脱水酶(2-hydroxyisoflavanone
dehydratase); IMT: 异黄酮甲基转移酶(isoflavone methyltransferase); HIS: 2-羟基异黄酮合酶(2-hydroxyisoflavanone synthase)。
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苷的含量更是叶中的 130倍。为了进一步研究异
黄酮含量与苯丙烷类代谢途径之间的关系, 他们发
现在紫外光照射下转基因烟草的花和叶中染料木素
含量明显多于空白组植株。此外, 他们还将 IFS转
入到黑墨西哥甜玉米(BMS)悬浮细胞中, 通过 CRC/
IFS、CRC与外转基因的相比, 只有 CRC和 IFS都
存在, 并且培养液是红色(表明有花色素苷的存在)
的悬浮细胞中检测到染料木素的存在。通过这些
实验, 他们认为染料木素的合成与苯丙烷类代谢途
径中关键酶的基因表达量有正相关性。激活苯丙
烷类代谢途径能增加植物中染料木素的含量。而
激活苯丙烷类代谢途径是 CA4、CHS、CHI等多
个关键酶基因共同作用的结果。Liu等(2002)在将
IFS基因转入拟南芥进行表达的试验中发现染料木
素的积累量很小, 而在将 IFS转入拟南芥 tt6/tt3
(F3H和DFR的双突变体)植株后, 染料木素的含量
显著增加, 这也说明F3H和DFR很可能与 IFS存在
着竞争同一底物柚皮素(naringenin)的关系。Kim
等(2005)将水稻的P450还原酶和红三叶草的IFS基
因转入酵母中共表达, 染料木素的产量提高4.3倍。
Tian和Dixon于 2006年人工合成了一个 IFS/
CHI嵌合基因, 并将 CHI、IFS、IFS/CHI和空载
体分别转入烟草细胞中。用HPLC分析 4种烟草
转基因植株的代谢提取物的结果表明, 在含有IFS/
CHI人工合成基因的烟草花瓣中, 染料木素的含量
明显多于只有 IFS基因的烟草花瓣。不过总黄酮
类化合物的含量在4种烟草植株中相差并不大, 说
明 CHI基因并不能将更多的底物引入黄酮合成途
径, 而 IFS/CHI转基因植株与 IFS植株相比产生更
多染料木素的原因很可能与查耳酮(chalcone)前体
的结构功能相关。
Shih等(2008)将一条GmIFS2 cDNA序列转入
到番茄后, 研究转基因番茄异黄酮类化合物代谢的
结果显示, 在检测的所有转基因品系中, 叶中积累
的染料木素含量最高, 比果皮中高 270倍, 但果皮
中积累有大量槲皮素。品系 1的叶和果皮中染料
木素含量最大, 分别为 90.56 nmol·g (FW)-1和 0.45
nmol·g (FW)-1。他们分析苯丙烷类代谢途径中
CyP、PAL、CHS、CHI、GmIFS2、F3H、FLS
等7个基因的表达结果表明, 在转基因番茄的叶和
果皮中 CyP、PAL、CHS、F3H都有很高的表达
量, 而 CHI基因只在叶子中有较高的表达量。CHI
具有催化查尔酮生成柚皮素功能, 但转化率比较
低。F3H和 IFS具有相同的底物柚皮素, 分别催化
合成槲皮素和染料木素。造成叶和果皮中槲皮素
和染料木素含量差异的原因很可能与柚皮素的含量
有关, 柚皮素含量较低时, F3H具有较强的竞争力,
进而催化合成槲皮素; 而柚皮素含量较高时, GmIFS
则更具有竞争力而合成染料木素。
2 IFS 的催化机制
早在上个世纪 40年前, 就有人发现异黄酮类
化合物的生物合成是黄烷酮上的芳香基团重排的结
果, 其前体是柚皮素或甘草素。近年来, 人们发现
某些 6-羟基二氢黄酮也可能是异黄酮的合成前体
化合物(Kim等 2003)。1984 年, Hagmann和
Grisebach (1984)采用同位素标记法在霉疫属激发
子处理过的大豆悬浮细胞中发现了柚皮素转化为染
料木素的酶促反应。酶反应依赖于NADPH和O2
的参与, 而且该酶(即 IFS)可能是依赖于 P450的单
氧化酶。从酶反应前后酮类和烯醇的互变异构现
象表明反应可能是由于在C-3位上的质子交换引起
的。随后, Kochs和Grisebach (1986)以及Hashimn
等(1990)分别在大豆和三裂葛细胞微粒体中证实异
黄酮的合成主要分为两个步骤: 第一步是在 IFS的
作用下 B环上的芳香基团从 2位转移至 3位。第
二步是在HID的作用下二氢异黄酮脱水生成异黄
酮。Shimamura等(2007)将 IFS和HID两个基因转
入百脉根(Lotus japonicus)的发根组织中, 并对其不
同组合的表达和代谢产物进行了分析。观察到含
有IFS和HID的品系有大豆苷元的积累, 而只有IFS
基因的品系没有检测到异黄酮类化合物, 这充分说
明在异黄酮合成途径中仅仅依赖 IFS是不够的, 只
有与HID一起作用才可以完成异黄酮类化合物的
合成。
自从发现 IFS是催化异黄酮合成的关键基因
以来, 其催化反应的芳香基团转移机制引起了人们
的浓厚兴趣, 但迄今, IFS的催化反应机制尚无明
确定论。目前主要有两种假说。第一种假说: Hashim
等(1990)认为, 首先是甘草素 C-3位上的一个氢被
P450酶移去, 然后 C-2位上的芳香基转移过来, 以
致C-2位上的C离子被活化, 接着被一个羟基占据
发生羟基化作用形成 2,7,4’-三羟基异黄酮(图 2)。
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在这个催化机制中, 羟基化和移位的立体化学并不
清楚, 还待阐明。
另一种催化机制是Crombie和Whiting (1992)
提出的, 他们认为反应经历一个具有 spirodienone-
type B环的中间产物(5)或(3) (图 3), 这中间产物是
经过一个包括P450酶的亲电子共振形式的本位取
代。首先柚皮素或甘草素的 C-1或 C-4位点遭受
攻击, 经环氧化作用后的碳原子C-3被烯醇化物(2)
取代形成螺环化合物(3), 或者亲质子的C-1被Fe3+
攻击, 经过化合物(4)形成 dienone(5)。接着 C-2上
质子化的碳离子被早先释放的 Fe3+离子攻击形成
化合物(6), 消除Fe3+离子后形成(7), 最后经脱水酶
作用形成(8)。在此过程中C-4’位还可能会发生甲
基化。
目前这两种假说都存在着一些未确定的因素,
如第一种假说中羟基化和移位的立体化学并未阐
明; 而在第二种离子机制中, C-4位上的甲基化、
黄酮的复质子化等研究尚不清楚。所以到底是那
种机制还有待进一步研究确认, 但较多的研究更倾
向于第一种假说。
3 IFS 基因的克隆与鉴定
植物细胞色素 P450家族蛋白难以分离纯化,
并且它们在细胞中的含量较少, 同源蛋白多且不稳
定(Akashi等 1999)。直到 1997年, Akashi等从经
激发子处理的甘草细胞的cDNA文库中分离得到8
个 P450片段Ge-1到Ge-8, 其中Ge-5经鉴定被确
认为是 F2H。再考虑到 IFS和 F2H作用于同一底
物, 且在 C - 2 上有相同配向性的羟基化作用。
Akashi判断 IFS也可能是 CYP93家族的 P450酶。
于是以 Ge-8为探针从 cDNA文库中克隆得到了
CYPGe-8的全长 cDNA序列。再将它转入酵母细
胞表达后, 它能将甘草素转化为大豆黄素, 从而证
实 CYPGe-8具有 IFS基因的功能。CYPGe-8包含
1 895 bp的核苷酸, 编码一条有 523个氨基酸的多
肽。CYPGe-8与大豆的CYP93C1具有很高的相似
性(82.8%)。CYPGe-8cDNA序列被细胞色素 P450
命名系统命名为 CYP93C2。
Jung等(2000)根据序列属于 P450家族和在菌
类感染的部位活性会增强两个原则从大豆 EST文
库筛选出大量cDNA序列, 得到的每条序列转入酵
母细胞中表达。其中一条序列在NADPH和O2的
存在下, 能将甘草素或柚皮素转化为大豆黄素或染
料木素, 说明该序列编码的是 IFS蛋白。再以此
cDNA序列为模板, 采用 RT-PCR技术分别从绿
豆、红三叶草、豌豆、白三叶草、毛菬子、小
扁豆、苜蓿和白羽扇豆克隆到了 IFS序列。这些
序列编码的氨基酸序列之间相似性在 92%以上。
近年来, 人们又陆续从多种豆科植物中克隆出
IFS序列。Shimada等(2000)用PCR方法从GSH处
理的百脉根幼苗中克隆出一条IFS的全长cDNA序
图 2 推测的反应顺序——从甘草素经 2,7,4’-三羟基异黄酮到大豆苷元(Hashim等 1990)
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列LjCYP-1。在 IFS基因的启动子对结瘤和防御信
号的不同反应实验中, Subramanian等(2004)用基于
PCR的方法从大豆中克隆出 IFS1和 IFS2两个基因
的 5 上游调控区域。发现两个基因都含有一个
TATA框、两个CAAT框等, 这些顺式作用元件位
于启动子区域内, 其序列顺序和位置都有高度的保
守性。Cheng等(2008)在研究 IFS基因多态性与植
物积累异黄酮量的关系时, 根据3条已发表的 IFS1
基因序列AY530096、AF195818和AF195798的序
列进行引物设计并扩增, 获得一条包含部分启动子、
5 UTR、完全 cDNA、一个内含子和部分 3 UTR
的 2 800 bp的 IFS1的核苷酸序列。同时还得到
1条 IFS2基因, 其大小为 3 000 bp, 包含启动子、
5 UTR、完全 cDNA、一个内含子和部分 3 UTR。
在NCBI上的 IFS基因序列共有 110条, 其中
包括全长 cDNA 86条, 主要来自于大豆(Glycine
图 3 Crombie等推测的离子反应机制(Crombie和Whiting 1992)
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max )、豌豆(Pisum sativum)、野葛(Pueraria
lobata)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、红三叶
草(Trifolium pratense)、野大豆(Glycine soja
Sieb)、豇豆(Vigna unguiculata)、绿豆(Vigna
radiata)、白羽扇豆(Lupinus albus)等 9种植物。
从已克隆的 IFS cDNA序列来看, 即使在不同
豆科植物, 甚至非豆科植物(如甜菜)中, 它们在氨
基酸水平上有很高的相似性(96%)。IFS基因在植
物中有1~2个拷贝, Dhaubhadel等(2003)用RT-PCR
的方法发现IFS1基因在根和种皮中表达量最高, 而
IFS2基因在胚和豆荚中表达量最高。
4 IFS 与根瘤菌之间的关系
众所周知, 根瘤菌能与豆科植物形成根瘤并且
共生互利。在根瘤形成过程中, IFS基因起重要作
用。早在 1988年, 就有人研究指出异黄酮这类几
乎专一性的存在于豆科植物中的特殊化合物是慢生
型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)中nod基
因表达的主要诱导物(Banfalvi等 1988; Kosslak等
1990)。生化分析也证明, 用慢生型大豆根瘤菌处
理大豆根后, 其异黄酮含量升高, 同时异黄酮又可
以刺激 nod基因的合成(Cho和 Harper 1991a, b;
Pueppke 1996)。而且, 两个 IFS基因对结瘤的反
应不尽相同。除了作为信号分子诱导 nod基因表
达以外, IFS还能调节植物生长素的运输。在胡瓜
下胚轴部位, 染料木素能抑制植物运输生长素抑制
剂NPA的结合(Jacobs和Rubery 1988)。Subramanian
等(2006)用慢生型大豆根瘤菌处理过的大豆根和未
处理的进行原位杂交表明, IFS在根中分布有组织
特异性。随后他们采用RNA干扰方法抑制大豆发
根中的 IFS和CHR基因的表达后, IFS基因表达量
降低或丧失, 大豆根瘤的数量也大大减少, 而 CHR
基因表达量的降低对根瘤数量的影响不大。他们
还用生长素标记基因DR5/GUS指示根中植物生长
素的含量, 在只有DR5/GUS基因和同时含有DR5/
GUS与被RNAi介导抑制活性的IFS基因的发根感
染的实验中发现, 后者在整个根内有更丰富的生长
素, 这说明 IFS基因具有调节植物生长素运输的作
用。此外, 他们用对染料木素高敏感性的慢生大豆
根瘤菌株证明, 异黄酮作为慢生型大豆根瘤菌 nod
基因诱导物的作用远比调节植物生长素运输的作用
更重要。
此外, 在很多非豆科植物种类中也发现根瘤菌,
如榆科的 Parasponia rogosa、山黄麻属(Trema)、
白颜树属(Gironniera)和朴树属(Celtis)中都发现有
根瘤菌(Trinick 1973; Becking等 1979)。1973年,
Geigert等在非豆科植物甜菜中检测到异黄酮类化
合物。迄今已从该植物中克隆出两条基因序列
(GenBank登录号AF195816和AF195817), 这两条
序列与 IFS1 (AF195818)的相似性高达 95%以上。
IFS基因与根瘤形成有密切关系, 它们原本认为都
只存在于豆科植物中, 但现在又接连发现在非豆科
植物中也存在。
值得注意的是, 在非豆科植物的野生类群中也
陆续发现了少量异黄酮类化合物, Lapcik (2007)对
已发现的含有异黄酮化合物的非豆科植物种类进行
了收集、分类和汇总, 发现在分类学上至少有 60
个距离的较远物种能合成异黄酮类化合物, 如苔藓
植物门和针叶植物。这些能产生异黄酮类化合物
的植物之间的关系尚未研究清楚, 而且在异黄酮生
物合成过程中催化芳香基转移这一步酶的信息也一
无所知。但是在非豆科植物中也能通过代谢积累
异黄酮这一点是毋庸置疑的。
5 结束语
随着异黄酮研究的深入和发展, 人们对异黄酮
相关食品和保健品的需求也逐渐增加。目前, 美国
和日本等一些发达国家对大豆异黄酮的研究较多,
已经相继研发出许多富含大豆异黄酮的食品和保健
品。虽然我国异黄酮研究及开发利用的整体水平
较欧美等国落后, 但国内一些企业已经认识到异黄
酮产品的巨大价值, 正在努力加快异黄酮食品和保
健品等的开发, 相信不久就能满足国内市场对异黄
酮产品的需求。
异黄酮基本上只产生于豆科植物或其它转基
因植物中, 并且其在植物内的积累量很低, 这一直
是困扰着异黄酮代谢工程发展的影响因素。随着
异黄酮代谢途径中各种酶基因的克隆, 近几年来, 各
国都倾向于研究利用两个甚至多个基因组合共表达
或者对异黄酮合酶上下游代谢途径中的酶进行修饰
的方法来调节异黄酮代谢, 以提高异黄酮的积累, 而
且效果比较显著(Liu等 2007; Li等 2009)。此外,
IFS基因与根瘤菌的关系, 也可能是研究 IFS基因
起源的一个突破口。
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