全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月 909
收稿 2010-04-12 修定 　2010-07-07
资助 浙江省重大科技专项(2008C02004-1)和浙江省林业科技
重点项目(20 06SY0 1)。
* 通讯作者(E-mail: zktong@zjfc.edu.cn; Tel: 0571-63732746)。
光皮桦ACC氧化酶基因BlACO的克隆和表达分析
周厚君, 黄华宏, 林二培, 程龙军, 彭沙沙, 童再康 *
浙江农林大学林业与生物技术学院, 浙江临安 311300
提要: ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)氧化酶(ACO)是植物乙烯合成过程中的关键限速酶, 对乙烯的合成具有
重要的调控作用。以光皮桦茎叶组织提取的RNA为模板, 据已报道的 ACO同源序列设计简并引物, 通过RT-PCR扩增获
得部分基因片段, 结合 5, 3 RACE方法从光皮桦中扩增出 1个 ACO的全长 cDNA序列。该基因 cDNA全长 1 262 bp, 具有
一个 957 bp的完整开放阅读框架, 编码含 318个氨基酸的蛋白。与其他植物中的 ACO基因进行同源性比对的结果显示,
BlACO蛋白与欧洲白桦的同源性最高, 达到97%。该基因在光皮桦的雄花和雌花中表达量较高, 而在茎中的表达量较低。
关键词: 光皮桦; ACO; 基因克隆; 表达
Cloning and Expression Analysis of ACC Oxidase Gene BlACO in Betula
luminifera H. Winkl.
ZHOU Hou-Jun, HUANG Hua-Hong, LIN Er-Pei, CHENG Long-Jun, PENG Sha-Sha, TONG Zai-Kang*
School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang Agricultural & Forestry College, Lin’an, Zhejiang 311300, China
Abstract: 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase (ACO) is an important rate-limiting enzyme and
plays a critical role in regulation of the ethylene biosynthesis. The BlACO gene was cloned by RT-PCR and 5,
3 RACE methods, using mRNA template from stem and leaf of Betula luminifera, and the designed primers
according to the homologous sequences of ACO from other species. Sequence analysis showed that BlACO
cDNA was 1 262 bp length and contained a single open reading frame encoding a protein of 318 amino acids. The
results of homology comparison showed that BlACO protein shared a 97% homology with Betula pendula. The
expression of BlACO gene was higher in male flower and female flower of Betula luminifera, and lower in stem.
Key words: Betula luminifera; ACO; gene clone; expression
众所周知, 植物气体激素乙烯(ethylene)与果实
成熟密切相关。研究表明, 乙烯在植物整个生命周
期中起着重要作用, 不仅对植物的种子萌发、叶片
和花器官发育与衰老、果实成熟等有影响; 同时与
逆境胁迫, 如渍水、病原菌入侵等方面有关; 而且
还参与植物细胞的程序性死亡、促进花凋谢和
DNA 降解等。
高等植物中乙烯生物合成途径十分清楚
(Bleecker 和 Kende 2000)。前体物质蛋氨酸(2-
amino-4-methylmercaptobutyric acid, Met)在腺苷蛋
氨酸合成酶的作用下合成S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl
methionine, SAM), 经 ACC 合成酶(ACC synthase,
ACS)催化, SAM 转化成 1- 氨基环丙烷 -1- 羧酸(1-
aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC), 最后在
ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)的作用下, ACC转
化为乙烯(Kende 1993)。ACS 和 ACO 是乙烯生物
合成过程中 2 个关键的酶(Mathooko 1996)。
ACO是乙烯生物合成的关键限速酶, 该基因的
表达是非组成型的, 其转录水平上的调控可能控制
着乙烯的合成速率(Balagué 等 1993)。现已从很多
种植物中克隆得到其全长序列(陈银华等 2005; 刘
鲜艳等 2008; 张亚丽等 2008; 周琳和董丽 2008;
Callahan等 1992; McGarvey和 Christoffersen 1992;
Lasserre 等 1996), 对 ACO 基因的研究也取得了一
定的进展。而且在番茄中又发现了 3 个与受伤、
花器发育、叶片和花朵衰老以及果实成熟相关的
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月910
ACO基因(Holdsworth等1987; Barry等1996; Blume
等 1997; Nakatsuka 等 1998; Llop-Tous 等 2000)。
光皮桦是一种材质优良的珍贵用材树种, 在我
国南方广泛分布。ACO 基因作为乙烯生物合成中
重要的酶基因, 而且又与逆境胁迫和花器官发育相
关, 克隆ACO基因对于研究其在光皮桦生长过程中
的作用打下基础, 同时对研究光皮桦逆境条件下的
基因表达和调控, 以及花器官发育等都具有重要意
义。
材料与方法
光皮桦(Betula luminifera H. Winkl.)材料取自
于浙江农林大学光皮桦良种繁育中心苗圃, 取茎叶
组织作为 mRNA 提取材料。
克隆用大肠杆菌Escherichia coli 5α为本实验
室保存; T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、克
隆载体 pGEM-T Easy Vector 为 Promega 公司产品;
RT-PCR试剂盒为Invitrogen公司产品; 引物由南京
金斯瑞生物工程技术服务有限公司合成; RACE试
剂盒为 ClonTech 产品。
光皮桦茎叶组织 m R N A 提取采用改进的
CTAB 法(侯夫云等 2008)。称取 150 mg 样品, 在
液氮中研成粉末转入到65 ℃水浴的700 μL CTAB
(2%)提取液中, 充分混匀。65 ℃水浴 20 min 后冷
却至室温。加等体积(700 μL)氯仿:异戊醇(24:1), 混
匀, 4 ℃下以 10 000×g 离心 10 min。小心吸取上
清液, 重复上述步骤, 直至中间层无白色絮状沉淀。
吸取上清液, 加1/4体积的LiCl (10 mol·L-1), 混匀后
于 4 ℃沉淀过夜, 然后 10 000×g 离心 20 min。弃
上清, 加入500 μL SSTE (1 mol·L-1 NaCl; 0.5% SDS;
1 mmol·L-1 EDTA, pH 8.0; 10 mmol·L-1 Tris-HCl, pH
8.0)溶解沉淀, 加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1), 混
匀, 4 ℃下 10 000×g离心 10 min; 取上清, 加入 2倍
体积无水乙醇-70℃沉淀至少 30 min, 或-20 ℃沉
淀 2 h。4 ℃下 12 000×g 离心 20 min。弃上清,
75% 的乙醇洗涤 2次, 吹干沉淀, 30 μL DEPC处理
的水溶解沉淀, 得到 RNA 样品。
本实验对从GenBank数据库获得的ACO基因
的编码序列通过 Vector NTI 9.0 软件模块 AlignX
(Informax, Invitrogen)做多序列比对, 根据序列保守
性, 设计基因保守区的 RT-PCR 引物 ACO-U 和
ACO-L, 序列分别为ACO-U: 5 TGGTGAAYCATGG-
GATWTCTC 3 和 ACO-L: 5 TTKRCCATCCTTG-
AGAAGCTG 3。比对的ACO基因编码序列: 欧洲
白桦(Betula pendula)登录号Y10749; 棉花(Gossypium
hirsutum)登录号 DQ116442; 桃(Prunus persica)登
录号 AF129074。
cDNA的合成及 PCR 扩增均参照试剂盒说明
书步骤进行。获得的片段以 T载体法克隆 PCR产
物, 阳性克隆送南京金斯瑞生物工程技术服务有限
公司测序。测序结果经 BLAST 检索序列数据库,
确定所克隆序列为光皮桦 ACO 基因编码序列。
根据RT-PCR片段的序列测定结果, 合成ACO
特异引物GSP1和GSP2, 分别用于克隆 cDNA的5
和 3 端序列。引物序列分别为 ACO-GSP1: 5 CT-
TGCCACCATGTCCTTGAAC 3 和 ACO-GSP2: 5
CTACCCTCCTTGCCCCAAACC 3。
5 RACE和 3 RACE具体步骤均按SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit (ClonTech)的说明书
进行, PCR 产物回收后经 T 载体克隆、测序, 并与
已克隆的 ACO 基因编码区拼接, 从而获得全长
cDNA序列。以拼接得到的 ACO 全长 cDNA 设计
引物, 再经 PCR 扩增, 凝胶电泳分析、测序, 验证
所获基因全长的准确性。据ACO全长 cDNA设计
的引物序列为: ACO-U: 5 TAGTGAGAGTAAG-
AGAGGTAG 3 和 ACO-L: 5 CTCACTCAAC-
AAAGAAACAGC 3。
用 http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz?-
page+applSelect 中 Nucleic Tools 分析推测 ACO 基
因编码蛋白质的氨基酸组成。用 ProtParam tool
(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)工具推
测其分子量和等电点(pI)。利用蛋白质保守结构
域推测工具SMART (http://smart.embl-heidelberg.de)
分析 ACO 的结构域, 并用 SignalP (http://www.cbs.
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月 911
dtu.dk/services/SignalP)软件对其 N 端进行分析。
同时用ExPASy的HNN (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html)预测其二级
结构进行, 用 MODWEB (https://modbase.compbio.
ucsf.edu/scgi/modweb.cgi)预测其三级结构。
分析光皮桦ACO与其他植物中同源蛋白序列
的同源性时, 在 NCBI 上用其 BLAST (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)分别将光皮桦的ACO蛋白质
序列与其他植物的ACO蛋白质序列进行同源性比
对。同时用AlignX软件对不同植物的ACO蛋白质
序列与光皮桦ACO蛋白质序列进行多重序列比对,
并用MEGA3 (Kumar等2004)软件构建不同植物的
ACO 基因进化树, 分析进化关系。
对光皮桦ACO基因进行不同组织的表达分析
时 , 分别用上述方法提取光皮桦雄花、雌花、
叶、芽、茎组织中的 RNA, 反转录成 cDNA。以
ACO的cDNA为模板设计半定量引物, 对该基因的
组织表达特异性进行分析。半定量 PCR 扩增产物
用 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析。半定量RT引
物序列分别为 Actin-RT-U: 5 GCTCAACCATG-
TTCCCTGGTATTG 3, Actin-RT-L: 5 GATAATG-
CAACCCGAGGAAGGACT 3, ACO-RT-U: 5
TGGA-GAAAGAAGCTGAGAAAGGC 3 和 ACO-
RT-L: 5 CAAAGCACAGCTAAACCACAAGC 3。
结果与讨论
1 光皮桦ACO基因的克隆与分析
以ACO的序列保守区域设计简并引物ACO-U
和 ACO-L, 经过 PT-PCR 扩增, 获得一个约 500 bp
的产物, 连接到 T 载体且转化 DH5α后, 挑取阳性
克隆测序。测序结果用 NCBI 的 BLAST程序检索
数据库, 显示该序列与欧洲白桦、棉花、桃的同
源性都达到90%以上, 尤其与欧洲白桦的序列同源
性最高, 达到 96%。确定该片段为光皮桦的 ACO
基因片段。用该序列设计5 RACE特异引物ACO-
GSP1和3 RACE特异引物ACO-GSP2, 分别用于基
因 5 端和 3 端序列的扩增。5 和 3 RACE 克隆产
物测序结果表明, 5 和 3 端序列与获得的光皮桦
ACO 基因编码序列有重叠, 为ACO基因mRNA的
5 和 3 端序列。经拼接, 得到光皮桦 ACO 基因完
整的 cDNA 序列, 共 1 262 bp, GenBank 登录号为
HM357150。该基因全长扩增(图 1)和测序结果验
证了该基因的准确性。
图 1 光皮桦 ACO 全长 cDNA RT-PCR 产物的琼脂糖电泳
图谱
Fig.1 Agrose gel electropherogram of RT-PCR product of
ACO full-length cDNA in B. luminifera
M: DL2000, 条带由大到小分别为 2 000, 1 000, 750, 500,
250 和 100 bp。
2 光皮桦 ACO基因编码蛋白质的分析
光皮桦ACO基因全长cDNA序列含有1个957
bp的完整开放阅读框, 编码 318个氨基酸(图2), 预
测其分子量为 35.837 9 kDa, 等电点 pI 为 5.03。保
守结构域分析结果显示, 该蛋白含有一个 2OG-
FeII_Oxy结构域。SignalP 软件分析该蛋白为非分
泌蛋白, 不具有信号肽结构。其二级结构(图 3)存
在12个螺旋区(helix)和13个折叠区域(sheet), 其余
部位均为无规则卷曲(coil)。预测的三级结构(图4)
通过 Swiss-pdbViewer 4.0.1 软件显示。
3 不同物种间ACO基因的同源性分析
BLAST显示, 在核苷酸水平上, 光皮桦ACO基
因与桦木科的欧洲白桦(Y10749)、桃(AF129074)、
棉花(DQ116442)的相似性高达 96%、85% 和
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月912
图 2 光皮桦 ACO 基因的 cDNA序列及其推测的氨基酸序列
Fig.2 cDNA sequence of ACO gene and its deduced protein in B. luminifera
用﹡号标出的为终止密码子, 下划线处碱基编码 2OG-FeII_Oxy 结构域。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月 913
图 3 光皮桦 ACO 蛋白二级结构
Fig.3 Secondary structure of ACO protein in B. luminifera
图 4 光皮桦 ACO 蛋白三级结构
Fig.4 Tertiary structure of ACO protein in B. luminifera
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月914
图 5 光皮桦 ACO 蛋白序列及其他植物同源蛋白序列的比对
Fig.5 Comparison of ACO in B. luminifera and its homologus proteins from other plants
欧洲白桦(Betula pendula, CAA71738)、毛果杨(Populus trichocarpa, XP_002316589)、棉花(Gossypium hirsutum, AAZ83342)、
番木瓜(Carica papaya , AAC98808)、柿树(Diospyros kaki, BAB89352)。
81%。对不同植物中已克隆到的ACO蛋白进行多
序列比对, 其氨基酸序列的同源性也是与欧洲白桦
(CAA71738)的最高, 为 97%, 棉花(AAZ83342)为
85%, 番木瓜(Carica papaya, AAC98808)为84% (图
5 ) 。
用MEGA3软件的邻接法(neighbor-joining, NJ)
构建不同植物ACO蛋白的系统发育树。从构建的
发育树中可以看出, 同属桦木科的欧洲白桦和光皮
桦亲缘关系最近, 烟草与柿树的亲缘关系比较近, 而
毛果杨与棉花的亲缘关系较近(图 6)。
4 光皮桦不同器官中ACO基因的表达分析
半定量RT-PCR分析结果表明, 光皮桦ACO基
因在雄花、雌花、叶、芽、茎中均有表达, 以
雄花和雌花中表达量较高, 茎中表达量较低(图7)。
雄花和雌花作为内轮花器官, 可能是导致ACO基因
在其中表达量相对较高的重要原因。另一方面, 雄
花形成于头年7月份, 而采集的雄花材料已处于休
眠末期, 相对于幼嫩的雌花和幼嫩的叶、芽、茎
组织而言, 其表达量也会表现相对较高。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 9 期, 2010 年 9 月 915
图 6 植物 ACO 蛋白的系统发育树
Fig.6 Phylogenetic tree of ACO protein in different plants
欧洲白桦(Betula pendula, CAA71738)、毛果杨(Populus
trichocarpa , XP_002316589)、棉花(Gossypium hirsutum ,
AAZ8 33 4 2)、番木瓜(Ca ric a p a p ay a , AAC9 8 8 08 )、柿树
(Diosp yro s kak i , BAB8 93 52 )、烟草(Nico tia na taba cu m ,
CAA58232)、拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_172665)、葡
萄(Vi t is v in i fe r a , XP_ 0 0 22 7 3 4 30 )、桃(Pr u nu s p e r sic a ,
AAF36484)、番茄(Solanum lycopersicum , ABP68407)、苹
果(Malus x domestica, BAC53656)、白三叶草(Trifolium repens,
AA D 2 8 1 9 7 )、沙梨(Py r u s p y r i f o l i a , BAD 6 1 0 0 0 )、枇杷
(Erio bo tr y a jap on ica , ACU8 28 5 4)、蒺藜苜蓿(Med ic ag o
truncatula, AAL35971)、梅(Prunus mume, BAA90550)、甘
蔗(Ipomoea nil, ABL67954)、毛竹(Phyllostachys pubescens,
BAB32502)、绿茶(Camellia s inensis , ABI33224)、向日葵
(Helianthus annuus, AAB71421)、郁金香(Tulipa gesneriana ,
BAE20195)、橡胶树(Hevea brasiliensis, CAN85569)。
图 7 光皮桦 A C O 基因在雄花、雌花、叶、芽、茎中
的表达分析
Fig.7 Analysis of ACO gene expression in male flower,
female flower, leaf, bud and stem in B. luminifera
1: 雄花; 2: 雌花; 3: 叶; 4: 芽; 5: 茎。
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