全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (10): 1601~1607　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0269 1601
收稿 2014-06-19　　修定 2014-09-25
资助 教育部新世纪优秀人才项目(NECT-10-0693)和现代农业
产业技术体系(ARS-13)。
* 通讯作者(E-mail: yu1009@nwsuaf.edu.cn)。
甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S花蕾总蛋白质双向电泳体系的建立及应用
张菁雯, 李晓荣, 赵燕妮, 胡玉梅, 徐献锋, 于澄宇*
西北农林科技大学农学院, 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌712100
摘要: 以甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S及其近等基因系SP2F为材料, 分别采用TCA/丙酮法和Tris-丙酮-酚法提取花蕾总蛋
白, 并优化电泳体系, 对可育和不育花蕾中的蛋白质表达进行差异分析。结果表明: TCA/丙酮法适合于花蕾总蛋白的提取,
采用10%浓度的分离胶, 上样量为450 μg, 用pH 4~7的17 cm线性胶条和改良的考马斯亮蓝染色法得到了背景清晰、蛋白点
分布均匀且重复性好的电泳凝胶图谱。利用这一实验体系, 筛选出SP2S和SP2F之间大量的差异蛋白点。相比SP2F, 仅在
SP2S中表达的有13个点, 上调2倍以上的点有4个, 下调2倍以上的点有9个。
关键词: 甘蓝型油菜; 温敏核不育; 花蕾; 双向电泳; 蛋白质
Establishment and Application of Two-Dimensional Electrophoresis System
for Floral Bud Proteome of Temperature-Sensitive Male Sterile Line SP2S in
Brassica napus
ZHANG Jing-Wen, LI Xiao-Rong, ZHAO Yan-Ni, HU Yu-Mei, XU Xian-Feng, YU Cheng-Yu*
College of Agronomy, State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Northwest Agriculture and Forestry University,
Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract: Using TCA/acetone and Tris-acetone-phenol methods to extract total proteins from floral buds
respectively, an optimized system of two-dimensional electrophoresis (2-DE) was employed to screen differen-
tial protein expression between a temperature-sensitive male sterile line SP2S and its near isogenic line SP2F in
Brassica napus. The results showed that clear background, well distributed protein spots and reproducible 2-DE
maps could be acquired following TCA/acetone extraction, electrophoresis system including 10% SDS-PAGE,
450 μg of sample loading quantity, and 17 cm immobilized pH gradient (IPG) strip with pH 4–7, and modified
staining using Coomassie Brilliant Blue. Using this optimized 2-DE system some differential protein spots
between SP2S and SP2F were found. Compared with SP2F, 13 spots were specifically expressed in SP2S, 4 of
them were up-regulated more than 2-fold and 9 were down-regulated more than 2-fold.
Key words: Brassica napus; temperature-sensitive male sterility; floral bud; two-dimensional electrophoresis; protein
随着现代分子生物学及基因组学的发展, 拟
南芥、白菜、甘蓝、油菜等多种植物的基因组测
序已完成, 植物育种技术从传统育种逐渐转向分
子育种, 但多数生理现象的分子机制仍然悬而未
决。从DNA和RNA着手的基因芯片、基因表达序
列分析、高通量测序等方法所获得的信息有限,
无法解释蛋白质翻译修饰、亚细胞定位或迁移、
蛋白质-蛋白质间的相互作用等。要想更深入剖析
生理现象 , 蛋白质组具有不可替代性 (何华勤
2011)。目前, 蛋白质组学在植物科学研究中的应
用主要有: 植物发育不同时期蛋白质的差异、胁
迫应答的蛋白质组学研究 (皇甫海燕和官春云
2010; 余永芳等2011)和突变体研究(李春宏等
2012)等。
甘蓝型油菜温敏细胞核不育系SP2S是我们课
题组从一份欧洲油菜资源后代中发现并选育而来,
在杨凌春季表现为低温可育, 高于临界温度时彻
底败育, 遗传分析表明不育性状受2~3对隐性核基
因控制。雄性不育是作物杂种优势利用的主要途
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报1602
径之一, 其中光、温敏雄性不育由于具有简化的
制种体系和更大的杂种优势潜力成为继细胞质不
育、细胞核不育、化学杀雄之后又一重要的油菜
杂种优势利用途径(于澄宇2011)。郭英芬等(2012)
通过对SP2S的细胞学观察, 发现其败育时期和机
制不同于现有报道的油菜不育系。本试验对比2
种花蕾蛋白质提取方法的效果并对电泳条件进行
优化, 对可育与不育花蕾全蛋白经过3次重复试验,
筛选蛋白质差异点。通过对温敏核不育系SP2S和
可育近等基因系进行蛋白质组学分析, 进一步了
解温敏核不育SP2S受环境因子调控的机制。
材料与方法
1 植物材料
供试材料为大田种植的甘蓝型油菜(Brassica
napus L.)温敏核不育系SP2S及其近等基因系SP2F,
待气温升高、油菜转变为不育后取样, 置于0 ℃冰
盒带回, 保存于−80 ℃冰箱。
2 蛋白质提取方法
2.1 TCA/丙酮法
参照Damerval等(1986)的TCA/丙酮沉淀法,
并略有改动。取−80 ℃冰箱保存的花蕾, 加入液氮
充分研磨, 所得粉末转入2.0 mL的离心管中, 加入
1.5 mL经−20 ℃预冷、含10% TCA和0.07%二硫苏
糖醇(DTT)的丙酮溶液, 混匀后于−20 ℃沉淀1 h;
4 ℃下13 188×g离心30 min, 弃上清; 沉淀悬浮于1.5
mL −20 ℃预冷的含0.07% DTT的丙酮溶液, −20 ℃
沉淀1 h; 4 ℃下13 188×g离心30 min, 弃上清; 重复
上步骤3~4次, 至蛋白为乳白色; 室温下干燥, 备用。
2.2 Tris-丙酮-酚法
参考Wang等(2006)的方法, 略有改动。取−80 ℃
冰箱保存的花蕾, 加入液氮充分研磨, 所得粉末转
入2.0 mL的离心管中, 加入1.5 mL经−20 ℃预冷、
含10% TCA的丙酮, −20 ℃静置1 h; 4 ℃下13 188×g
离心20 min, 弃上清; 所得沉淀用经−20 ℃预冷、
含0.1 mol·L-1乙酸铵的80%甲醇及80%丙酮各洗涤
1次, 4 ℃下13 188×g离心20 min, 弃上清, 沉淀于室
温干燥或50 ℃水浴去除残余丙酮; 加0.8 mL Tris-
饱和酚重新悬浮, 再加0.8 mL SDS缓冲液(含30%
蔗糖、2% SDS、0.1 mol·L-1 pH 8.0的Tris-HCl、
5% β-巯基乙醇)涡旋振荡 , 放置5 min, 4 ℃下
13 188×g离心20 min; 移取0.2~0.4 mL上层酚相至
新的离心管, 加满0.1 mol·L-1预冷的乙酸铵/甲醇溶
液, −20 ℃静置1 h以上, 4 ℃下13 188×g离心20 min;
所得沉淀用预冷的100%甲醇和80%丙酮各洗涤
1次, 室温下干燥、备用。
3 蛋白质定量
每mg蛋白干粉中加入25 μL蛋白裂解液, 蛋白
裂解液含7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% 3-[3-
(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、65
mmol·L-1 DTT、0.5%两性电解质、1 mmol·L-1苯
甲基磺酰氟 (PMSF) , 室温放置1 h后 , 4 ℃下
13 188×g离心30 min以上, 至没有沉淀出现为止, 取
上清液, 用上海生物工程股份有限公司的非干扰
型蛋白质浓度测定试剂盒SK3071测浓度, 按操作
说明书进行, 定量后分装于1.5 mL离心管中, −80 ℃
保存备用。
4 双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)
等电聚焦采用Bio-Rad公司的17 cm线性IPG
(immobilized pH gradient)胶条(pH 3~10, pH 4~7),
将一定体积的蛋白质样品与水化上样缓冲液(含7
mol·L-1尿素、2 mol·L -1硫脲、4% CHAPS、65
mmol·L-1 DTT、0.5%两性电解质、0.001%溴酚蓝)
共350 μL充分混匀, 加入等电聚焦盘, 按Bio-Rad的
蛋白质组2-DE操作手册的步骤进行, 并对等电聚
焦程序有所修改(表1)。第二向SDS-PAGE电泳结
束后, 采用改良的考马斯亮蓝染色法——Blue Sil-
ver法(Candiano等2004)进行染色。
5 凝胶图像分析
用PowerLook 2100XL扫描仪扫描凝胶图像,
分辨率为300 dpi, 全彩。用Bio-Rad的PDQuest
7.4.0软件分析凝胶图像。
表1 等电聚焦电泳程序
Table 1 Procedures of isoelectric focusing electrophoresis
程序 电压/V 速度 时间/h
水化 50 主动水化 15
第一步 250 线性 1
第二步 500 线性 1
第三步 1 000 快速 1
第四步 8 500 线性 5
第五步 8 500 快速 9.41
第六步 500 快速 任意时间
张菁雯等: 甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S花蕾总蛋白质双向电泳体系的建立及应用 1603
实验结果
1 不同分离胶浓度的选择
采用12%和10%浓度的分离胶观察胶浓度对
蛋白质分离效果的影响, 结果表明在12%的分离
胶中大于45 kDa、染色较深的高丰度蛋白及其附
近条带未能很好分离 , 整体来看条带较为密集;
而在10%的分离胶中, 蛋白条带清晰且分布均匀
(图1)。因此, 在后续的2-DE中均采用10%的分
离胶。
2 等电聚焦胶条的选择
将TCA/丙酮法提取的SP2F花蕾蛋白用17 cm
pH 3~10的线性胶条进行2-DE, 蛋白主要集中在中
性偏酸的区域, 并且不能很好分离(图2-B)。改用
pH 4~7的线性胶条后, 虽然碱性端的纵条纹仍显
示有未分离的蛋白质, 但总体分辨率明显提高, 大
多数蛋白质得到分离(图2-A)。
3 两种提取方法的比较
将两种方法提取的SP2F花蕾蛋白用pH 4~7的
线性胶条进行2-DE, 当上样量相同时, Tris-丙酮-酚
法提取的蛋白点数明显较TCA/丙酮法的少, 酸性
蛋白和低分子量蛋白均有较多的损失, 共检测到
637个左右的蛋白点, TCA/丙酮法可检测到777个
左右的蛋白点(图3)。因此, TCA/丙酮法可能更适
合于油菜花蕾总蛋白的提取。
4 不同上样量对2-DE图谱的影响
由图4-A可见, 上样量为600 μg时, 2-DE图谱
背景模糊, 过高的上样量使高丰度蛋白附近的点
模糊不清, 密集在一起, 且上样量过高, 可检测到
的蛋白点数反而变少(表2)。当上样量为500 μg时,
高丰度蛋白对其附近的蛋白依然有覆盖, 并且个
别点有拖尾(图4-B)。经PDQuest软件分析和肉眼
观察, 上样量为450和400 μg时可检测到的蛋白点
数相近(图4-C和D), 均高于500 μg的上样量(表2)。
由于上样量为450 μg时蛋白点更圆, 条纹较少, 故
后续2-DE均以此为上样量。
5 SP2S和SP2F花蕾蛋白质的电泳图谱比较
分别对SP2S和SP2F进行3次重复试验, 用PD-
Quest 7.4.0软件对2-DE图像进行剪切、斑点检测
和匹配, 对图像标准化后建立重复组进行数据分
析, SP2S可检测到662个蛋白点, SP2F可检测到777
图2 不同pH范围胶条的2-DE图
Fig.2 2-DE maps of different immobilized pH gradient gels
A: pH 4~7; B: pH 3~10。
图1 不同浓度SDS-PAGE的蛋白质分离效果
Fig.1 Protein separation effect of different
concentrations of SDS-PAGE
A: 12%分离胶; B: 10%分离胶。
植物生理学报1604
个蛋白点; 与对照SP2F相比, SP2S中具有99%统计
学显著差异且符合上调2倍以上的点有4个, 下调2
倍以上的点有9个, 仅在SP2S中表达的有13个点
(图5和6)。
图3 不同提取方法的2-DE图
Fig.3 2-DE maps of different extraction methods
A: Tris-丙酮-酚法; B: TCA/丙酮法。
图4 不同上样量的蛋白质2-DE图谱
Fig.4 2-DE maps of different protein sample loading quantity
A: 上样量为600 μg; B: 上样量为500 μg; C: 上样量为450 μg; D: 上样量为400 μg。
张菁雯等: 甘蓝型油菜温敏核不育系SP2S花蕾总蛋白质双向电泳体系的建立及应用 1605
讨　　论
1 蛋白提取方法的选择
蛋白样品的制备是整个蛋白质组学研究的第
一步, 也是最重要的一步, 样品制备的好坏直接关
系到2-DE图谱的呈现以及后续的鉴定分析。目前
已报道的关于油菜蛋白的提取方法有TCA/丙酮法
(刘海衡等2009; 甘露等2010)、Tris-HCl法(舒佳宾
表2 不同上样量的蛋白质点数
Table 2 The number of protein spots of different
sample loading quantity
上样量/μg 蛋白质点数/个
400 1 048
450 1 088
500 920
600 883
图6 差异蛋白点的量化柱状图
Fig.6 Quantization histogram of differential protein spots
A: 下调; B: 上调。SSP后的数字为SSP (standard spot)编号; 每个小图中左面柱形为SP2F, 右面为SP2S。
等2012)、改进的PEG分级法(孔芳等2010)、酚提
法及酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法(王振华等2011)。
Wang等(2006)认为, 酚提法有助于顽固组织的蛋
白提取, 但是酚法提取的步骤较多, 需多次转移,
因此蛋白总产量较低; 这与王振华等(2011)得出的
结论一致。本研究比较了Tris-丙酮-酚法和TCA/
丙酮法, 发现TCA/丙酮法是一种相对简单的方法,
步骤少, 能提取到更多的蛋白, 并且图谱清晰, 因
图5 SP2F (A)和SP2S (B)的蛋白点差异图谱
Fig.5 Differential protein spots of SP2F (A) and SP2S (B)
图中箭头旁数字为SSP (standard spot)编号。
植物生理学报1606
此更适合甘蓝型油菜花蕾总蛋白的提取。另外,
丙酮在沉淀蛋白的同时可起到纯化作用, 因此等
电聚焦过程中不需要除盐, 还可除去植物中的多
糖、脂类、色素、酚类等次生代谢物 , 有利于
2-DE。TCA/丙酮法的缺点是不能很好解决油菜花
蕾中含有的少量高丰度蛋白Rubisco的影响, 这也
是进行光合作用的绿色植物在2-DE中影响电泳图
谱的一个主要问题, 在今后的试验中可借鉴其他
植物去除Rubisco的提取方法(Xi等2006; 钟俐等
2012)来加以解决。
2 电泳条件的优化
不同的植物、不同的组织在2-DE中对分离胶
的选择也不同, 本试验先比较了分离胶为10%和
12%的单向SDS-PAGE, 在10%的分离胶中, 分子量
在45.0~66.2 kDa的高丰度蛋白大亚基附近的蛋白
质条带能很好分离, 在后续的2-DE中采用10%浓
度的分离胶均得到蛋白点清晰且分布均匀的图谱。
pH梯度胶条的选择影响差异蛋白的分离效
果。采用pH 3~10的线性胶条对油菜总蛋白的分
离效果不理想, 从pH 3~10的2-DE图谱来看, 蛋白
主要集中在pH 4~8的区域, 王道杰等(2008)用pH
5~8的胶条对单显性细胞核雄性不育油菜花蕾中
的蛋白进行电泳, 得到了一些差异蛋白点, 但是用
pH 5~8的胶条又会损失pH 4~5的蛋白, 因此, 本试
验选用pH 4~7的线性胶条, 蛋白得到很好的分离,
分辨率大大提高, 并且SP2S与SP2F之间有明显的
差异点。
上样量影响2-DE图谱的质量, 上样过多使得
高丰度蛋白遮蔽周围的低丰度蛋白, 过少又会使
一些蛋白丢失, 影响结果分析, 因此蛋白的准确定
量也很重要。我们对上样量进行梯度试验, 并结
合软件与人工观察, 发现450 μg为甘蓝型油菜花蕾
的最佳上样量。另外, 蛋白裂解液中含有高浓度
的尿素等物质, 李海玲等(2008)研究发现常用的
Bradford法受甘油、去污剂和尿素等的影响。本
试验采用上海生工的非干扰型蛋白定量试剂盒
SK3071, 在测浓度前对蛋白裂解液中影响蛋白浓
度测定的两性去污剂、还原试剂、两性电解质、
尿素等进行沉淀, 有效避免了干扰物质对蛋白定
量的影响。并且经改良的Blue Silver法(Candiano
等2004)将染色液中的考马斯亮蓝G-250的浓度从
传统的0.1%升至0.12%, 磷酸浓度从2%升至10%,
灵敏度提高, 接近传统的银染法。
3 SP2S和SP2F花蕾中差异蛋白质分析
本文用经过优化的2-DE对SP2S和SP2F花蕾
中的差异蛋白质进行分析, 发现差异点在低分子
量和高分子量都有分布, 并且集中在高丰度蛋白
附近, 而低丰度蛋白往往是调节因子、信号接受
分子等一些重要的蛋白质, 可见最优的提取方法
与适当的上样量对于2-DE的分析是非常重要的。
许志勇(2012)对甘蓝型油菜S45AB隐性细胞核雄
性不育差异蛋白进行质谱分析, 鉴定出的蛋白涉
及碳和能量代谢、氨基酸代谢、次级代谢、脂肪
酸代谢、RNA binding蛋白、蛋白质合成、蛋白质
降解、蛋白质折叠、氧化还原酶、细胞壁相关蛋
白、胁迫响应等, 从蛋白质的功能来预测与不育
相关的蛋白, 进而寻找与不育有关的分子机制。
本研究通过软件分析, 一共找到26个差异点, 对于
差异点的质谱鉴定分析将在后续的试验中进行, 以
寻找调控甘蓝型油菜温敏不育SP2S的关键分子。
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