全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (4): 488~494　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0478488
收稿 2014-11-13　　修定 2015-03-30
资助 山东省泰安市科技局项目(2011-2013)、山东省东营市科
技局项目(2009-2011)、山东省泰安市大学生科技引领创
新计划项目(2008D2010及2009D1009)。
* 通讯作者(E-mail: jhli@sdau.edu.cn; Tel: 18615226737)。
欧石楠体细胞胚再生过程中遗传稳定性的RAPD和ISSR分析
王锦楠, 李际红*, 亓晓, 姚培娟, 许东
山东农业大学林学院, 农业生态与环境重点实验室, 山东泰安271018
摘要: 利用RAPD和ISSR分子标记, 研究了欧石楠体细胞胚再生过程中4个不同发育时期的遗传稳定性, 结果表明, 2种分子
标记方法均能揭示材料间较高的遗传稳定性。从190对引物组合中筛选出9对适宜的RAPD扩增引物, 共扩增获得158条带,
平均每对引物可扩增出17.56条带, 其中多态性条带13条, 比例为8.23%; 材料间遗传相似系数的变化幅度为0.8403~0.9625,
平均值为0.8979。从45对引物组合中筛选出8对适宜的ISSR扩增引物, 共扩增获得143条带, 平均每对引物可扩增出17.875
条带, 其中多态性条带15条, 比例为10.48%, 材料间遗传相似系数变化范围为0.8154~0.9032, 平均值为0.8618。聚类分析结
果表明, 2种分子标记均能将供试材料分开, 且具有一定的相似性, 但也存在差异。
关键词: 欧石楠; 体细胞胚再生; RAPD; ISSR; 遗传稳定性
Genetic Stability Analysis in Somatic Embryo Regeneration of Erica carnea by
RAPD and ISSR Markers
WANG Jin-Nan, LI Ji-Hong*, QI Xiao, YAO Pei-Juan, XU Dong
Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment, College of Forestry, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shan-
dong 271018, China
Abstract: Genetic diversity in Erica carnea field seedlings, embryogenic calli, adventitious buds and regener-
ated seedlings was analyzed by random amplified polymorphic DNA (RAPD) and inter simple sequence repeat
(ISSR) makers. The results showed that there was a high level of genetic stability. In RAPD analysis, 9 primers
screened from 190 RAPD primers were polymorphic. A total of 158 bands were observed in 9 primers with an
average of 17.56 bands, among which 13 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic bands
(PPB) was 8.23%. The RAPD-based genetic similarity (RAPD-GS) among the material ranged from 0.8403 to
0.9625 with an average of 0.8979. In ISSR analysis, 8 primers screened from 45 RAPD primers were polymor-
phic. A total of 143 bands were detected in 8 primers, with an average of 17.875, among which 15 bands were
polymorphic and PPB was 10.48%. The ISSR-derived genetic similarity (ISSR-GS) ranged from 0.8154 to
0.9032 with an average of 0.8618. The cluster analysis indicated that the tested materials could be distinguished
by both RAPD and ISSR markers.
Key words: Erica carnea; somatic embryo regeneration; RAPD; ISSR; genetic stability
欧石楠为2006年我们项目组从华野园艺引进
的适合我国北方广大地区栽植的欧洲常绿开花植
物, 为了迅速推广应用, 我们已建立了欧石楠体细
胞胚发生和植株再生体系(李际红等2012)。大量
的研究表明, 体细胞胚繁育是遗传稳定性相对较
高的一种再生方式, 熊丹等(2008)利用随机扩增多
态性DNA (random amplified polymorphic DNA,
RAPD)技术对香果树(Emmenopterys henryi)体细胞
胚繁殖中的胚性愈伤组织和再生植株之间的遗传
稳定性进行研究, 发现两者之间的多态性条带比
例(percentage of polymorphic bands, PPB)变异较低
(为3.0%), 遗传稳定性较高。然而Rani和Raina
(2000)、冯霞等(2006)和Tripathi等(2006)的研究显
示, 植物体细胞胚再生过程中也存在着一定的变
异, 因此探讨欧石楠体细胞胚再生过程中的遗传
稳定性具有重要的意义。RAPD和简单重复序列
间多态性(inter-simple sequence repeat, ISSR)技术
均可在DNA水平上检测和分析物种的遗传多样性
及遗传变异(Milbourne等1997; Zietkiewiez等
王锦楠等: 欧石楠体细胞胚再生过程中遗传稳定性的RAPD和ISSR分析 489
1994)。何斌等(2012)和林秀莲等(2013)利用RAPD
分子标记技术分别对小蔓长春花(Vinca minor)和
龙眼(Dimocarpus longan)体细胞胚再生过程中愈
伤组织和再生植株遗传稳定性的研究表明, 两者
之间的PPB变异较低(为5.2%和2.08%), 遗传稳定
性较高。利用ISSR分子标记, 金万梅等(2009)对葡
萄(Vitis vinifera)器官再生过程中不定芽和再生植
株之间的遗传稳定性研究表明, 两者之间的PPB仅
为3%, 陈龙(2013)对百合(Lilium brownii var. viridu-
lum)鳞茎薄层胚性愈伤组织诱导再生过程中的胚
性愈伤组织和再生植株之间的遗传稳定性研究显
示, 两者之间PPB变异为0, 稳定遗传。以上研究无
论是采用RAPD标记还是ISSR标记均是对体细胞
胚再生过程中某两个时期之间的遗传稳定性进行
分析, 对于体细胞胚繁育过程中各个时期的遗传
稳定性分析尚未见报道, 因此, 探讨欧石楠体细胞
胚再生不同发育时期的遗传稳定性, 为良种引进
和推广提供理论指导具有重要的意义。
本试验在已有成熟的欧石楠体细胞胚再生体
系的基础上, 利用RAPD和ISSR分子标记技术, 以
我们实验室已有的欧石楠外植体、胚性愈伤组
织、胚性愈伤组织诱导的不定芽和移栽苗为试验
材料, 对其之间的遗传稳定性进行分析, 明确欧石
楠体细胞胚再生不同发育时期的变异幅度和遗传
相似系数, 以期从DNA水平上揭示欧石楠体细胞
胚的遗传稳定性, 为体细胞胚繁育技术在欧石楠
良种繁育过程中的应用提供一定的理论依据。
材料与方法
1 植物材料
实验材料为: (1)采自山东农业大学林学实验
站的6株八年生欧石楠(Erica carnea L.)母株上当
年生嫩梢作为外植体(野生型) (CK); (2)实验室已
有的培养约50 d的胚性愈伤组织(Y), 选用表面具
球形颗粒、结构致密、颜色嫩黄者 (李际红等
2012); (3)培养50 d的胚性愈伤组织诱导形成的不
定芽(Z); (4)生根苗移栽到大田的移栽苗(D)。
2 试验方法
2.1 DNA提取
利用CTAB法提取上述试验材料的总DNA,
DNA的纯度与浓度用1.0%琼脂糖凝胶电泳和Nano-
drop核酸蛋白分析仪检测, 每个时期各选取6份纯度
与浓度均适合的DNA样品, 保存于–20 ℃下备用。
2.2 RAPD和ISSR反应体系和程序
25 µL的RAPD-PCR反应体系含10×PCR缓冲
液2.5 µL、25 mmol·L-1 Mg2+ 2.5 μL、2.5 mmol·L-1
dNTPs 2.0 μL、10 µmol·L-1上、下游引物1.0 μL (表
1)、1 000 ng·µL-1 DNA模板1 μL、5 U·µL-1 rTaq酶
0.25 μL、无菌水15 μL。PCR程序为: 预变性95 ℃
5 min; 94 ℃变性45 s, 38 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2
min, 40个循环; 72 ℃延伸7 min后4 ℃保存。
表1 RAPD引物序列
Table 1 The sequence of RAPD primers
引物 序列(5→3) 引物 序列(5→3)
S1 GTTTCGCTCC S29 GGGTAACGCC
S8 GTCCACACGG S31 CAATCGCCGT
S10 CTGCTGGGAC S32 TCGGCGATAG
S12 CCTTGACGCA S33 CAGCACCCAC
S15 GGAGGGTGTT S35 TTCCGAACCC
S17 AGGGAACGAG S36 AGCCAGCGAA
S20 GGACCCTTAC S37 GACCGCTTGT
S23 AGTCAGCCAC S38 AGGTGACCGT
S26 GGTCCCTCAC S39 CAAACGTCGG
S27 GAAACGGGTG S40 GTTGCGATCC
25 µL的ISSR反应体系含10×PCR缓冲液2.5
µL、25 mmol·L-1 Mg2+ 2.8 μL、2.5 mmol·L-1
dNTPs 2.3 μL、10 µmol·L-1上、下游引物1.0 μL (表
2)、1 000 ng·µL-1 DNA模板1 μL、5 U·µL-1 rTaq酶
0.25 μL、无菌水14 μL。PCR程序为: 预变性95 ℃
5 min; 94 ℃变性45 s, 56 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2
min, 40个循环; 72 ℃延伸7 min后4 ℃保存。
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测
取40%的聚丙烯酰胺母液9 mL、70%的尿素
45 mL和10%的TBE缓冲液6 mL混匀后, 加入400
µL APS和40 µL TEMED制成6%的聚丙烯酰胺凝
胶, 取8 µL的PCR产物(RAPD和ISSR)与2 µL的上
样缓冲液混合, 于6%的聚丙烯酰胺胶上, 180 V电
压下电泳3 h, 银染后检测。
3 数据分析
RAPD和ISSR分子标记均为显性标记, 同一引
物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有
同源性, 为同一位点的产物, 分别以DNA Marker
植物生理学报490
5000和DNA Marker DL 2000 (TaKaRa)作为相对分
子量标准, 电泳图谱中的每一条带视为一个分子
标记, 并代表一个引物结合位点, 在PAGE胶中, I为
公共带(为在同一刻度下, 体细胞胚发育4个时期均
有的条带), II为特异性条带(为在同一刻度下, 体细
胞胚发育的4个时期表达不同的条带)。用筛选出
的引物对4类样品进行扩增, 按凝胶同一位置上
DNA条带的有无进行统计, 有带的记为“1”, 无带
的记为“0”, 形成RAPD和ISSR带型(0、1)数据矩阵,
用于试验分析。采用多样性分析软件(Popgen 32)
对RAPD和ISSR扩增结果进行遗传稳定性分析, 计
算多态性位点及PPB、有效等位基因数(Ne)、Neis
基因多样性指数(H)及Shannon信息指数(I), 利用
NTSYS软件进行遗传距离和UPGMA聚类分析。
实验结果
1 欧石楠的RAPD和ISSR扩增结果
由表3可知, 利用筛选出的9对适宜RAPD分析
的扩增引物, 对欧石楠4个体细胞胚不同时期的试
材进行PAGE电泳检测, 共获得158条带(平均每对
引物17.56条), 其中多态性条带13条(平均每对引物
1.44条), PPB为8.23%, 引物组合S1-S10的PPB最高,
为14.3%, S1-S36和S1-S40的PPB为0 (表3)。
利用筛选出来的8对适宜ISSR分析的引物组
合, 对欧石楠4个体细胞胚不同时期的试材进行
PAGE检测, 共获得143条带(平均每对引物17.88
条), 其中多态性位点15个(平均每对引物1.88条),
占检测位点总数的10.48%。引物组合UBC812-
UBC840和UBC812-UBC835的PPB最低, 为5.56%,
UBC812-UBC848的PPB最高, 为16.67% (表4)。
2 体细胞胚不同发育时期的遗传多样性
利用Popgen 1.32软件分别分析9对RAPD引物
组合扩增获得的158条带和8对ISSR引物组合扩增
得到的143条带, 得到体细胞胚发育4个时期不同
材料间的遗传多样性。
RAPD标记结果显示, 欧石楠体细胞胚发育4
个时期的Ne值为1.2097, H值为0.1174, I值为
0.1701; 其中引物组合S1-S23的Ne值(1.3726)、H
值(0.2454)、I值(0.2646)最大, 而S1-S20的Ne值
(1.1447)、H值(0.0813)、I值(0.1208)最小(数据未
列出)。
ISSR标记结果显示, 欧石楠体细胞胚发育4个
表2 ISSR引物序列
Table 2 The sequence of ISSR primers
引物 序列(5→3) 引物 序列(5→3)
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC
UBC812 GAGAGAGAGAGAGAGAA UBC822 TCTCTCTCTCTCTCTCA
UBC827 ACACACACACACACACG UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGTC
UBC840 GAGAGAGAGAGAGAGACT UBC848 CACACACACACACACAAG
UBC855 ACACACACACACACACCT UBC857 ACACACACACACACACTG
表3 RAPD引物组合及扩增条带数
Table 3 RAPD primer combinations and the numbers of amplified products
引物 扩增条带总数 公共条带数 多态性条带数 PPB/% 特异性条带数
S1-S10 14 12 2 14.30 0
S1-S37 18 16 2 11.10 0
S1-S20 18 16 2 11.10 0
S1-S23 18 17 1 5.56 0
S1-S26 18 16 2 11.10 0
S1-S31 18 16 2 11.10 0
S1-S35 18 16 2 11.10 0
S1-S36 18 18 0 0 0
S1-S40 18 18 0 0 0
总数 158 145 13 8.23 0
王锦楠等: 欧石楠体细胞胚再生过程中遗传稳定性的RAPD和ISSR分析 491
时期Ne值为1.2538, H值为0.1404, I值为0.2031; 其
中引物组合UBC812-UBC840的Ne值、H值、I值
最大, 分别为1.4172、0.2333、0.3381, 而UBC812-
UBC827的Ne值、H值、I值最小, 分别为1.1176、
0.0588、0.0815(数据未列出)。
RAPD和ISSR两种标记的结果均显示Ne值、
H值、I值都趋近于稳定值, 这表明同一对引物的
不同材料之间的遗传变异较低, 其遗传稳定性较
高; 比较RAPD和ISSR的结果发现, ISSR结果中的
平均Ne值、H值、I值均比RAPD的高, 这表明ISSR
分子标记产生的多态性条带多于RAPD标记。
3 体细胞胚发育同一时期的遗传多样性
RAPD分析结果显示, 体细胞胚发育的同一时
期的遗传稳定性较高(图1, I)。由表5可见, 胚性愈
伤组织的Ne值(1.0116)、H值(0.0067)、I值(0.0099)
以及PPB (1.71%)均高于外植体、不定芽和移栽苗,
表明在RAPD分析中胚性愈伤组织之间存在着一定
的变异, 而其他3种材料之间遗传稳定性较高。
ISSR分析结果显示, 体细胞胚发育的同一时
期之间的遗传稳定性较高(图2, I)。由表6可见, 外
植体的Ne值(1.0260)、H值(0.0144)、I值(0.0213)
以及PPB (4.07%)均高于胚性愈伤组织、不定芽和
移栽苗, 其中不定芽的Ne值(1.0081)、H值(0.0042)
以及I值(0.0059)最小, 这表明在ISSR分析中外植体
之间的遗传变异率相对较高, 而不定芽之间的遗
传稳定性相对较高。
由表5和表6可以看出, RAPD和ISSR标记对体
细胞胚同一时期分析得到的Ne值、H值和I值都趋
近于稳定值, 这说明体细胞胚发育同一时期试材
的遗传稳定性好, 遗传变异极低。另外, RAPD分
表4 ISSR引物组合及扩增条带数
Table 4 ISSR primer combinations and the numbers of amplified products
引物组合 扩增条带总数 公共条带数 多态性条带数 PPB/% 特异性条带数
UBC812-UBC827 17 15 2 11.76 0
UBC812-UBC840 18 17 1 5.56 1
UBC812-UBC855 18 16 2 11.11 0
UBC812-UBC811 18 16 2 11.11 0
UBC812-UBC822 18 16 2 11.11 0
UBC812-UBC835 18 17 1 5.56 0
UBC812-UBC848 18 15 3 16.67 0
UBC812-UBC857 18 16 2 11.11 0
总数 143 128 15 10.48 1
图1 引物组合S1-S23的RAPD图谱
Fig.1 RAPD profile of the primer combination S1-S23
CK: 外植体; Y: 胚性愈伤组织; Z: 不定芽; D: 移栽苗。1~6: 各个时期的6份重复材料; I: 公共条带; II: 特异性条带; M: DL5000 marker。
植物生理学报492
子标记的结果中除了胚性愈伤组织之外, 其余材
料的Ne值、H值、 I值均为1.0000、0.0000、
0.0000, 这说明RAPD分子标记技术并未完全将相
同时期的材料彻底分开, 可见, ISSR分子标记的精
确度比RAPD高。
4 体细胞胚发育不同时期间的相似系数和遗传距离
遗传的相似系数和遗传距离是分别从两个方
表5 体细胞胚再生同一时期遗传稳定性的RAPD分析
Table 5 Genetic stability analysis in the same period of
somatic embryo regeneration by RAPD
不同发育时期材料 Ne H I PPB/%
CK 1.0000 0.0000 0.0000 0
Y 1.0116 0.0067 0.0099 1.71
Z 1.0000 0.0000 0.0000 0
D 1.0000 0.0000 0.0000 0
图2 引物组合UBC812-UBC835的ISSR图谱
Fig.2 ISSR profile of the primer combination UBC812-UBC835
CK: 外植体; Y: 胚性愈伤组织; Z: 不定芽; D: 移栽苗。1~6: 各个时期的6份重复材料; I: 公共条带; II: 特异性条带; M: DL5000 marker。
表6 体细胞胚再生同一时期遗传稳定性的ISSR分析
Table 6 Genetic stability analysis in the same period of
somatic embryo regeneration by ISSR
不同发育时期材料 Ne H I PPB/%
CK 1.0260 0.0144 0.0213 4.07
Y 1.0207 0.0114 0.0165 2.70
Z 1.0081 0.0042 0.0059 0.87
D 1.0211 0.0120 0.0177 3.05
面来衡量样品间遗传关系的指标。由表7可见 ,
RAPD标记的4种试材间遗传相似系数值变化范围
为0.8403~0.9584, 平均值为0.8979, 遗传距离为
0.0442~0.1616, 平均值为0.1118。其中, 外植体与
胚性愈伤组织的相似系数最小(0.8403), 说明外植
体与胚性愈伤组织的关系较远; 胚性愈伤组织和
不定芽的遗传相似系数最大(0.9584), 遗传稳定性
较高。
从表8可见, ISSR标记4种材料间的遗传相似
表7 基于RAPD的4个欧石楠样品的相似系数和遗传距离
Table 7 Similarity coefficient and genetic distance of
4 E. carnea samples based on RAPD
材料 CK Y Z D
CK — 0.1616 0.1568 0.1246
Y 0.8403 — 0.0442 0.1024
Z 0.8541 0.9584 — 0.0810
D 0.8952 0.9113 0.9280 —
　　横线上方为遗传距离, 下方为相似系数。
表8 基于ISSR的4个欧石楠样品的相似系数和遗传距离
Table 8 Similarity coefficient and genetic distance of
4 E. carnea samples based on ISSR
材料 CK Y Z D
CK — 0.1948 0.1719 0.1204
Y 0.8154 — 0.1089 0.1650
Z 0.8383 0.9032 — 0.1388
D 0.8903 0.8486 0.8749 —
　　横线上方为遗传距离, 下方为相似系数。
王锦楠等: 欧石楠体细胞胚再生过程中遗传稳定性的RAPD和ISSR分析 493
系数介于0.8154~0.9032, 平均为0.8618; 遗传距离
为0.1089~0.1948, 平均值为0.1500, 说明欧石楠样
品间保持了较高的基因相似度, 遗传距离较小。
其中 , 外植体与胚性愈伤组织的相似系数最小
(0.8154), 遗传距离最大(0.1948), 这一结果与
RAPD的结果相同, 说明由外植体到胚性愈伤组织
的过程可能是体细胞胚繁殖的关键时期。
5 体细胞胚发育不同时期的聚类分析
根据RAPD和ISSR分析结果, 计算遗传相似系
数矩阵, 按UPGMA法构建了材料间的遗传关系聚
类图。结果表明, 2种标记都能将4个不同发育时期
的材料区分开, 聚类结果具有一定相似性, 但又不
完全相同。RAPD聚类图显示, 遗传相似系数值为
0.930时, 可将所有供试材料划分为两大类: CK为
第I类, Y、Z和D为第II类(图3-A)。ISSR的聚类结
果与RAPD有一定的相似性, 在遗传相似系数为
0.850时, 可将所有供试材料划分为两大类: CK和D
为第I类, Y和Z为第II类(图3-B)。
图3 基于RAPD (A)和ISSR (B)分子标记数据的4个欧石楠体细胞胚发育时期的UPGMA聚类图
Fig.3 Dendrogram for the 4 different developmental stages of somatic embryo of E. carnea
based on RAPD (A) and ISSR (B) markers by UPGMA method
植物生理学报494
讨　　论
如何保证欧石楠体细胞胚快繁体系的遗传稳
定性 , 是当前欧石楠组织培养繁殖的关键性问
题。本研究中RAPD和ISSR的分析结果显示, 欧石
楠体细胞胚发育4个时期的PPB为8.23%和10.48%,
说明在不同发育时期之间的遗传变异率较低, 遗
传稳定性较高。这一结果与杨晓明等(2006)、熊
丹等(2008)和王天地(2013)分别在葡萄(Vitis vi-
nifera)、香果树(Emmenopterys henryi)和橡胶树
(Hevea brasiliensis)胚性愈伤组织和再生植株的稳
定性研究中所得到的结论相一致。欧石楠是通过
体细胞胚再生途径建立的快速繁殖体系 , 与葡
萄、香果树和橡胶树的再生途径相同, 进一步说明
组织培养过程中的遗传稳定性可能与其组织培养
的再生途径有一定的关联。同时, RAPD和ISSR的
分析结果显示, 体细胞胚发育的4个时期中, 外植体
与胚性愈伤组织的遗传相似系数(0.8403和0.8154)
均最小, 外植体与胚性愈伤组织的遗传稳定性相
对较低; 对体细胞胚发育同一时期的遗传稳定性
研究发现, 胚性愈伤组织的PPB最高, 遗传稳定性
相对较差。由此推测, 从外植体到胚性愈伤组织
是体细胞胚发育的关键时期, 这不仅与DNA分子
水平有关, 还可能受到表观遗传学的影响。
不同的分子标记技术, 检测遗传稳定性水平不
同, 在某些情况下获得的结果甚至存在较大差异
(Pejic等1998; Forster等1994)。在本研究中, RAPD
和ISSR两种分子标记的分析结果具有较高的相似
性, 但ISSR扩增得到的条带更丰富, 多态性条带数
(15条)和PPB(10.48%)均高于RAPD。聚类分析显
示, RAPD标记所得到的聚类图中Y、Z和D聚为一
类, CK为一类, 且CK、Z和D的6份重复材料一致;
ISSR标记的聚类分析显示, CK和D聚为一类, Y和Z
聚为一类, 各个时期的6份重复材料有差异。所以,
从扩增条带丰富度、聚类的信息量和精确度考虑,
ISSR的分析结果可能更可靠。
欧石楠体细胞胚再生过程中表现出较高的遗
传稳定性, 其体细胞胚繁殖是一种较稳定的方式,
这与李贵(2012)和王启业(2012)在结球甘蓝(Bras-
sica oleracea var. capitata)和铁皮石斛(Dendrobium
officinale)中得到的结论相同, 也证明不经愈伤组
织直接由体细胞分化成器官, 可以降低由愈伤组
织诱导产生的间接器官再生过程中细胞内染色体
变异的机率, 即降低组织培养过程中体细胞无性
系变异机率(丰先红等2010)。但只利用随机引物
和重复引物检测DNA的稳定性, 鉴定结果有一定
的局限性(Peredoa等2009), 因此还须采用其他分子
标记技术来进一步确定。
参考文献
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