全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1501~1509　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0079 1501
收稿 2014-05-17　　修定 2014-08-25
资助 国家自然科学基金(31070597和31270656)。
* 通讯作者(E-mail: xiaxl@bjfu.edu.cn; Tel: 010-62336400)。
胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析
张洲嘉, 帅鹏, 苏艳艳, 尹伟伦, 夏新莉*
北京林业大学生物科学与技术学院, 林木育种国家工程实验室, 北京100083
摘要: ECT基因家族已在拟南芥中被发现并报道, 然而它们是否参与植物在逆境胁迫下的响应过程却鲜有报道。为研究胡
杨PeECT8基因的功能, 从胡杨叶片cDNA中克隆出PeECT8基因, 构建CaMV 35S::PeECT8植物表达载体, 利用花序浸染法转
化拟南芥, 经GUS组织化学染色和PCR检测, 获得转基因植株, 进而测定不同浓度盐(NaCl)和甘露醇胁迫下转基因拟南芥种
子的萌发率、生长势和根长。测序结果表明, 该基因编码区长度为1 821 bp, 可编码606个氨基酸。蛋白序列比对发现,
PeECT8基因与毛果杨PtrECT8同源基因所编码的氨基酸一致性达93.42%, PeECT8蛋白包含一个YT521-B-like保守结构
域。相比于野生型, 过量表达PeECT8的拟南芥在不同浓度NaCl胁迫下萌发率降低, 在D-甘露醇胁迫下萌发率没有明显变
化。在NaCl和D-甘露醇胁迫下, 转基因拟南芥根的伸长长度小于野生型。这表明PeECT8基因在盐胁迫和渗透胁迫下发挥
负调控的作用。
关键词: 胡杨; PeECT8; 胁迫; 转基因
Cloning and Functional Analysis of PeECT8 in Populus euphratica
ZHANG Zhou-Jia, SHUAI Peng, SU Yan-Yan, YIN Wei-Lun, XIA Xin-Li*
College of Biological Sciences and Technology, National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University,
Beijing 100083, China
Abstract: ECT gene family were found in Arabidopsis, but it is unknown whether they were involved in the
pathway of the plant in response to stress or not. In order to study the function of PeECT8 homologous gene in
poplar, the PeECT8 gene was cloned by RT-PCR from Populus euphratica. Sequencing results indicated that
the length of PeECT8 is 1 821 bp encoding 606 amino acids. Blast analysis showed that PeECT8 shares over
more than 93% homology in amino acid sequence with PtrECT8 homologue. The deduced amino acid sequence
contained one conserved domain (YT521-B-like). Based on sequence analysis, the PeECT8 was fused to CaMV
35S promoter to characterize gene function. Transgenic Arabidopsis was obtained by floral dip method and ana-
lyzed by GUS detection and PCR. The results showed that the germination percentage of transgenic Arabidop-
sis was reduced under NaCl stress and was not affected by D-mannitol; the root length of transgenic Arabidop-
sis was shorter than that of wild type under NaCl and D-mannitol stresses. It indicates that the PeECT8 gene
plays a negative role in response to stress condition.
Key words: Populus euphratica; PeECT8; stress; transgenic
光、致病菌、激素和非生物胁迫等环境都会
导致植物细胞内钙离子的浓度变化。植物在逆境
胁迫下产生钙信号后, 再通过下游的钙结合蛋白
进行转导, 从而在细胞内引起一系列的生理生化
反应(Berridge等1998)。与逆境胁迫相关的钙信号
转导的结合蛋白有钙依赖蛋白激酶(calcium-de-
pendent protein kinase, CDPK)、钙调素(calmod-
ulin, CaM)、钙调神经磷酸酶B类似蛋白(calci-
neurin B-like protein, CBL)。对CBL功能的研究是
植物逆境胁迫信号转导研究领域的热点。有研究
表明, CBL只能和与其互作的蛋白激酶(CBL-inter-
acting protein kinase, CIPK)蛋白家族相互作用, 才
能将信号向下游传递(Kim等2000; Batistic和Kudla
2004)。CBL-CIPK之间存在多种信号传递模型, 目
前, 已经阐明多条CBL-CIPK信号途径的支路, 它
们分别参与高盐、干旱、低钾、糖和ABA等非生
研究报告 Original Papers
植物生理学报1502
物胁迫信号的转导, 另外, CBL-CIPK信号途径对
质膜H+-ATP酶也具有重要的调节作用(Ludwig等
2005; MacRobbie 2006)。
在模式植物拟南芥中, 对CBL-CIPK信号途径
的研究较为深入。Ok等(2005)研究发现拟南芥中
存在两个与CIPK1有着密切联系的蛋白——ECT1
和ECT2, 受CBL-CIPK信号途径的调节, 这两个蛋
白含有一个非常相似的C-端结构域, 这个结构域
是ECT1和ECT2蛋白与CIPK1结合及其蛋白与核
膜结合这两个生理过程所必需的, 这种C-端结构
域也同样存在于单子叶植物和动物的某些蛋白
中。ECT蛋白可能是CBL-CIPK钙离子信号途径中
的一部分元件, 也可能是一种将细胞质Ca2+信号转
导到核的候选分子。
胡杨作为我国西北沙漠地区唯一能够生存的
高大乔木, 生命力顽强, 具有极强的耐高温、耐盐
碱、耐贫瘠以及抗旱和抗寒能力。胡杨在进化过
程中形成了多种适应非生物逆境胁迫的分子和生
理调节机制 , 具有丰富的抗逆境基因资源(Li等
2009)。目前, ECT基因在植物领域的研究仍仅限
于拟南芥中有报道, 而在其他植物物种中鲜有报
道, 作用机制也依然未知。因此, 研究与胡杨抗逆
相关的ECT基因, 将有助于更加深入地了解胡杨的
抗逆分子机制。本文从胡杨中克隆了PeECT8基
因, 对PeECT8编码的蛋白进行了一系列生物信息
学分析, 构建CaMV 35S::PeECT8植物表达载体并
转化拟南芥, 对转基因拟南芥进行了GUS组织化
学染色和PCR分析, 以及逆境胁迫下的萌发率和根
伸长等表型分析。
材料与方法
1 实验材料
胡杨(Populus euphratica Oliv.)采自新疆阿尔泰
地区; 野生型哥伦比亚拟南芥(Arabidopsis thaliana)、
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV-
3101、植物表达载体pCAMBIA1301由北京林业大
学林木育种国家工程实验室保存; 大肠杆菌(Esche-
richia coli)感受态Top10购自北京天根生化科技公司,
克隆载体pGEM-T Easy Vector购自Promega公司。
2 主要试剂
LA Taq酶、核酸分子量标记(DNA marker)、
T4 DNA连接酶、限制性内切酶NcoI和BglII等购自
TaKaRa公司; 引物合成及DNA序列测定由上海生
工完成。
3 胡杨PeECT8基因的克隆
取胡杨叶片, 采用CTAB法提取总RNA, 合成
cDNA第一链。根据毛果杨(Populus trichocarpa)
同源基因PtrECT8 (Phytozome v9.1 number: Po-
tri.010G175500.1)序列, 使用Primer 5.0设计引物。
扩增引物为: P1F, 5-ATGGCTCAACAACAACAA-
CAACAAC-3 ; P1R, 5 -TCATTCTTTTGT-
GTTGTCTCCAACC-3。反应体系为20 μL, 含2 μL
10×LA PCR缓冲液、1.6 μL (2.5 mmol·L-1) dNTP、
2 μL第一链cDNA稀释产物、0.4 μL 10 μmol·L-1上
游引物P1F、0.4 μL 10 μmol·L-1下游引物P1R、0.2 μL
LA Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1)、13.4 μL ddH2O。
反应条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性2 min, 58
℃退火30 s, 72 ℃延伸2 min, 共进行35个循环; 最
后再72 ℃延伸5 min。PCR产物经凝胶回收后, 将
纯化产物与pGEM-T Easy Vector连接, 然后进行
PCR和限制性内切酶(NcoI和BglII)双酶切鉴定。
阳性克隆委托上海生工有限公司进行测序。
4 胡杨PeECT8基因的生物信息学分析
蛋白等电点和分子量预测使用ExPASy软件;
基因结构及染色体定位使用Phytozome v9.1毛果杨
基因组数据库(Goodstein等2012); 保守结构域分析
使用Conserved Domains Database (NCBI); 序列同源
性分析使用ClustalX 1.83和BioEdit软件; 毛果杨
PtrECT8同源基因的功能预测使用PopGenIE网站。
5 植物表达载体的构建
将pCAMBIA1301质粒和PeECT8-T重组质粒
同时进行NcoI和BglII双酶切, 回收纯化目的片段,
通过T4 DNA连接酶连接, 并将连接产物转化大肠
杆菌感受态细胞Top10, 新的重组质粒经100 mg·L-1
氨苄霉素(ampicillin)和PCR筛选后, 进行双酶切验
证, 获得CaMV 35S::PeECT8植物表达载体。
6 拟南芥遗传转化
将CaMV 35S::PeECT8的重组质粒导入根癌
农杆菌GV3101, 采用农杆菌介导的花序侵染法转
化拟南芥(Zhang等2006)。将转基因的拟南芥T0代
种子播种在1/2MS+7 g·L-1琼脂糖+6 mmol·L-1甘露
糖的筛选培养基上, 待抗性苗长出两片子叶时, 即
张洲嘉等: 胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析 1503
可将其移栽到培养基质中, 等其长大后, 取拟南芥
植株的少量叶片用于检测。
7 转基因拟南芥的检测
7.1 GUS组织化学法染色鉴定
将待测转基因T1代拟南芥幼苗及野生型对照
浸入适量染色液中, 真空抽虑12 h, 37 ℃染色过夜
后, 再用酒精脱色, 肉眼观察染色结果并拍照。染
色液为100 mmol·L-1磷酸钠缓冲液(pH 7.0), 内含0.5
mg·mL-1 X-GluC、1% Triton X-100、10 mmol·L-1
EDTA和1% DMSO。
7.2 转基因植株的PCR检测
取筛选出来的少量拟南芥植株的叶片, 采用
CTAB法提取基因组DNA, 以P1F和P1R为引物进
行PCR检测 , 分别以质粒DNA和野生型拟南芥
基因组DNA为模板的PCR产物, 作为阳性和阴性
对照。
8 过表达PeECT8基因拟南芥的表型分析
选取转基因拟南芥T3代株系L1、L2和L3, 观
察并统计它们在1/2MS、盐胁迫(1/2MS+NaCl
50、100、150、200 mmol·L-1)和渗透胁迫(1/2MS+
D-甘露醇100、150、200、250、300 mmol·L-1)培
养基中的萌发情况, 以及转基因拟南芥在1/2MS、
1/2MS+150 mmol·L-1 NaCl和1/2MS+300 mmol·L-1
D-甘露醇培养基中的根伸长情况。
实验结果
1 PeECT8基因的克隆与测序
PeECT8基因的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电
泳检测, 扩增片段约1 800 bp。将目的条带回收纯
化, 并与pGEM-T Easy Vector连接, 获得重组质粒
PeECT8-T。进一步进行PCR检测和双酶切验证, 阳
性克隆送公司测序。测序结果表明, PeECT8编码
区长度为1 821 bp, 编码606个氨基酸(图1)。与参照
的毛果杨PtrECT8基因的编码区一致性为96.61%,
与毛果杨PtrECT8氨基酸一致性为93.42%。
2 PeECT8基因的生物信息学分析
2.1 基因结构
利用毛果杨基因组数据库(Phytozome v9.1)绘
制的基因结构图显示, PtrECT8含有9个外显子, 9
个内含子(图2-A)。染色体定位显示PtrECT8位于
10号染色体上(图2-B)。
2.2 蛋白质分子特征
软件分析显示, PeECT8编码的蛋白质理论等
电点为6.19, 分子式为C2988H4551N811O929S17, 分子量
为67.24 kDa。为了预测PeECT8基因的功能, 我们
在Conserved Domains Database (NCBI)中对氨基酸
保守结构域进行了分析, 发现这个基因编码的蛋
白质含有一个YT521-B-like保守结构域 , 证实
PeECT8蛋白为YTH家族的成员。
2.3 序列同源性分析
序列分析表明, PeECT8蛋白与毛果杨PtrECT8
(Potri.010G175500.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)
AtECT8 (AT1G79270.1)、巴旦木(Prunus persica)
PpECT8 (ppa003664m)、橙子(Citrus sinensis)
CsECT8 (orange1.1g048663m)和水稻(Oryza sativa)
OsECT8 (LOC_Os01g48790.2)所编码的氨基酸一致性
分别为: 93.42%、42.08%、55.95%、45.60%、43.93%。
PeECT8蛋白含有YT521-B-like保守结构域(图3)。
2.4 毛果杨PtrECT8同源基因的功能预测
RNA测序数据显示, 毛果杨PtrECT8同源基因
(Popgenie网站: http://popgenie.org/gene?id=Potri.
010G175500#expression)受生物胁迫(虫害)和非生
物胁迫(干旱和机械胁迫)诱导表达。
3 CaMV 35S::PeECT8的植物表达载体构建
为研究PeECT8基因功能, 将本实验室改造的
pCAMBIA1301载体与引入酶切位点的PeECT8-T重
组质粒分别进行NcoI和BglII双酶切, 再将载体片
段与目的片段用T4 DNA连接酶连接, 新的重组质粒
经双酶切验证(图4-A), 获得CaMV 35S::PeECT8的植
物表达载体。采用液氮冻融法, 将其转入根癌农
杆菌GV3101感受态细胞中, 经菌落PCR鉴定, 获得
阳性克隆, 完成工程菌制备。
4 转基因拟南芥的检测
对筛选出的转基因拟南芥T1代幼苗进行GUS
组织化学染色检测, 结果显示, 经GUS染色后转基
因植株呈现蓝色, 而野生型的对照植株没有蓝色
出现, 初步证明转基因成功(图5)。
取T1代拟南芥植株的少量叶片, 利用CTAB法
提取基因组DNA并进行PCR检测, 结果显示75%以
上的植株出现大小约为1.8 kb的特异性条带, 部分
株系的检测结果如图5-E所示。结果表明PeECT8
基因已经整合到拟南芥基因组中。
植物生理学报1504
图2 PtrECT8基因结构(A)及染色体定位(B)
Fig.2 The structure (A) and chromosome location of PtrECT8 (B)
黑色方框表示外显子, 灰色方框表示非编码区(UTRs), 方框之间的直线表示内含子。
图1 PeECT8基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列
Fig.1 The cDNA and deduced amino acid sequences of PeECT8
*表示终止密码子。
张洲嘉等: 胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析 1505
图3 PeECT8与其他植物ECT8蛋白氨基酸序列的比对
Fig.3 Alignment of amino acid sequence of PeECT8 with homologous proteins of other plants
黑线表示YT521-B-like保守结构域。
图4 CaMV 35S::PeECT8植物表达载体的构建
Fig.4 Construction of CaMV 35S::PeECT8 expression vector
CaMV 35S::PeECT8植物表达载体的NcoI和BglII双酶切鉴定(A)和结构示意图(B)。M: DNA分子量标记; 1和2: 酶切产物。
植物生理学报1506
5 过表达PeECT8拟南芥的表型分析
将筛选得到的3个T3代转基因株系L1、L2和
L3以及野生型拟南芥种子播到1/2MS、1/2MS+
NaCl (50、100、150、200 mmol·L-1)和1/2MS+D-
甘露醇(100、150、200、250、300 mmol·L-1)培养
基上, 统计种子的萌发情况。结果表明, 在1/2MS
培养基中 , 野生型与转基因株系萌发率分别为
98.75%和97.48%, 差异不明显(图6-A和图7-A); 在
含50和100 mmol·L-1 NaCl的培养基上转基因植株
萌发率相比野生型植株减少(图6-B和C、图7-A);
在含150 mmol·L-1 NaCl的培养基上, 转基因植株的
萌发率比野生型有更显著性的降低, 野生型植株
的萌发率为46.67%, 而转基因植株仅为26.11% (图
7-A), 尤其是株系L3, 其长势明显弱于野生型(图
6-D); 而在含200 mmol·L-1 NaCl的培养基上, 野生
型与转基因植株萌发率都很低(图6-E)。方差分析
显示, 在含50、100、150 mmol·L-1 NaCl的培养基
上, 转基因植株与野生型植株萌发率的差异极显
著(P<0.01)。然而, 在1/2MS+D-甘露醇(100、
150、200、250、300 mmol·L-1)的培养基上, 转基
因与野生型植株的萌发率并没有明显变化, 长势
几乎一致(图6-F~J和图7-B)。
将转CaMV 35S::PeECT8、转空载体和野生
型拟南芥植株播种在1/2MS、1/2MS+150 mmol·L-1
NaCl和1/2MS+300 mmol·L-1 D-甘露醇培养基上,
观察它们的根伸长情况。结果显示, 野生型和转
基因植株在含NaCl的1/2MS培养基上的生长势和
根长均比在不含NaCl培养基上的弱; 而在D-甘露
醇胁迫下的野生型和转基因植株的生长势和根长
与不经胁迫处理的没有明显差别(图8)。另外, 在3
种培养基中, 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥根的伸
长小于转空载体和野生型植株, 而转空载体拟南
芥和野生型植株根的伸长差异不明显(图9)。方差
分析显示, 在NaCl和D-甘露醇胁迫下, 转基因植株
与野生型植株根伸长长度的差异极显著(P<0.01)
(图9)。
讨　　论
胡杨PeECT8蛋白具有一个C-端保守结构
域——YTH结构域, 因此属YTH蛋白家族, 此家族
成员可以在有丝分裂的细胞中选择性地删除与减
数分裂相关的特异基因转录本; 同时, 在高等真核
生物中, YTH家族成员可能在配子发育过程中抑
制基因表达。鼠YT521-B蛋白是一个酪氨酸磷酸
图5 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥的GUS组织化学染色和PCR检测
Fig.5 GUS assay and PCR analysis of transgenic CaMV 35S::PeECT8 Arabidopsis
A~C: 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥; D: 野生型; E: PCR检测。M: DNA分子量标记; 1~3: 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥; P: CaMV
35S::PeECT8表达载体质粒; WT: 野生型。
张洲嘉等: 胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析 1507
化核蛋白, 与核转录组分骨架附着因子B和在有丝
分裂过程中相关的Sam68蛋白相互作用, 体内剪切
分析表明, YT521-B在可变剪切位点的选择过程中
发挥一定的作用, 它受酪氨酸磷酸化作用的调节
(Hartmann等1999; Harigaya等2006)。结构分析表
明 , YTH结构域与PUA结构域相关 (Zhang等
2010)。YTH家族成员还被证实与一些基因的转录
后调控相关, 它可能与基因转录后内含子的剪切
和修饰有关并对相关蛋白在细胞中的亚细胞定位
起着至关重要的作用(Stoilov等2002; Ok等2005)。
在植物受到环境刺激后, 细胞质内的钙离子
浓度首先发生变化, 但对胞质内钙离子信号转导
到细胞核内, 最终调节基因表达以适应环境的这
一途径仍知之甚少。Ok等(2005)研究拟南芥时发
图6 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥在含不同浓度NaCl和D-甘露醇培养基上的萌发情况
Fig.6 Germination of transgenic CaMV 35S::PeECT8 Arabidopsis on media with different concentrations of NaCl and D-mannitol
WT: 野生型; L1、L2、L3: 不同转基因拟南芥株系。
植物生理学报1508
现了ECT1和ECT2蛋白, 它们与一个CIPK成员——
CIPK1有着明确的联系, 这两个蛋白都具有一个非
常相似的C-端保守结构域, 即YTH结构域, 这个结
构域是它们与CIPK1结合及其与核膜结合这两个
生理过程所必需的。YTH结构域同样广泛分布于
其他真核生物中, 其被证实在将胞质内钙信号转
移到核内, 从而调控基因表达这一过程中起重要
的作用。由于ECT家族几个成员与CIPK之间存在
图7 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥在含不同浓度NaCl和D-甘露醇培养基上的萌发率
Fig.7 Germination percentage of transgenic CaMV 35S::PeECT8 Arabidopsis on
media with different concentrations of NaCl and D-mannitol
**P<0.01。
图8 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥在不同浓度NaCl和D-甘露醇培养基中根的伸长情况
Fig.8 Root elongation of transgenic CaMV 35S::PeECT8 Arabidopsis in media with different concentrations of NaCl and D-mannitol
WT: 野生型; 1301: 转空载体; PeECT8: 转CaMV 35S::PeECT8。
图9 转CaMV 35S::PeECT8拟南芥在含不同浓度NaCl和D-甘露醇培养基中根的伸长长度
Fig.9 Root elongation length of transgenic CaMV 35S::PeECT8 Arabidopsis in media
with different concentrations of NaCl and D-mannitol
WT: 野生型; 1301: 转空载体; PeECT8: 转CaMV 35S::PeECT8。**P<0.01。
张洲嘉等: 胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析 1509
明显的相互作用, 这说明逆境条件下该基因家族
可能通过钙信号转导途径在基因转录、修饰以及
RNA水平调控上发挥作用。
为探究胡杨PeECT8基因的功能, 本研究从胡
杨叶片cDNA中克隆出PeECT8基因, 构建了CaMV
35S::PeECT8的植物表达载体并转化拟南芥。相
比于野生型, 过量表达PeECT8的拟南芥在盐(NaCl)
胁迫下萌发率降低, 在渗透(D-甘露醇)胁迫下萌发
率没有明显变化; 另外, 在盐和渗透胁迫下, 转基
因拟南芥根的伸长长度都小于野生型。本研究初
步表明PeECT8基因在响应逆境胁迫的过程中起负
调控作用, 但ECT基因在植物逆境响应中是通过怎
样的方式调控生理生化反应, 以及其与CIPK等其
他蛋白的互作关系, 都仍需进一步深入的探究。
参考文献
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