全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (12): 1161~1166 1161
收稿 2011-08-01　　修定 2011-10-25
资助 现代农业产业技术体系专项资金(CARS-30)。
* 通讯作者(E-mail: jun_wang@cau.edu.cn; Tel: 010-62738658)。
山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因(VAmGST4)克隆及表达分析
刘海峰1,2, 王军1,*
1中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研究中心, 北京100083; 2延边大学农学院, 吉林延吉133000
摘要: 采用RT-PCR和SMART RACE技术克隆了山葡萄VAmGST4基因的全长cDNA序列, GenBank登录号为FJ645770, 基因
全长885 bp, 包括开放阅读框(ORF) 642 bp, 编码213个氨基酸。该基因表达产物相对分子质量为24.24 kDa, 等电点为5.72,
是不稳定蛋白; 该基因属于GST超基因家族, 不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄(AY971515)、荔枝(EF613493)、矮
牵牛(Y07721)、紫苏(AB362191)和玉米(EU964162)等植物的GST氨基酸序列的同源性系数分别为99%、67%、64%、61%
和47%。半定量PCR显示, 在果实着色过程中, VAmGST4在果皮中表达随花色苷的合成上调; 在茎、果肉和果皮中均有表
达, 而在叶片中不表达, 表明VAmGST4的表达与花色苷的生物合成密切相关。
关键词: 山葡萄; cDNA克隆; 谷胱甘肽S-转移酶
cDNA Cloning and Expression Analysis of Glutathione S-Transferase (VAmGST4)
in Vitis amurensis Rupr.
LIU Hai-Feng1,2, WANG Jun1,*
1Center for Viticulture and Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing
100083, China; 2Agricultural College of Yanbian University, Yanji, Jilin 133000, China
Abstract: The full-length cDNA sequences of VAmGST4 gene in Vitis amurensis were cloned by the technique
of RT-PCR and SMART RACE. The landing Genbank No. is FJ645770 and the full-length of VAmGST4 cDNA
is 885 bp with open reading frame of 642 bp, which encodes 213 amino acids. The product of VAmGST4 gene
expression is unstable protein with the molecular mass of 24.24 kDa, isoelectric point of 5.72. The VAmGST4
gene belongs to the GST supergene family, not containing a signal peptide. The amino sequence of GST in Vitis
amurensis has the homology with GST of Vitis vinifera (AY971515), Litchi chinensis (EF613493), Petunia hy-
brida (Y07721), Perilla frutescens (AB362191) and Zea mays (EU964162), and the homology coefficient is
99%, 67%, 64%, 61% and 47% respectively. Semi-quantitative PCR analysis showed that VAmGST4gene was
expressed in the stem, flesh and skin except in the leaf. Particularly, during coloring process, the expression lev-
el of VAmGST4 in skin increased progressively by the accumulation of anthocyanins. The result demonstrated
that the expression level of VAmGST4 had close correlation with the accumulation of anthocyanins.
Key words: Vitis amurensis; cDNA cloning; glutathione S-transferase
成熟葡萄的果皮中大多含有花色苷(anthocya-
nins)。花色苷是黄酮类化合物中的一类, 除了赋
予植物器官各种颜色外, 对授粉、种子传播、防
护紫外线损伤、抵抗病原物侵染等方面具有重要
作用(Harborne和Williams 2000; Wrolstad 2004)。
葡萄花色苷的合成主要是在表皮细胞细胞质中,
在多种酶的作用下, 花色苷通过苯丙烷类代谢途
径和类黄酮途径两个过程形成(Koes等2005; Jeong
等2006)。花色苷形成之后因为具有高生物化学活
性, 对细胞有毒害作用, 需由细胞质转运到液泡或
细胞壁中贮存(Klein等1996; Grotewold等1998)。
谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)
可以催化花色苷通过共价键与谷胱甘肽结合, 形
成谷胱甘肽S-偶联物, 而液泡膜具有谷胱甘肽S结
合泵(GSH S-X)的活性, 可以识别谷胱甘肽并将其
运送到液泡中, 形成花色苷泡状内涵体(anthocyanic
vacuolar inclusions, AVIs), 进而完成花色苷的固
定、积累和贮存(Zhang等2006; Li等1997)。谷胱
甘肽S-转移酶因为具有特殊的亲和活性, 被认为在
色素运输与积累过程中起到关键作用(Ageorges等
植物生理学报1162
2006), 是花色苷生物合成的最后一个酶(Alfenito
等1998; Terrier等2005)。
山葡萄(Vitis amurensis)原产于我国东北和俄
罗斯远东地区, 是我国特有的种质资源, 其浆果含
有大量的花色苷。目前有关山葡萄花色苷生物合
成的分子生物学研究较少, 有必要对其花色苷生
物合成途径中的关键酶进行研究。山葡萄花色苷
生物合成过程中的F3H和UFGT已有报道(刘海峰
等2009a, b), 本文采用RT-PCR和SMART RACE技
术首次从山葡萄果皮克隆了VAmGST4的cDNA全
长序列, 同时对序列进行了生物信息学分析, 对
VAmGST4在山葡萄不同组织和器官中的表达进行
了初步研究, 为将来研究GSTs表达调控方式与花
色素在果皮中特异性合成和积累的关系, 从而在
分子水平上阐明山葡萄花色素高含量的原因和机
理建立基础。
材料与方法
山葡萄品种‘双丰’(Vitis amurensis Rupr. Sh-
uang Feng)采自吉林省吉林市国家左家山葡萄种
质资源圃。在果实发育过程中, 分别于花后2周、
4周、6周、8周以及果皮5%着色、10%着色、
50%着色、全部着色、成熟期等9个时期采摘果
实, 选择无病虫害的果粒, 采后立即置于液氮中冷
冻, -80 ℃冰箱保存, 取果皮作为供试材料。在果
实转色期(50%着色)分别取幼叶、成熟叶和茎, 置
于液氮中冷冻, -80 ℃冰箱保存备用。
实验所用大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、
pMD18-T载体、胶回收试剂盒、Ex Taq聚合酶购
于TaKaRa; 反转录酶SuperScriptII购于Invitrogen公
司; RACE试剂盒购于Clontech公司。其它试剂为国
产分析纯, DNA测序由上海生工生物公司完成。
采用改良的CTAB法(Li等2006)提取成熟期山
葡萄果皮总RNA备用。根据GenBank中已报道的
GST的核苷酸序列和氨基酸序列, 通过多序列比对
确定其共有的保守区, 利用Primer 5.0设计1对引物
VAmGSTs: 5′ ACTTGGTGAAGGAAGCTGGA 3′,
VAmGSTa: 5′ TTGGAAAGGTGCATACATGG 3′。
采用SuperScriptII反转录酶合成cDNA, 利用合成
引物进行PCR, 扩增目的基因片段。PCR反应采用
50 μL体系, 其中含0.4 μL Taq DNA聚合酶、1×Taq
缓冲液、5 mmol·L-1 MgCl2、200 μmol·L
-1 dNTP、
60 ng引物和200 ng模板cDNA。扩增程序为 94 ℃
预变性5 min, 94 ℃ 30 s, 53 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min,
35个循环, 最后72 ℃延伸7 min。对目的基因片段
进行纯化 , 连接pMD18-T载体 , 转化大肠杆菌
DH5α感受态细胞, 蓝白斑筛选, 挑取8个阳性克隆
测序, 获取中间片段。
用 SMART™ RACE cDNA Amplification Kit
方法进行RACE cDNA扩增。根据保守区测序结
果, 克隆中间片段的引物可以继续用于RACE, 其
中VAmGSTs用做3′ RACE引物, VAmGSTa 用做5′
RACE引物。除5′ RACE和3′ RACE退火温度均为
60 ℃外, 反应体系、扩增程序和回收转化方法同
前。测序后应用Vector NTI Suite 9.0软件去除载体
序列, 将5′ RACE和3′ RACE测序结果拼接获得
cDNA全长。
应用DNAStar软件对获得的VamGST4全长
cDNA序列进行开放阅读框(ORF)分析并将其推导
为相应的氨基酸序列。蛋白质氨基酸相似性比对
在NCBI的BlastP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blastp)中分析; 不同植物GST氨基酸序列的多序列
比较应用ClustalW 1.82 (http://www.ch.embnet.org/
software/ClustalW.html)进行分析; 蛋白质的分子质
量、等电点及基本性质用Protparam (http://au. ex-
pasy.org/tools/protparam.html)预测; 信号肽分析利
用SignalP 3.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/ser-
vices/Signalp), 跨膜区分析在网站(http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM/)进行, 疏水性分析和二级结
构预测分别在网站(http://us.expasy.org/cgi-bin/
protscale.pl)和(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_
automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)进行。
采用半定量 RT-PCR方法, 对VamGST4基因在
山葡萄开花后2周、4周、6周、8周、5%着色、
10%着色、50%着色、全部着色、完全成熟等9个
时期浆果果皮中的表达进行检测, 同时对转色期
的幼叶、成熟叶、茎、果肉和果皮中VamGST4的
表达进行检测。采用改良的CTAB法分别提取各
时期、各组织器官中的总RNA, 反转录合成cDNA
备用。半定量RT-PCR反应体系所用引物及反应程
序与基因克隆所用一致, 以山葡萄的KyActin基因
作为内参。KyActin基因的引物分别为KyActin-s:
刘海峰等: 山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因(VAmGST4)克隆及表达分析 1163
5′ GATTCTGGTGATGGTGTGAGT 3′, KyActin-a:
5′ GACAATTTCCCGTTCAGCAGT 3′。退火温度
为59 ℃, 30个循环。使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳
对PCR产物进行检测, 通过测量每个条带的亮度来
判断基因的表达丰度。
结果与讨论
1 GST cDNA全长序列克隆及生物信息学分析
采用改良的CTAB法提取成熟期葡萄果皮中
的总RNA, 将其反转录合成cDNA模板, 用GST基
因引物VAmGSTs和VAmGSTa进行PCR扩增, 获得
了目的特异条带, 约165 bp左右, 与预期片段大小
相近。产物经连接转化、筛选测序后获得保守序
列片段, 用NCBI/BLAST程序进行同源搜索, 结果
与欧亚种葡萄(Vitis vinifera) GST基因的同源性为
98%。
RACE扩增结果(图1)显示, 以3′-RACE-Ready-
cDNA为模板, VAmGSTs与UPM为引物, 扩增得到
约300 bp的条带。以5′-RACE-Ready-cDNA为模板,
VAmGSTa与UPM为引物扩增得到约750 bp的条
带。阳性对照反应用GSP1和GSP2为引物分别扩
增, 得到与预期大小相同约165 bp的条带。阴性对
照单引物扩增, 没有条带产生。
对山葡萄GST基因进行ORF分析结果表明, 该
基因全长885 bp, 包括ORF 642 bp、61 bp 5′非转译
区和150 bp的3′非转译区。基因的ORF编码213个
氨基酸, 分子量为24.24 kDa, 等电点为5.72。负电
荷残基(Asp+Glu)数为32个, 正电荷残基(Arg+Lys)
数为27个。不稳定系数为31.27, 为稳定蛋白质。
将该基因命名为VAmGST4, GenBank登录号为
FJ645770。
在NCBI的蛋白保守区数据库, 对山葡萄VAm-
GST4基因进行蛋白保守区预测, 结果(图2)显示,
VAmGST4有多个保守域, 该基因属于GST超基因
家族。
用推导的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同
源性比较, 其氨基酸序列与欧亚种葡萄(Vitis vin-
ifera, GenBank登录号AY971515)、荔枝(Litch
chinensis, GenBank登录号EF613493)、矮牵牛(Pe-
tunia hybrida, GenBank登录号Y07721)、紫苏(Per-
illa frutescens, GenBank登录号AB362191)和玉米
(Zea mays, GenBank登录号EU964162)等植物的
G S T氨基酸序列的相似性系数分别为9 9 %、
67%、64%、61%和47% (图3)。
VAmGST4的两个典型结构域中GST-N结构
域位于氨基酸序列的6~75位, GST-C结构域位于氨
基酸序列的129~202位(图3)。
图1 RACE扩增GST基因全长cDNA
Fig.1 cDNA amplification of GST gene
by RACE procedure
M: DL2000; 1: 5′ RACE阴性对照; 2：5′ RACE产物; 3: 5′
RACE阳性对照; 4: 3′ RACE阴性对照; 5：3′ RACE产物; 6: 3′
RACE阳性对照。
图2 VAmGST4 氨基酸序列功能域分析
Fig.2 Function domain analysis of VAmGST4
植物生理学报1164
用MEGA 4.0软件对该基因及其它植物的GST
氨基酸序列进行多序列比对, 绘制分子进化树, 结
果(图4)表明, 山葡萄的VAmGST4与欧亚种葡萄
GST4 (AY971515)、脐橙GST (Citrus sinensis,
DQ198153)、荔枝GST、拟南芥GST (Arabidopsis
thaliana, AF288189)亲缘关系较近。与欧亚种葡萄
的GST1 (AY156048)、GST2 (EF088687)、GST3
(EU181421)和GST5 (EU188422)同源性较低。
根据蛋白同源性和基因组织结构 , 植物的
GSTs分为φ、ξ、τ、ο和λ五类(Moons 2003)。通过
BlastP比对, 确定山葡萄VAmGST4属于φ类。在葡
萄中存在有多种GST基因, 不同的基因行使功能有
所差异, GST可以通过和GSH结合而脱毒, 可以保
护植物组织免受伤害, 在细胞的氧化还原稳态和
细胞程序衰老方面起作用, 还可以作为胁迫信号
蛋白(Zhang等2006; Li等1997)。有研究认为花色
苷是GST底物之一, GST在花色苷的固定、积累和
贮存中起到重要作用, 在花色苷生物合成过程中,
GST是最后一个关键酶(Alfenito等1998; Terrier等
2005)。从葡萄细胞悬浮培养中已分离到5个GST,
其中GST4被认为与花色苷的积累紧密相关(Zhang
等2007)。
对山葡萄VAmGST4进行信号肽预测的结果
表明, 该基因不具有信号肽。蛋白质跨膜性分析
结果表明, VAmGST4无明显的跨膜性, 不可能是膜
上的受体或定位在膜上。蛋白质疏水性分析结果
表明, VAmGST4疏水性最大值为2.444, 最小值
为–2.80, 疏水性平均值为–0.119。二级结构分析表
明, VAmGST4的二级结构主要以α螺旋(49.77%)和
不规则盘绕(34.74%)为蛋白最大量的结构元件。
2 山葡萄VAmGST4基因的表达
在花后2周、4周、6周、8周, 果皮着色5%、
10%、50%、全部着色和完全成熟等9个时期, 果
皮中VAmGST4的半定量RT-PCR结果(图5)表明,
VAmGST4在果实转色期前基本不表达, 转色期为
上调表达。VAmGST4主要在花色苷生物合成后行
使转运的功能, 所以前期花色苷没有形成时, 基本
不表达。
图3 VAmGST氨基酸序列的多序列比对
Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of VAmGST
山葡萄(Vitis amurensis, FJ645770)、欧亚种葡萄(Vitis vinifera, AY971515)、荔枝(Litchi chinensis, EF613493)、矮牵牛(Petunia hybrida,
Y07721)、紫苏(Perilla frutescens, AB362191)、玉米(Zea mays, EU964162), 下划线为VAmGST保守域。
刘海峰等: 山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因(VAmGST4)克隆及表达分析 1165
山葡萄转色期(50%着色)各个组织器官中的
VAmGST4表达结果(图6)表明, VAmGST4在叶片中
不表达, 茎、果肉和果皮中均有表达, 但果肉表达
丰度较低。
GST的转色机理已经在一些植物中有所研究,
已经发现一些与GST相近基因, 如矮牵牛的AN9
(Alfenito等1998)和玉米中的BZ2 (Mcgonogle等
2000)等。山葡萄的VAmGST4主要在花色苷生物
合成后, 行使转运的功能, 所以前期花色苷没有形
成时 , 基本不表达。在研究各个组织器官中
VAmGST4的表达时, 所取山葡萄的幼叶和成熟叶
片为绿色, 不含花色苷; 而茎则呈淡红色, 果皮紫
红色, 含有一定量的花色苷; 果肉虽然绿色不合成
花色苷, 但可能由于在着色过程中有内源和外源
毒素产生, 诱导了VAmGST4的少量表达。山葡萄
果皮着色时, 在多种酶的作用下, 花色苷在细胞质
中大量合成, 由于花色苷的高生物化学反应活性,
图4 GST构建的分子进化树
Fig.4 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of GST
括号中为GenBank登录号。
图5 不同果实成熟时期果皮中VAmGST4的表达
Fig.5 Expression of VAmGST4 gene in fruit coat
at different developmental stages
图6 VAmGST4在各个组织中的表达
Fig.6 Expression of VAmGST4 genes in various tissues
植物生理学报1166
对细胞产生毒害作用, 刺激了VAmGST4等相关酶
的合成, 通过其催化或者载体运输作用将花色苷
运输到液泡中, 在液泡中固定、贮存, 从而稳定细
胞的内环境, 可见VAmGST4基因的表达与花色苷
的产生密切相关, 属于被诱导表达。
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