全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1099~1104 1099
收稿 2013-06-27　　修定 2013-08-09
资助 国家自然科学基金(31272501)。
* 通讯作者(E-mail: sdzlc2008@126.com; Tel: 0512-65882833)。
盐胁迫对绿豆下胚轴氧化还原态的影响
顾福根1, 赵林川1,*, 朱成1, 吴勇2, 万华星2
1苏州大学基础医学与生物科学学院, 江苏苏州215123; 2苏州科铭生物技术有限公司, 江苏苏州215123
摘要: 以150 mmol·L-1 NaCl对绿豆下胚轴进行胁迫处理, 测定其长度和鲜重以及GSH/GSSG、AsA/DHA、NADH/NAD+、
NADPH/NADP+比值。结果表明, 对照和处理48 h时上述指标分别相当于0 h时的493.1%与206.9%、661.0%与308.2%、
118.1%与72.2%、444.4%与44.4%、96.6%与194.3%和97.1%与154.4%。可见, 盐胁迫处理显著抑制绿豆下胚轴生长可能与
其氧化还原态的显著改变有关。
关键词: 绿豆; 盐胁迫; 氧化还原态; 谷胱甘肽; 抗坏血酸
Effects of Salt Stress on Redox Status of the Hypocotyls of Vigna radiata L.
GU Fu-Gen1, ZHAO Lin-Chuan1,*, ZHU Cheng1, WU Yong2, WAN Hua-Xing2
1School of Biology and Basic Medicine Science, Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215123, China; 2Suzhou Comin
Biotechnology Co., Ltd., Suzhou, Jiangsu 215123, China
Abstract: To investigate the relationship between salt stress and redox status in the hypocotyls of Vigna
radiata, the levels of length and fresh weight along with the ratios of reduced and oxidized glutathione (GSH/
GSSG), ascorbic acid (AsA/DHA), nicotinamide adenine dinucleotide (NADH/NAD+) and nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate (NADPH/NADP+) were determined in the three-old-day seedlings treated with
150 mmol·L-1 NaCl for 48 h. Above parameters of control and treatment at 48 h were equal to 493.1% vs
206.9%, 661.0% vs 308.2%, 118.1% vs 72.2%, 444.4% vs 44.4%, 96.6% vs 194.3% and 97.1% vs 154.4% of
those at 0 h, respectively. The results suggested that the marked inhibition of growth in the hypocotyls of V.
radiata by salt stress might be related to the significant variations of redox status.
Key words: mungbean; salt stress; redox status; glutathione; ascorbic acid
盐胁迫(salt stress)主要通过引发渗透胁迫、
离子毒害和氧化胁迫对植物造成伤害, 从而严重
影响植物的生长和发育 ; 植物通过调节气孔开
度、合成渗透调控物质、区隔过量离子和清除活
性氧(reactive oxygen species, ROS)等响应来减轻
胁迫伤害(陈莎莎和兰海燕2011; Miller等2010;
杨少辉等2006)。
生物体内ROS主要来自呼吸电子传递渗漏, 大
约0.1%的线粒体耗氧量转换为ROS (Hernandez-
Garcia等2010)。吡啶核苷酸(nicotinamide adenine
dinucleotide, NAD)包括还原型(NADH)和氧化型
(NAD+)两种, NADH和NAD+分别是呼吸电子传
递链和糖酵解-三羧酸循环的氢供体和氢受体。
NADH/NAD+比值在呼吸作用调控中具有重要
作用, 因此其变化也与ROS生成密切相关。磷酸
吡啶核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide pho-
sphate, NADP)也包括还原型(NADPH)和氧化型
(NADP+)两种类型, NADPH是还原性生物合成和
抗氧化的氢供体, NADP+是磷酸戊糖途径氢受体
(Ying 2008)。谷胱甘肽(glutathione, GSH)和抗
坏血酸(ascorbic acid, AsA)参与ROS清除, 生成氧
化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)和脱
氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid, DHA)。NADPH还
原GSSG再生为GSH, 而GSH可以进一步还原
DHA再生为AsA (Foyer和Noctor 2011; Lu 2009)。
可见, 从ROS代谢角度来看, GSH/GSSG和AsA/
DHA比值能够反映植物所处氧化还原状态 , 而
且其变化又与NADH/NAD+和NADPH/NADP+比
值变化密切相关。
我们在预实验中发现150 mmol·L-1 NaCl处理
可以显著抑制绿豆下胚轴生长, 同时又不至于引
起幼苗死亡, 因此, 本文采用此盐浓度对绿豆下胚
植物生理学报1100
轴进行胁迫处理, 比较了对照和盐胁迫处理下其
长度、鲜重、GSH/GSSG、AsA/DHA、NADH/
NAD+和NADPH/NADP+的差异, 以期揭示盐胁迫
抑制绿豆下胚轴生长与其氧化还原态变化的关系。
材料与方法
1 实验材料
绿豆(Vigna radiata L.)种子购自苏州欧尚超
市(星塘店), NaCl (分析纯)购自国药集团化学试
剂有限公司, GSH、GSSG、AsA、DHA、NADH、
NAD+、NADPH和NADP+含量测定试剂盒由苏
州科铭生物技术有限公司提供。
2 处理
绿豆种子经升汞(HgCl2)溶液常规消毒后在20
℃
中无菌萌发, 3 d后选取长势一致的幼苗, 分别转移
到含有0 mmol·L-1 (对照)和150 mmol·L-1 NaCl (处
理)的琼脂培养基上, 分别在0、24和48 h取对照和
处理的下胚轴。每个处理每个取样时间点取50根
下胚轴, 其中20根用于测定其长度和鲜重, 并且计算
其平均值和标准误; 其余30根立即进行液氮速冻,
然后在–80 ℃冰箱中保存, 用于生化指标测定。
3 几种物质含量测定方法
分别按照上述各种试剂盒说明书, 测定绿豆
下胚轴中GSH、GSSG、AsA、DHA、NADH、
NAD+、NADPH和NADP+含量, 进而计算GSH/
GSSG、AsA/DHA、NADH/NAD+和NADPH/NADP+
比值, 以及总谷胱甘肽(tGSH)、总抗坏血酸(tAsA)、
NAD和NADP含量。[tGSH]=[GSH]+2 [GSSG];
[tAsA]=[AsA]+[DHA]; [NAD]=[NADH]+[NAD+];
[NADP]= [NADPH]+[NADP+] (万华星等2012; 王
启龙等2012; 姚金美等2012; Foyer和Noctor 2011)。
所有测定重复3次。
4 数据统计与分析
采用ANOVA和Student’s Newman-Keuls post
hoc test (SPSS Inc., USA)比较对照和处理绿豆下胚
轴中G S H、G S S G、A s A、D H A、N A D H、
NAD+、NADPH和NADP+含量的差异显著性, P<
0.05为差异显著。
实验结果
1 盐处理对绿豆下胚轴生长的影响
图1-A显示, 与0 h相比, 48 h时对照和处理的下
胚轴长度都显著增加, 分别增加了393.1%和106.9%,
但是处理的增加程度显著小于对照(P<0.05)。图
1-B显示, 与0 h相比, 48 h时对照和处理的下胚轴鲜
重都显著增加, 分别增加了561.0%和208.2%, 但是
处理的增加程度极显著小于对照(P<0.01)。
2 盐处理对绿豆下胚轴GSH含量变化的影响
图2显示, 处理的GSH含量极显著低于对照
(P<0.01), GSSG含量两者差异不显著, GSH/GSSG
比值和tGSH含量均显著低于对照(P<0.05)。
3 盐处理对绿豆下胚轴AsA含量变化的影响
图3显示, 处理的AsA含量和AsA/DHA比值均
极显著低于对照(P<0.01), 而DHA含量极显著高于
对照(P<0.01), tAsA含量于处理24 h时显著高于对
照(P<0.05), 48 h时极显著高于对照(P<0.01)。
4 盐处理对绿豆下胚轴NAD含量变化的影响
图4显示, 处理的NADH含量略高于对照, 但
图1 盐胁迫下绿豆下胚轴长度和鲜重的变化
Fig.1 Changes in the length and fresh weight in V. radiata hypocotyls under salt stress
Student’s test检验差异显著性, **表示差异极显著(P<0.01), *表示差异显著(P<0.05); 图2~5同此。
顾福根等: 盐胁迫对绿豆下胚轴氧化还原态的影响 1101
图3 盐胁迫下绿豆下胚轴AsA、DHA、tAsA含量以及AsA/DHA比值的变化
Fig.3 Changes in levels of AsA, DHA and tAsA, and AsA/DHA ratio in V. radiata hypocotyls under salt stress
图2 盐胁迫下绿豆下胚轴GSH、GSSG、tGSH含量以及GSH/GSSG比值的变化
Fig.2 Changes in levels of GSH, GSSG and tGSH, and GSH/GSSG ratio in V. radiata hypocotyls under salt stress
植物生理学报1102
是差异不显著(P>0.05); 处理24 h时NAD+含量显著
低于对照(P<0.05), 48 h时极显著低于对照(P< 0.01);
NADH/NAD+比值于处理24和48 h分别显著(P<
0.05)和极显著(P<0.01)高于对照; 处理的NAD(H)
含量显著低于对照(P<0.05)。
5 盐处理对绿豆下胚轴NADP含量变化的影响
图5显示, 处理24 h时NADPH含量、NADPH/
NADP +比值和NADP(H)含量均显著高于对照
(P<0.05), 处理48 h时极显著高于对照(P<0.01);
NADP+含量都略有升高, 但是两者之间没有显著
差异(P>0.05)。
讨　　论
与对照相比, 150 mmol·L-1 NaCl连续处理48 h
显著降低了绿豆下胚轴长度和鲜重的增加程度,
表明盐胁迫显著抑制绿豆下胚轴的生长。同时,
盐胁迫下绿豆下胚轴的GSH/GSSG和AsA/DHA比
值均比对照有所下降, 其中AsA/DHA比值下降程
度远远超过GSH/GSSG比值。GSH/GSSG和AsA/
DHA比值是细胞氧化还原态的动态指标, 其比值
升高表明细胞向还原态转移, 而下降表明细胞向
氧化状态转移(Meng等2011)。因此, GSH/GSSG和
AsA/DHA比值下降表明盐胁迫促使绿豆下胚轴氧
化还原态向氧化状态转移。可见, 盐胁迫显著抑制
绿豆下胚轴生长与其氧化还原态的显著变化有关。
与对照相比, 盐胁迫下绿豆下胚轴在GSH/
GSSG比值下降的同时, 其tGSH和GSH含量都显著
减少, 但是GSSG含量的差异不显著。由于GSH/
GSSG比值取决于GSH氧化还原循环和γ-谷氨酰循
环(万华星等2012), 因此, 盐胁迫导致GSH/GSSG
比值下降不是因为GSH氧化还原循环偏向于GSH氧
化, 而是由于γ-谷氨酰循环偏向于GSH降解所致。
盐胁迫下绿豆下胚轴在AsA/DHA比值比对照
下降的同时, 其tAsA和DHA含量均略有增加, 而
AsA含量显著下降。AsA/DHA比值主要取决于AsA
合成与降解和氧化与还原(Foyer和Noctor 2011)。
可见, 盐胁迫导致AsA/DHA比值下降不是因为
AsA合成小于降解, 而是由于AsA氧化还原循环偏
向于氧化。
与对照相比, 盐胁迫下绿豆下胚轴在NADH/
图4 盐胁迫下绿豆下胚轴NADH、NAD+、NAD(H)含量以及NADH/NAD+比值的变化
Fig.4 Changes in levels of NADH, NAD+ and NAD(H), and NADH/NAD+ ratio in V. radiata hypocotyls under salt stress
顾福根等: 盐胁迫对绿豆下胚轴氧化还原态的影响 1103
NAD+比值升高的同时, 其NAD含量下降, NADH
含量无显著差异, NAD+含量显著下降。可见, NADH/
NAD+比值升高主要是因为NAD+含量显著下降。
NAD含量取决于NAD+的合成与降解及NAD+磷酸
化与NADP +脱磷酸化的平衡 , 与NAD +还原与
NADH氧化无关(王启龙等2012; 姚金美等2012)。
我们注意到, 与对照相比, 盐胁迫下绿豆下胚轴
NAD含量下降的同时, NADP含量升高, 说明NAD
含量下降主要与其NAD+磷酸化能力大于NADP+
脱磷酸化能力有关。
盐胁迫下绿豆下胚轴的NADPH/NADP+比值
比对照有所升高, 同时, NADP和NADPH含量也升
高, 而NADP+含量仅略有升高, 变化不显著。可见,
NADPH/NADP+比值升高主要是由于NADPH含量
升高所致。如前所述, 盐胁迫下绿豆下胚轴NAD+
磷酸化能力大于NADP+脱磷酸化能力, 从而导致
其NADP含量升高。
细胞氧化还原态变化与ROS产生和清除失衡
有关。当ROS产生能力超过其清除能力时, GSH/
GSSG和AsA/DHA比值下降, 导致细胞氧化还原态
向氧化状态转移。一方面, 盐胁迫下绿豆下胚轴
NADH/NAD+比值显著升高。NADH主要通过呼
吸电子传递链传递脱氢再生NAD+, 呼吸耗氧也主
要发生在呼吸电子传递链上。因此, NADH/NAD+
比值升高将提高呼吸电子传递链传递强度, 导致
呼吸耗氧量增加(Ying 2008)。大约0.1%的线粒体
耗氧量用于ROS生成(Hernandez-Garcia等2010)。
因此, 盐胁迫下绿豆下胚轴NADH/NAD+比值升高
导致ROS产生能力提高, 从而使细胞氧化还原态向
氧化状态转移。另一方面, 盐胁迫下绿豆下胚轴
NADPH/NADP+比值升高。NADP+主要通过磷酸
戊糖途径还原生成NADPH, NADPH可以还原
GSSG生成GSH, GSH进一步还原DHA生成AsA
(Foyer和Noctor 2011; Lu 2009; Ying 2008)。盐
胁迫下绿豆下胚轴ROS产生量增加, 导致GSH和
AsA氧化。为了还原再生GSH和AsA, 就必须加强
磷酸戊糖途径, 从而增加NADPH供应量。可见, 盐
胁迫下绿豆下胚轴NADPH/NADP+比值升高是一
种对ROS产生增强的适应。
近年来, 盐胁迫下植物信号转导网络系统的
研究取得了一定进展, ROS广泛参与盐胁迫的信号
感知、信号转导和耐盐生理响应等全过程(陈莎莎
图5 盐胁迫下绿豆下胚轴NADPH、NADP+、NADP(H)含量和NADPH/NADP+比值的变化
Fig.5 Changes in levels of NADPH, NADP+ and NADP(H), and NADPH/NADP+ ratio in V. radiata hypocotyls under salt stress
植物生理学报1104
和兰海燕2011; Miller等2010)。植物ROS代谢十分
复杂, 而氧化还原态变化能够综合反映植物所处
的氧化胁迫状态。本研究发现盐胁迫下绿豆下胚
轴在生长受到显著抑制的同时, 其氧化还原态向
氧化态转移。因此, 氧化还原态变化的研究可能
为进一步探讨盐胁迫下植物信号转导网络系统中
ROS作用机制提供了新的切入点。
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