全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 759~763 759
收稿 2013-05-15 修定 2013-07-01
资助 国家自然科学基金项目(30871576)。
* 通讯作者(E-mail: tangsh@swu.edu.cn; Tel: 13509418057)。
‘海沃德’猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立
吴秀华, 张艳玲, 周月, 罗克明, 汤绍虎*
西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验室, 生命科学学院, 重庆400715
摘要: 以‘海沃德’猕猴桃组培苗叶片为外植体, 建立叶片直接再生体系。结果表明, 叶片再生不定芽最佳培养基为MS+3.0
mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA, 出芽率达80.95%; 不定芽增殖最佳培养基为MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1
GA3, 1~3代平均增殖系数达6.38; 最适不定芽生根培养基为1/2MS+0.7 mg·L
-1 IBA, 生根率为100%; 试管苗移栽成活率为
92.38 %。试验结果为采用叶盘法进行‘海沃德’猕猴桃的遗传转化奠定了良好基础。
关键词: ‘海沃德’猕猴桃; 叶片; 高频再生体系
Establishment of High Frequency and Direct Regeneration System from Leaf
of ‘Hayward’ Kiwifruit [Actinidia deliciosa (A. Chev. ) C. F. Liang et A. R.
Ferguson]
WU Xiu-Hua, ZHANG Yan-Ling, ZHOU Yue, LUO Ke-Ming, TANG Shao-Hu*
Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, School of Life Sciences, Southwest
University, Chongqing 400715, China
Abstract: Leaves excised from ‘Hayward’ kiwifruit were used as explants to establish regeneration system.
The results indicated that the maximum adventitious buds regeneration frequency achieved 80.95% on the
mediu of MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA; The most suitable medium for shoot multiplication was
MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1 GA3 and the three generations average multiplication
coefficient was up to 6.38; 1/2MS media with 0.7 mg·L-1 IBA was the most suitable for the rooting of
regenerated shoots, and the rooting rate was 100%. The survival rate of hardened regenerated plantlets was as
high as 92.38% after transplanting. The results laid a sound foundation for genetic transformation by means of
leaf disc method.
Key words: ‘Hayward’ kiwifruit (Actinidia deliciosa); leaf; high frequency regeneration
猕猴桃属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属
(Actinidia)多年生藤本植物, 是20世纪最早经人工
驯化栽培的四大野生果树之一 (Warr ington和
Weston 1990), 其果实具有丰富的营养价值和良好
的药用价值, 尤含大量Vc, 享有“Vc之王”美称。
‘海沃德’ (Hayward)猕猴桃是新西兰选育的美味猕
猴桃优良品种, 果实呈长圆柱形, 单果均重90 g, Vc
含量93.59 mg·100 g-1 (张海平等2011), 是目前世界
上最耐贮藏、货期最长的猕猴桃品种, 因其具有
味美、耐贮、货架期长等优点而深受果农和广大
消费者喜爱。
猕猴桃雌雄异株, 倍性复杂, 育种周期长。目
前, ‘海沃德’猕猴桃的常规育苗方法主要为实生苗
的嫁接法和成年株的扦插繁殖法。嫁接苗童期生
长缓慢, 育苗周期长达2年以上(张海平等2011); 扦
插苗成活率和繁殖效率较低。同时, 在生产栽培
中猕猴桃经常发生溃疡病等严重病害, 导致枝条
萎蔫、枯死或整株枯死(汪克强等2010; 米宏彬等
2007)。而‘海沃德’猕猴桃童期较长, 结果较晚, 传
统育苗方法难以克服生产规模与市场需求的矛
盾。应用现代生物技术, 通过组织培养可实现‘海
沃德’猕猴桃的快速繁殖, 在此基础上通过抗病基
因的遗传转化能克服其栽培中的病害问题。
有关猕猴桃离体再生的研究早有报道(桂耀
林1979; 洪树荣1981; 肖尊安等1992; 丁士林等
1997)。近些年来, 樊军锋等(2002)以‘秦美’猕猴桃
植物生理学报760
叶片为外植体, 建立了再生体系。尚霄丽等(2010)
以‘中华’猕猴桃叶片为外植体, 不定芽分化率达
87.5%。但‘海沃德’猕猴桃的离体再生鲜有报道。
张海平等(2011)以其茎尖为外植体, 经愈伤组织出
芽建立了快繁体系。王顺才等(2004)研究了细胞
分裂素和生长素对其叶片再生的影响, 但分化频
率较低, 且所用部分试剂(ZT、TDZ等)价格昂贵,
不利于工厂化繁殖。本试验以‘海沃德’猕猴桃无
菌苗的叶片为外植体, 采用一步出芽法通过不定
芽诱导、增殖和生根成功建立了离体快繁体系,
缩短了再生时间, 避免了愈伤组织形成过程中可
能发生的无性系变异, 为加快‘海沃德’猕猴桃的推
广应用和遗传转化奠定了良好基础。
材料与方法
1 试验材料
试验材料为‘海沃德’猕猴桃[Actinidia deliciosa
(A. Chev.) C. F. Liang et A. R. Ferguson]组培苗来自
本校生命科学学院植物生理实验室, 叶龄30 d左
右; 外植体为长势良好的叶片。
2 试验方法
2.1 不定芽的诱导
无菌条件下, 叶片去叶缘和叶尖, 切割成大小为
0.5 cm×0.5 cm的叶盘, 接种在含6-BA和NAA的不
定芽诱导培养基(表1)中, 暗培养30 d后转入光照培养,
再培养10 d (共40 d)后统计不定芽诱导率和不定芽
数量。每个培养基接种14个外植体(7个·瓶-1), 重复3
次。出芽率=出芽外植体数/接种外植体数× 100%。
2.2 不定芽增殖
分离、切割丛芽, 将生长状况基本一致、大小
相同(长1 cm)的单个不定芽接种到含6-BA和NAA
的增殖培养基上, 培养30 d后统计不定芽增殖率、
增殖系数(增殖后不定芽总数/接种不定芽数)。
2.3 不定芽生根
切取生长健壮、大小相同(长2 cm)的单个不
定芽接种在含IBA或NAA的1/2MS固体培养基中,
培养30 d后统计生根率、不定根长度和数量。生
根率=生根不定芽数/接种不定芽数×100%。
2.4 炼苗与移栽
将根系发达和生长良好的试管苗(高2 cm以
上)培养瓶移出培养室, 在室内放置3 d后逐渐打开
瓶盖, 炼苗5 d; 从瓶中取出试管苗, 洗净根系后移
栽到盛田园土、河沙(体积比3:1)的营养砵中, 前10
d每天喷MS营养液3~4次, 之后每天浇适量自来水,
30 d后统计移栽成活率。
3 基本培养基和培养条件
所用基本培养基为MS, 含蔗糖30 g·L-1, 琼脂7
g·L-1, pH 5.8。不定芽诱导阶段为暗培养, 其余阶
段均为光照培养。光照强度20~40 µmol·m-2·s-1 (12
h·d-1), 培养温度(25±2) ℃。
实验结果
1 ‘海沃德’猕猴桃不定芽的诱导
叶片接种后, 暗培养7 d左右, 叶片开始膨大
(切口和叶脉处明显膨大); 15 d左右出现芽点(图
1-A); 30 d后, 芽点发育成明显小芽, 呈浅绿色(图
表1 6-BA和NAA浓度组合对‘海沃德’猕猴桃叶片不定芽分化的影响
Table 1 Effects of 6-BA and NAA on adventitious buds regeneration from leaves of ‘Hayward’ kiwifruit
培养基编号 6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 接种外植体数/个 再生芽外植体数/个 出芽率/%
B1 1.0 0.10 42 12 28.57±1.62
cd
B2 2.0 0.10 42 6 14.28±3.23
d
B3 2.0 0.20 42 20 47.62±2.35
bc
B4 3.0 0.10 42 34 80.95±0.75
a
B5 3.0 0.15 42 28 66.67±2.47
ab
B6 3.0 0.20 42 31 73.80±1.17
ab
B7 4.0 0.10 42 20 47.61±2.23
bc
B8 4.0 0.20 42 21 50.00±3.77
bc
B9 5.0 0.10 42 10 23.81±1.63
cd
B10 5.0 0.20 42 32 76.19±1.73
a
B11 6.0 0.20 42 13 30.95±1.87
cd
不同小写字母表示不同培养基之间差异显著(P≤0.05)。下表同此。
吴秀华等: ‘海沃德’猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立 761
1-B)。转入光照培养后, 逐渐变成深绿色(图1-C);
40 d后, 最高出芽率达80.95% (表1), 不定芽长度达
2~5 cm。
由表1可知, 培养基中6-BA浓度对不定芽再生
有显著影响。6-BA浓度低于5 mg·L-1、6-BA/NAA
浓度比为2.5: 1~3: 1时, 出芽效果最佳; 6-BA浓度
超过5 mg·L-1时, 不定芽分化率降低。结果表明, 培
养基B4不定芽分化率最高(80.95%), 不定芽数量较
多, 茎、叶明显, 长势最好; 培养基B10出芽率次之, 不
定芽数量较多, 长势较好。培养基B4和B10的出芽
率与其它多数培养基差异显著, B4与B10差异不显
著(P＞0.05); B2出芽率最低, 再生效果最差。 因此,
‘海沃德’猕猴桃叶片不定芽再生的最佳培养基为
B4培养基, 即MS+3.0 mg·L
-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA。
2 ‘海沃德’猕猴桃不定芽的增殖
不定芽的继代结果(表2)表明, 培养基P7增殖
效果最好, 不仅增殖率达100%, 而且1~3代平均繁
殖系数最高(6.38), 与其它培养基差异显著。同时,
其不定芽生长状态最好, 苗高普遍在2.5 cm以上
(图1-D)。培养基P8次之, P4最差。因此, ‘海沃德’
猕猴桃不定芽增殖的最佳培养基为培养基P7, 即
MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA+0.1 mg·L-1
GA3。试验中发现, 培养基中的GA3能明显促进不
定芽的伸长生长, 有利于之后不定芽生根。
图1 ‘海沃德’猕猴桃叶片的植株再生
Fig.1 Plant regeneration from leaf of ‘Hayward’ kiwifruit
A: 培养15 d后脱分化的叶片; B: 叶片培养30 d后分化的不定芽; C: 光照培养10 d的不定芽; D: 由单个不定芽增殖形成的丛芽; E: 生根
后的不定芽; F: 移栽30 d后存活的试管苗。
表2 6-BA、NAA和GA3浓度组合对‘海沃德’猕猴桃不定芽增殖的影响
Table 2 Effects of 6-BA, NAA and GA3 on adventitious buds proliferation of ‘Hayward’ kiwifruit
培养基编号
6-BA浓度/ NAA浓度/ GA3浓度/
增殖率/%
繁殖系数/倍
平均繁殖系数
mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 第1代 第2代 第3代
P1 1 0.4 0.1 100 8.00±0.16
ab 5.08±0.18b 4.58±0.07a 5.88±0.87b
P2 2 0.4 0.1 100 7.67±0.31
bc 4.58±0.14c 3.58±0.07bc 5.28±1.00bc
P3 3 0.4 0.1 100 7.22±0.18
bc 4.92±0.07bc 3.00±0.40c 5.05±0.99c
P4 4 0.4 0.1 100 5.44±0.18
d 5.17±0.14b 4.00±0.12ab 4.87±0.36c
P5 1 0.2 0.1 100 5.78±0.40
d 6.00±0.12a 3.83±0.07c 5.20±0.74bc
P6 2 0.2 0.1 100 6.33±0.16
cd 6.00±0.12a 3.17±0.18c 5.17±0.82bc
P7 3 0.2 0.1 100 8.89±0.36
a 5.83±0.07a 4.42±0.07a 6.38±1.07a
P8 4 0.2 0.1 100 8.33±0.15
ab 5.08±0.07ab 4.42±0.30a 5.94±0.98b
植物生理学报762
3 ‘海沃德’猕猴桃不定芽的生根
不定芽在生根培养基中10 d后开始发生不定
根, 之后根迅速伸长, 30 d形成良好根系(图1-E)。
培养30 d结果(表3)表明, 生长素类调节剂对‘海沃
德’猕猴桃不定芽的生根有促进作用。在不添加
NAA、IBA的1/2MS基本培养基(R0)中, 不定芽的
生根效果较差; 添加NAA或IBA之后, 除根长外, 不
定芽的生根率、生根数和株高均有不同程度提高,
但NAA和IBA对不定芽生根的影响存在差异。
浓度相同时, IBA比NAA效果更好。在含IBA
的培养基中, 不定芽生根率较高, 根较粗长; 在含
NAA的培养基中, 生根率较低, 根较细短, 不利于
成苗。同时, IBA和NAA对不定芽生根的适宜浓度
不同。IBA含量低于0.8 mg·L-1时, 随IBA浓度的增
加, 生根率逐渐增加, 至0.7 mg·L-1时生根率最高
(100%); 超过0.7 mg·L-1时, 生根率下降。NAA含量
为0.4 mg·L-1时, 生根率最高(84.44%); 超过0.4
mg·L-1生根率下降。可见, IBA和NAA对不定芽生
根的适宜浓度分别为0.7和0.4 mg·L-1。从生根率、
生根数、根长和株高等指标来看, 采用0.7 mg·L-1
IBA生根效果更好。因此, ‘海沃德’猕猴桃不定芽
生根的最佳培养基为培养基R9, 即1/2MS+ 0.7
mg·L-1 IBA。其30 d生根率达100%, 且不定根数量
较多、较粗较长, 试管苗生长健壮。
4 ‘海沃德’猕猴桃试管苗的炼苗与移栽
将完成生根的试管苗经室内炼苗后洗净根部
培养基, 移植到营养钵中, 进行如前常规管理。共
移栽105株, 30 d后存活97株, 存活率达92.38%, 且
生长正常(图1-F)。
表3 NAA和IBA对‘海沃德’猕猴桃不定芽生根的影响
Table 3 Effects of NAA and IBA on adventitious buds rooting of ‘Hayward’ kiwifruit
培养基编号 NAA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 接种芽数/个 生根芽数/个 生根率/% 生根数/条 根长/cm 株高/cm
R0 0 0 45 30±0.47
d 66.67±0.02c 2.21±0.10f 1.98±0.05a 3.00±0.06a
R1 0 0.4 45 43±0.27
a 95.56±0.02a 5.31±0.09e 1.57±0.03abc 3.16±0.07a
R2 0 0.6 45 43±0.27
a 95.56±0.02a 5.82±0.07bc 1.30±0.03c 3.06±0.02a
R3 0 0.8 45 44±0.72
bc 97.78±0.05ab 5.42±0.05cde 1.63±0.03abc 3.03±0.15a
R4 0 1.0 45 42±0.47
bc 93.33±0.03a 5.77±0.08bcd 1.47±0.11abc 3.05±0.26a
R5 0.4 0 45 38±0.27
bcd 84.44±0.02abc 6.30±0.03a 1.42±0.06c 3.06±0.36a
R6 0.6 0 45 33±0
cd 73.33±0bc 6.24±0.05a 1.38±0.17c 2.80±0.33a
R7 0.8 0 45 36±0.82
bcd 80.00±0.05abc 6.44±0.04a 1.22±0.14c 3.15±0.09a
R8 1.0 0 45 36±0.82
bcd 80.00±0.05abc 5.36±0.09de 1.44±0.07bc 2.81±0.21a
R9 0 0.7 45 45±0
a 100.00±0.02a 6.32±0.05a 1.97±0.03ab 3.09±0.05a
R10 0.7 0 45 37±0.27
bcd 82.22±0.02abc 6.14±0.05ab 1.33±0.07c 2.94±0.02a
讨 论
植物组织培养作为一种利用植物细胞全能性
实现植物离体再生的手段, 目前已在植物的无性
繁殖中广泛应用。猕猴桃雌雄异株, 其中约70%是
雄株, 常规育种中筛选出来的优良单株因实生苗
易发生高度分离而不宜采用种子繁殖。
植物组织培养是一种较理想的快速繁殖方法
(尚霄丽等2010), 培养基中的植物生长调节剂是决
定植物离体再生效率的最大影响因子 (洪树荣
1981)。本试验主要采用6-BA和NAA两种生长调
节剂, 建立了‘海沃德’猕猴桃叶片离体直接再生体
系, 不仅越过愈伤组织阶段, 降低了培养物在离体
培养过程中发生遗传变异的可能性, 而且大大缩
短了外植体的出芽时间, 其出芽率达80.95%, 高于
张海平等(2011)在‘海沃德’茎尖愈伤组织再分化中
的出芽率(72%), 明显高于‘大籽’猕猴桃愈伤组织
16.7%的出芽率(姜维梅和李凤玉2003)。本试验使
用价格较低的细胞分裂素中的6-BA, 而未用价格
较高的ZT和TDZ等, 可大大节约培养成本, 使‘海
沃德’猕猴桃的试管苗工厂化生产成为可能。
细胞分裂素(6-BA等)与生长素(NAA等)配合
使用, 比例协调时可促进芽苗主茎伸长生长(姜维
梅和李凤玉2003), 适宜浓度的GA3能显著促进茎
叶生长。本试验在不定芽继代增殖过程中, 配比
使用6-BA、NAA和GA3三种植物生长调节剂, 促
进了不定芽的伸长生长, 提高了品质, 1~3代平均
繁殖系数达6.38, 明显高于张海平等(2011)在‘海沃
德’中获得的1代繁殖系数(3.31), 与刘长春等(2007)
吴秀华等: ‘海沃德’猕猴桃叶片高频直接再生体系的建立 763
在‘金富’猕猴桃中获得的仅1代的繁殖系数(6.5)基
本一致。在组培快繁生产中, 扩繁系数一般维持
在3~4左右, 有利于多次继代增殖。繁殖系数过高,
会引起组培苗弱化 , 生长势变差。在本试验中 ,
1~3代平均繁殖系数达6.38, 组培苗生长仍较旺盛,
继续继代繁殖生长势可能会变差。一般可通过降
低细胞分裂素浓度降低高代次繁殖系数, 而维持
较高的平均繁殖系数和较好的试管苗长势, 有关
问题需进一步深入研究。
在组培过程中, 不定根的生根率等直接影响
到组培苗的移栽存活率。王大平和杨玲(2008)研
究发现, 对猕猴桃组培苗生根来说, 1/2MS优于
1/4MS和MS基本培养基。因此本试验以1/2MS为
基本培养基, 并添加不同浓度的IBA和NAA诱导不
定芽生根。结果表明, 适宜浓度的IBA和NAA对
‘海沃德’不定芽生根都有一定的促进作用, IBA的
效果更好。添加0.7 mg·L-1 IBA时, 不定芽生根率达
100%, 证明IBA能有效诱导猕猴桃试管苗生根(丁
士林等1997), 且生根率高于刘长春等(2007)在 ‘金
富’猕猴桃离体培养中所得95.3%的生根率。本试
验成功建立了‘海沃德’猕猴桃叶片不定芽分化和
植株再生体系, 达到快速繁育种苗的生产目的, 也
为海沃德猕猴桃的遗传转化和基因工程育种打
下了基础。
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