全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (12): 1413~1420 1413
收稿 2013-10-17　　修定 2013-11-12
资助 山东省泰安市科技局项目(2011-2013)、山东省东营市科
技局项目(2009-2011)、山东省泰安市大学生科技引领创
新计划项目(2008D2010及2009D1009)。
* 通讯作者(E-mail: jhli4856@163.com; Tel: 1861522637)。
欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化
姚培娟, 李际红*, 亓晓, 邢世岩
山东农业大学林学院, 农业生态与环境重点实验室, 山东泰安271018
摘要: 利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法, 对欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的DNA甲基化进行了研究。从
64对选扩增引物中筛选出19对, 共扩增得到506条带, 统计显示, 大田苗、胚性愈伤组织和再生苗的全基因组DNA甲基化水
平分别为31.42%、27.86%和29.05%, 3种试材发生甲基化变异的有175条带, 变异率为34.58%。体细胞胚诱导形成胚性愈
伤组织过程中, 甲基化水平降低, 而在再生苗中有所恢复, 与大田苗接近。在外侧胞嘧啶甲基化水平上, 胚性愈伤组织的甲
基化水平有所增加, 且在再生苗中可部分维持。另外, 在175条变异带中, 再生苗恢复到大田苗DNA甲基化模式的有62条,
占总变异条带的35.43%, 而与胚性愈伤组织维持相同DNA甲基化模式的有59条, 占33.71%。回收部分甲基化变异条带, 最
终得到8条有效的基因组DNA序列。BLASTn比对分析表明, 在欧石楠基因组中, 包括抗性基因、蛋白激酶、质体基因等
在内的多种DNA序列均存在DNA甲基化修饰现象。
关键词: 欧石楠; DNA甲基化; 体细胞胚发生; 胚性愈伤组织; 再生苗
DNA Methylation in Somatic Embryogenesis of Erica carnea L.
YAO Pei-Juan, LI Ji-Hong*, QI Xiao, XING Shi-Yan
Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment, College of Forestry, Shandong Agricultural University, Tai’an,
Shandong 271018, China
Abstract: The extent of DNA methylation polymorphisms were evaluated in Erica carnea field seedlings,
embryogenic calli and regenerated seedlings using methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP)
technique. In all, 506 bands were produced by 19 selective primer pairs. The percentages of whole-genomic DNA
methylation in field seedlings, embryogenic calli and regenerated seedlings were 31.42%, 27.86% and 29.05%,
respectively. There were 175 methylation alteration bands (34.58%) among three kinds of materials. It was found
that methylation level of embryogenic calli reduced in the process of somatic embryo induction and recovered in
the regenerated seedlings, whose methylation level was close to field seedlings. The lateral cytosine methylation
level of embryogenic calli was increased and could partially maintain in regenerated seedlings. In addition, in the
total of 175 alteration bands, 62 bands (35.43%) from regenerated seedlings recovered to DNA methylation
patterns of field seedlings, while 59 bands (33.71%) from regenerated seedlings maintained the same DNA
methylation patterns of embryogenic calli. Eight methylated DNA fragments were isolated and sequenced by
extracting part of the amplified sites. BLASTn analysis indicated that DNA methylated modification existed in
multiple types of DNA fragments, including resistance gene sequences, protein kinase, plastogene, etc.
Key words: Erica carnea; DNA methylation; somatic embryogenesis; embryogenic calli; regenerated seedlings
2006年, 我们课题组从华野园艺引进了适合我
国北方广大地区栽培的欧洲最新地被开花植
物——欧石楠, 为迅速推广应用, 我们已成功建立
了欧石楠体细胞胚繁育技术体系(李际红等2012)。
然而体细胞无性系变异在植物组织培养中是一种
普遍现象, DNA甲基化作为体细胞无性系变异的分
子机制之一, 广泛存在于组织培养过程中(Kaeppler
等2000)。目前, 关于DNA甲基化在组织培养过程
中的作用机制虽然还没被完全揭示, 但许多研究已
显示DNA甲基化以多种变异形式出现于植株再生
过程中, 且在组织培养中高频发生(鲍智娟2009)。
近年来, 采用甲基化敏感扩增多态性(methylation-
sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术, 对
啤酒花(Humulus lupulus cv. Chinook)、豌豆(Pisum
sativum)、野生大麦(Hordeum brevisubulatum)、香雪
植物生理学报1414
兰(Freesia hybrida)、大叶蝴蝶兰(Phalaenopsis
bellina)、大花君子兰(Clivia miniata)和茄子(Solanum
melongena)等禾本科植物及蔬菜作物组织培养过程
中DNA甲基化变异的研究已有报道(Peredo等2006;
Smykal等2007; Li等2007; Gao等2010; Khodda-
mzadeh等2010; Wang等2012; Mallaya和Ravishankar
2013), 但对木本观赏植物的研究还鲜有报道。目前,
我们已建立了成熟的欧石楠体细胞胚再生体系, 为
了检测以体细胞胚再生方式形成的再生苗在表观
遗传方面是否存在变异, 对其胚性愈伤组织和再生
苗与大田苗之间DNA甲基化水平和模式的变异进
行研究。
本试验采用MSAP技术, 对欧石楠大田苗、胚
性愈伤组织以及胚性愈伤组织诱导的再生苗之间
的胞嘧啶甲基化水平和模式的变异进行分析, 明
确其变异趋势, 以期为揭示欧石楠体细胞胚再生过
程中DNA甲基化变异的分布规律及其表观遗传学
特性提供一定的理论依据。
材料与方法
1 材料
实验材料为: (1)采自山东农业大学林学实验
站的七年生欧石楠(Erica carnea L.)大田苗(CK)当
年生嫩梢; (2)于1/2WPM+1.0 mg·L-1 ZT+0.3 mg·L-1
IBA培养基上培养约50 d的胚性愈伤组织(E), 以表
面具球形颗粒、结构致密、颜色嫩黄者为宜(李际
红等2012); (3)胚性愈伤组织诱导形成的再生苗
(S)。
2 方法
2.1 DNA提取
按照新型植物基因组提取试剂盒(TianGen)上
的步骤提取上述3个试材的总DNA, DNA的纯度与
浓度用1.5%琼脂糖凝胶和BioSpec-mini分光光度
仪(Shimadzu, Japan)检测, –20 ℃保存备用。
2.2 DNA甲基化分析
MSAP分析流程参照魏华丽等(2011)的方法
并略作修改, 分别用EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI
(Fermentas Lithuanian)内切酶组合对基因组DNA
进行酶切、连接、预扩增、选择性扩增、6%聚丙
烯酰胺凝胶电泳、银染检测、读带和数据整理。
EcoRI及HpaII (MspI)的接头与引物均参照Xiong等
(1999)的序列(表1)。所有接头与引物均委托上海
生工(Sangon)合成。
HpaII和MspI的酶切位点均为(CCGG/GGCC),
但二者对酶切位点甲基化修饰敏感性不同: HpaII
能识别并切割未甲基化和外侧胞嘧啶甲基化位点
表1 MSAP分析的接头和引物序列
Table 1 Sequences of adapters and primers used for MSAP analysis
接头和引物 序列
接头 正向EcoRI接头 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′
反向EcoRI接头 5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′
正向HpaII-MspI接头 5′-GACGATGAGTCTAGAA-3′
反向HpaII-MspI接头 5′-CGTTCTAGACTCATC-3′
预扩增引物 EA00+A 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′
HpaII-MspI+T 5′-GATGAGTCTAGAACGGT-3′
选扩增引物 EA00+ATG 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCATG-3′
EA00+ACG 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCACG-3′
EA00+ACT 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCACT-3′
EA00+ACA 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCACA-3′
EA00+AGT 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGT-3′
EA00+AGA 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGA-3′
EA00+AGG 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGG-3′
EA00+ACC 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCACC-3′
EA00+ATC 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCATC-3′
HM+TTC 5′-GATGAGTCTAGAACGGTTC-3′
HM+TCG 5′-GATGAGTCTAGAACGGTCG-3′
HM+TAG 5′-GATGAGTCTAGAACGGTAG-3′
姚培娟等: 欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化 1415
(5mCCGG/GGCC), 而不能切割内侧胞嘧啶甲基化
位点(C5mCGG/GG5mCC); MspI能识别并切割未甲
基化和外侧胞嘧啶甲基化位点, 而不能切割外侧
胞嘧啶甲基化位点。利用这两种同裂酶分别与
EcoRI组合进行MSAP反应, 被内切酶识别, 图谱上
显示有带, 即存在EcoRI+HpaII双酶切位点(或者
EcoRI+MspI双酶切位点); 未被识别则显示无带。
根据条带的有无, 可将MSAP选扩图谱条带分成四
大类: EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI泳道都有条带,
为类型I, 表示未发生甲基化; EcoRI+HpaII泳道无
条带, 而EcoRI+MspI泳道有条带, 为类型II, 表示发
生全甲基化; EcoRI+HpaII泳道有条带, 而EcoRI+
MspI泳道无条带, 为类型III, 表示发生半甲基化;
EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI泳道都无条带, 为类型
IV, 表示没有CCGG位点存在(李际红等2011)。
2.3 DNA甲基化变异模式
将大田苗、胚性愈伤组织以及再生苗3种试
材之间的DNA甲基化模式变异分为4种类型: 第一
类, 在胚性愈伤组织中DNA甲基化模式已经发生
了变异, 而再生苗恢复到之前的甲基化模式; 第二
类, 胚性愈伤组织中变异了的DNA甲基化模式在
再生苗中可维持; 第三类, 在胚性愈伤组织中已经
发生了变异的DNA甲基化模式, 在再生苗中又发
生新的甲基化变异; 第四类, 在胚性愈伤组织中没
有发生DNA甲基化模式变异, 而再生苗中发生了
变异。
2.4 DNA甲基化变异率计算
在两组内切酶消化产物的MSAP扩增图谱中,
有一些是不同材料共有的片段, 即非变异片段, 而
有些片段在部分材料中发生了变异, 称之为变异
片段。DNA甲基化变异率(%)=变异片段数/(变异
片段数+非变异片段数)×100。
2.5 甲基化变异片段的回收、克隆及测序
参照李际红等(2011)的方法, 在聚丙烯酰胺凝
胶电泳(PAGE)胶板尚未干燥之前, 将甲基化变异
片段用刀片挖下, 捣碎, 加入30 μL灭菌双蒸水, 于
沸水浴中5 min后自然冷却, 取2 μL上清液为模板,
以相应的选扩增引物组合和条件进行PCR扩增。
PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上检测, 采用PCR纯化
试剂盒(TaKaRa, Japan)回收甲基化变异片段。回
收产物连接入pTZ57R-T (Thermo Scientific, USA)
载体, 转化大肠杆菌感受态细胞, 挑选阳性单克
隆。序列测定委托上海生工(Sangon)完成。将所
得甲基化差异序列用BLASTn程序在NCBI (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行同源性检索, 在
GenBank数据库检索同源核苷酸序列(Database:
refseq_rna)。
实验结果
1 欧石楠的MSAP扩增图谱
采用优化的MSAP技术体系, 对欧石楠大田
苗、胚性愈伤组织以及再生苗进行分析, 获得了谱
带清晰、重复性好、甲基化扩增条带丰富的MSAP
扩增图谱(图1)。依据方法2.2小节中对胞嘧啶甲基
化带型的分类, 从64对选扩增引物中筛选出的19
对引物, 共扩增产生506条清晰可辨且可重复的DNA
条带, 平均每对引物扩增获得26.63条带(表2)。
2 欧石楠3种试材的DNA甲基化修饰水平
由图1统计可知, 大田苗、胚性愈伤组织及
再生苗的全基因组甲基化水平分别为31.42%、
27.86%、29.05% (表2), 大田苗甲基化水平最高,
再生苗次之, 胚性愈伤组织最低。由此可见, 胚性
愈伤组织的形成过程是以去甲基化为主, 再生苗的
诱导过程是以重新甲基化为主, 表现为再生苗与大
田苗的甲基化水平接近(图2)。然而从外侧胞嘧啶
甲基化水平看, 胚性愈伤组织的半甲基化水平高于
大田苗, 说明在胚性愈伤组织发生过程中, 既存在
去甲基化, 也存在外侧胞嘧啶重新甲基化现象。另
外, 3种试材的内侧胞嘧啶甲基化水平均高于外侧
胞嘧啶甲基化水平(图2), 由此推测DNA胞嘧啶甲
基化的发生以双链内侧胞嘧啶甲基化为主。
3 欧石楠3种试材之间的DNA甲基化变异
由欧石楠3种试材的MSAP扩增图谱可见, 大
田苗、胚性愈伤组织和再生苗之间存在广泛的
DNA胞嘧啶甲基化变异, 在扩增出的506条条带中,
发生DNA甲基化模式变异的条带有175条, 变异率
高达34.58%。
通过比较大田苗、胚性愈伤组织及再生苗之
间的MSAP扩增图谱, 将其基因组中检测到的DNA
甲基化位点模式分为4个大类、12个亚类: A为由
未甲基化到发生变化的条带; B为由外侧胞嘧啶半
甲基化到发生变化的条带; C为由内侧胞嘧啶完全
植物生理学报1416
表2 19对MSAP选扩增引物组合在欧石楠全基因组中的检测结果
Table 2 Number of bands amplified using 19 MSAP selective primer combinations in genomic DNA of E. carnea

引物组合 扩增条带数
半甲基化条带数 全甲基化条带数
CK E S CK E S
EA00ATG+HM-TAG 24 3 5 3 7 3 3
EA00ACG+HM-TAG 17 5 6 6 5 2 2
EA00ACA+HM-TAG 17 1 4 0 4 4 6
EA00AGT+HM-TAG 36 0 0 0 2 1 1
EA00AGA+HM-TAG 22 5 14 5 1 0 2
EA00AGG+HM-TAG 43 12 10 7 8 8 8
EA00ACC+HM-TAG 22 3 5 3 5 7 9
EA00ATG+HM-TCG 19 3 1 1 7 4 6
EA00ACG+HM-TCG 31 3 2 4 2 1 2
EA00ACT+HM-TCG 25 1 0 1 3 2 4
EA00AGA+HM-TCG 19 0 0 0 2 3 3
EA00ACC+HM-TCG 29 2 2 4 5 3 2
EA00ACA+HM-TTC 23 2 3 3 2 3 2
EA00AGT+HM-TTC 23 4 6 6 3 1 0
EA00AGA+HM-TTC 22 3 4 6 1 2 1
EA00ACC+HM-TTC 27 3 2 3 8 5 6
EA00ATC+HM-TAG 35 3 1 2 7 4 5
EA00ATC+HM-TCG 32 5 3 9 9 8 10
EA00ATC+HM-TTC 40 2 2 3 18 10 9
总计 506 60 70 66 99 71 81
甲基化位点比例/% 11.86 13.83 13.04 19.56 14.03 16.01
图1 欧石楠基因组DNA的MSAP扩增图谱
Fig.1 MSAP fingerprints of genomic DNA in E. carnea
A、B、C、D: 分别表示EA00-ATC+HM-TTC、EA00-ATC+HM-TCG、EA00-ATC+HM-TAG、EA00-ACC+HM-TCG引物组合的扩增
结果。CH: 大田苗的EcoRI+HpaII双酶切; CM: 大田苗的EcoRI+MspI双酶切; EH: 胚性愈伤组织的EcoRI+HpaII双酶切; EM: 胚性愈伤组织
的EcoRI+MspI双酶切; SH: 再生苗的EcoRI+HpaII双酶切; SM: 再生苗的EcoRI+MspI双酶切; M: 100 bp的DNA分子量标准。I: 非甲基化条
带; II: 全甲基化条带; III: 半甲基化条带。
姚培娟等: 欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化 1417
甲基化到发生变化的条带; D为由外侧胞嘧啶或者
内侧和外侧胞嘧啶位点到又重新出现条带的条
带。175条变异带的变异模式见图3。
由表3可见, 相对于大田苗, 胚性愈伤组织的
带型变异主要表现为新条带的出现(A1、A2和A3),
产生了63条新条带, 占152个多态性位点的41.45%;
相对于胚性愈伤组织, 再生苗的带型变异以重新
甲基化为主(A3、B3和C3), 产生了33条新条带, 占
104个多态性位点的31.73%; 在所有发生变异的带
型中, 内侧与外侧甲基化位点的转换频率最低(B2
和C2)。
按照方法2.3小节对DNA甲基化变异模式的
分类, 分析所获得的175条变异条带, 结果显示, 第
一类的条带有62条, 占总变异条带的35.43%, 为4
种变异类型中所占比例最高的; 第二类有59条, 占
33.71%, 其中以外侧胞嘧啶甲基化变异的遗传稳
定性最好; 第三类的比例为18.86%; 第四类的比例
为12.00% (图3和图4)。可见, 胚性愈伤组织的形成
和再生苗的诱导中均存在丰富的DNA甲基化变异
模式, 胚性愈伤组织中发生的甲基化变异在再生
苗中大部分会有所恢复, 而在再生苗中表现的变
异多为外侧胞嘧啶半甲基化。
4 DNA甲基化变异片段的回收检测及序列分析
对部分产生甲基化变异的修饰位点进行回收
克隆, 最终成功分离了8条发生甲基化变异的DNA
序列(表4)。BLASTn比对分析表明, 这8条甲基化
变异序列均检索到同源系列, 包括抗性基因(M5)、
蛋白激酶6 (MKK6) (M12)、环斑病(PRSV)外壳蛋
白(M19)、茶树连锁图谱中相关基因(M11)、质体
(M20、M30)、切割和多聚腺苷酸化特异性因子亚
单位(M24)和大豆转基因无性系(M29), 说明多种
图2 欧石楠大田苗、胚性愈伤组织和再生苗
的DNA甲基化水平
Fig.2 DNA methylation levels of field seedlings, embryogenic
calli and regenerated seedlings in E. carnea
图3 胚性愈伤组织、再生苗与大田苗之间的变异模式
Fig.3 Variation patterns among embryogenic calli, regenerated
seedlings and field seedlings
表3 三种欧石楠试材两者之间的变异模式
Table 3 Variation patterns between each two materials in 3
kinds of E. carnea materials
模式 类型
变异前带型 变异后带型 变异条带数
H M H M CK→E E→S
A A1 有 有 有 无 10 6
A2 有 有 无 有 7 3
A3 有 有 无 无 48 18
B B1 有 无 有 有 1 7
B2 有 无 无 有 1 6
B3 有 无 无 无 13 12
C C1 无 有 有 有 6 4
C2 无 有 有 无 4 0
C3 无 有 无 无 28 3
D D1 无 无 有 有 21 22
D2 无 无 有 无 10 14
D3 无 无 无 有 3 9
总计 152 104
　　H: EcoRI+HpaII酶切; M: EcoRI+MspI酶切。CK→E: 从大田
苗到胚性愈伤组织发生的甲基化变异; E→S: 从胚性愈伤组织到
大田苗发生的甲基化变异。
植物生理学报1418
表4 欧石楠基因组DNA甲基化变异片段的比对结果
Table 4 BLASTn result of the methylated DNA fragments of genomic DNA in E. carnea
序列 长度/bp 变异模式 BLASTn同源序列 一致性/% E值
M5 188 第一类 陆地棉冷应激甲基化敏感多态性基因组序列MSAP-11无性系(JN568572.1) 100 3.4
M11 95 第二类 茶树SSR标记的DNA序列MSE0239 (AB623933.1) 85 8.00E-04
M12 134 第二类 陆地棉丝裂原活化蛋白激酶6 (MKK6)的mRNA序列完整的CDS (GU188977.1) 90 2.2
M19 198 第二类 番木瓜BAC克隆46O19完整序列(AC238599.1) 85 0.086
M20 267 第二类 大果越橘叶绿体完整的基因组(JQ248601.1) 90 2.00E-87
M24 165 第二类 预测的野草莓裂解多聚腺苷酸化特异性因子亚单元(LOC101315389)的mRNA 90 5.00E-04
(XM_004308111.1)
M29 172 第三类 大豆82株GM_WBb0152C06无性系完整序列(AC235438.1) 92 1.00E-04
M30 95 第三类 紫金牛属叶绿体完整的基因组(KC465962.1) 97 1.00E-25
类型的基因组DNA序列均存在DNA甲基化变异修
饰现象, 可见欧石楠体细胞胚诱导发生过程中发
生了广泛的甲基化变异。
讨　　论
早在1994年, Phillips等就提出, DNA甲基化可
能是体细胞无性系变异的一个重要原因。Kaeppler
等(2000)研究显示, 再生苗及其后代中存在广泛的
DNA甲基化变异。Prakash等(2003)利用两组同裂
酶(HpaII和MspI)对矮牵牛叶片再生苗诱导过程中
愈伤组织和再生苗的CCGG位点进行酶切分析, 证
明胞嘧啶甲基化水平与叶片诱导再生苗的能力存
在极强的正相关。本研究利用MSAP技术, 研究了
欧石楠胚性愈伤组织、再生苗与大田苗之间的
DNA甲基化水平和模式的变异, 发现胚性愈伤组
织全基因组DNA甲基化水平比大田苗的有所降低;
再生苗的DNA甲基化水平(29.05%)与胚性愈伤组
织的(27.86%)相比,有所回升, 接近大田苗的水平
(31.42%)。本研究得到的胚性愈伤组织甲基化水
平的变异趋势与在玉米 ( K a e p p l e r和P h i l l i p s
图4 胚性愈伤组织、再生苗与大田苗的DNA甲基化变异模式的MSAP图谱
Fig.4 MSAP fingerprints of DNA methylation variation patterns among embryogenic calli,
regenerated seedlings and field seedlings
A、B、C: 分别表示EA00-ATC+HM-TAG、EA00-AGG+HM-TAG、EA00-AGT+HM-TAG的选扩增引物扩增结果。CH: 大田苗的
EcoRI+HpaII双酶切; CM: 大田苗的EcoRI+MspI双酶切; EH: 胚性愈伤组织的EcoRI+HpaII双酶切; EM: 胚性愈伤组织的EcoRI+MspI双酶
切; SH: 再生苗的EcoRI+HpaII双酶切; SM: 再生苗的EcoRI+MspI双酶切。I: 非甲基化位点; III: 半甲基化位点。a、b、c、d分别为第一
类、第二类、第三类、第四类变异带型。
姚培娟等: 欧石楠体细胞胚发生过程中的DNA甲基化 1419
1993)、刺五加(Chakrabarty等2003)、油棕(Kubis
等2003)以及大麦(Li等2007)等中的报道一致, 与
Kubis等(2003)利用HPLC对油棕愈伤组织和再生
苗甲基化变异的检测结果一致 , 但与在香蕉
(Peraza-Echeverria等2001)和豌豆(Smykal等2007)
中的研究结论不同。
欧石楠胚性愈伤组织的全基因组DNA甲基化
水平虽然有所降低, 但其外侧胞嘧啶甲基化水平
却有所增加, 再生苗中也持续此变化(图3); 这与苗
高健(2009)在水稻中的研究结论一致。而Xu等
(2004)在玫瑰愈伤组织中的检测结果表明, 其外侧
胞嘧啶甲基化水平显著下降, 与本实验结论存在
分歧; 再生苗又恢复到之前的DNA甲基化模式, 与
欧石楠再生苗诱导形成过程中甲基化水平变异模
式一致。关于愈伤组织形成过程中DNA甲基化水
平的变异虽然存在多种报道, 但再生苗诱导发生
过程中大多数变异逐渐恢复的趋势却是一致的。
这可能与愈伤组织培养过程中所用的外源生长调
节剂有关。
对欧石楠组织培养发生的胚性愈伤组织和诱
导形成的再生苗胞嘧啶甲基化变异模式的具体类
型进行统计分析, 在发生变异的175条带中, 有62
条(35.43%)在胚性愈伤组织形成过程中发生变异
的条带又恢复到之前大田苗的甲基化模式, 与聂
丽娟等(2008)对菊花的研究结果一致; 另一方面,
175条变异带中33.71%的变异带型可在再生苗中
持续下去, 大部分为外侧胞嘧啶甲基化, 与番茄中
的研究结论(Smulders等1995)一致。Smulders等
(1995)利用探针技术对番茄愈伤组织和再生苗叶
片甲基化模式进行比较, 发现没有发生内侧胞嘧
啶甲基化变异, 仅存在外侧胞嘧啶甲基化变异, 且
在再生苗中可以部分持续, 遗传给后代。本研究所
采用的技术虽与之不同, 但获得一致的结论, 进一
步证明, 胚性愈伤组织发生过程中存在此类甲基
化变异现象, 且可部分遗传, 然而其机理有待进一
步研究。
参考文献
鲍智娟(2009). 植物组织培养中体细胞无性系变异的研究进展. 白
城师范学院学报, 23 (6): 21~25
李际红, 邢世岩, 王聪聪, 张倩, 付茵茵(2011). 银杏基因组DNA甲
基化修饰位点的MSAP分析. 园艺学报, 38 (8): 1429~1436
李际红, 邢世岩, 姚培娟, 谭起航, 王海林(2012). 欧石楠体细胞胚发
生和植株再生. 植物生理学报, 48 (11): 1043~1049
苗高健(2009). 水稻胚性愈伤组织诱导和植株再生伴随DNA胞嘧
啶甲基化的减少和恢复[学位论文]. 长春: 东北师范大学
聂丽娟, 王子成, 何艳霞(2008). 菊花组织培养继代过程中的DNA
甲基化变化. 园艺学报, 35 (11): 1689~1694
沙文勇(2002). 欧洲常绿地被植物——欧石楠和彩萼石楠. 中国花
卉园艺, (9): 14~15
魏华丽, 吴涛, 杨文华, 李万峰, 张俊红, 齐力旺, 韩素英(2011). 落叶
松体细胞胚胎发生过程中DNA甲基化模式变化分析. 东北林
业大学学报, 39 (2): 33~37
Chakrabarty D, Yu KW, Paek KY (2003). Detection of DNA
methylation changes during somatic embryogenesis of Siberian
ginseng (Eleuterococcus senticosus). Plant Sci, 165: 61~68
Gao X, Yang D, Cao D, Ao M, Sui X, Wang Q, Kimatu JN, Wang L
(2010). In vitro micropropagation of Freesia hybrida and the
assessment of genetic and epigenetic stability in regenerated
plantlets. J Plant Growth Regul, 29 (3): 257~267
Kaeppler SM, Kaeppler HF, Rhee Y (2000). Epigenetic aspects of
somaclonal variation in plants. Plant Mol Biol, 43: 179~188
Kaeppler SM, Phillips PL (1993). Tissue culture-induced DNA
methylation variation in maize. Proc Natl Acad Sci USA, 90:
8773~8776
Khoddamzadeh AA, Sinniah UR, Kadir MA, Kadzimin SB, Mahmood
M, Sreeramanan S (2010). Detection of somaclonal variation
by random amplified polymorphic DNA analysis during
micropropagation of Phalaenopsis bellina (Rchb.f.) Christenson.
Afr J Biotechnol, 9 (40): 6632~6639
Kubis SE, Castilho AMMF, Vershinin AV, Heslop-Harrison JS (2003).
Retroelements, transposons and methylation status in the
genome of oil palm (Elaeis guineensis) and the relationship to
somaclonal variation. Plant Mol Biol, 52: 69~79
Li XL, Yu XM, Wang NN, Feng QZ, Liu LX, Shen JL, Liu B (2007).
Genetic and epigenetic instabilities induced by tissue culture in
wild barley (Hordeum brevisubulatum (Trin.) Link). Plant Cell
Tiss Org Cult, 90: 153~168
Mallaya NP, Ravishankar GA (2013). In vitro propagation and genetic
fidelity study of plant regenerated from inverted hypocotyl
explants of eggplant (Solanum melongena L.) cv. Arka Shirish. 3
Biotech, 3 (1): 45~52
Peraza-Echeverria S, Herrera-Valencia VA, Tames-Kay A (2001).
Detection of DNA methylation changes in micropropagated
banana plants using methylation-sensitive amplification
polymorphism (MSAP). Plant Sci, 161: 359~367
Peredo EL, Revilla MA, Arroyo-Garcia R (2006). Assessment of genetic
and epigenetic variation in hop plants regenerated from sequential
植物生理学报1420
subcultures of organic calli. J Plant Physiol, 163: 1071~1079
Prakash AP, Kush A, Lakshmanan P, Kumar PP (2003). Cytosine
methylation occurs in a CDC48 homologue and a MADS-
box gene during adventitious shoot induction in Petunia leaf
explants. J Exp Bot, 54 (386): 1361~1371
Smulders MJM, Rus-Kortekaas W, Vosman B (1995). Tissue culture-
induced DNA methylation polymorphisms in repetitive DNA of
tomato calli and regenerated plants. Theo Appl Genet, 91: 1257~1264
Smykal P, Valledor L, Rodriguez R, Griga M (2007). Assessment of
genetic and epigenetic stability in long-term in vitro shoot culture
of pea (Pisum sativum L.). Plant Cell Rep, 26: 1985~1998
Wang QM, Wang YZ, Sun LL, Gao FZ, Sun W, He J, Gao X, Wang L
(2012). Direct and indirect organogenesis of Clivia miniata and
assessment of DNA methylation changes in various regenerated
plantlets. Plant Cell Rep, 31 (7): 1283~1296
Xiong LZ, Xu GG, Saghai Maroof MA, Zhang Q (1999). Patterns of
cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines
detected by a methylation sensitive amplification polymorphism
technique. Mol Gen Genet, 261: 439~446
Xu M, Li X, Schuyler SK (2004). DNA-methylation alterations and
exchanges during in vitro cellular differentiation in rose (Rosa
hybrida L.). Theor Appl Genet, 109 (5): 899~910