全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (8): 815~820 815
收稿 2012-05-14　　修定 2012-06-25
资助 国家自然科学基金(30971715)、中国博士后科学基金
(20110490907)和广东省科技计划(2011B020301009)。
* 通讯作者(E-mail: liling@scnu.edu.cn; Tel: 020-85211378)。
水分胁迫下花生叶片AhNCED1蛋白表达与气孔开度的变化
胡博, 吕滟, 肖素妮, 李玲*
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州510631
摘要: 研究了水分胁迫下不同花生抗旱品种叶片气孔开度和相对含水量变化, 分析了AhNCED1基因和AhNCED1蛋白进行
表达情况, 发现水分胁迫下, 叶片相对含水量下降, 叶片气孔开度降低, 叶片AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达增强。抗
旱品种较之敏旱品种在响应水分胁迫初期时(1 h) AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达较强, 叶片气孔开度下降较快, 引发
气孔关闭, 其叶片相对含水量较高, 保水能力较强。ABA合成抑制剂naproxen处理后, 叶片AhNCED1基因和AhNCED1蛋白
的表达减弱, 气孔开度快速增加, 水分胁迫下花生叶片AhNCED1蛋白表达可能影响气孔开闭。
关键词: AhNCED1蛋白; 花生; 水分胁迫; 气孔开度
The Changes of AhNCED1 Protein Expression and Stomatal Aperture in
Peanut Leaves under Water Stress
HU Bo, LÜ Yan, XIAO Su-Ni, LI Ling*
Guangdong Provincial Key Lab of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal Univer-
sity, Guangzhou 510631, China
Abstract: This experiment study on the drought-resitive species and drought-sensitive species Arachis hypo-
gaea under water stress conditions, the changes of AhNCED1 protein expression and its effect on stomatal ap-
erture in four-leaf stage. The results showed that, under water stress conditions, relative water content of leaves
decresed, stomatal aperture of leaves decresed, AhNCED1 protein expression and AhNCED1 gene expression
increased. Compared with drought-sensitive species, AhNCED1 protein expression and AhNCED1 gene expres-
sion of the drought-resitive species were higher, stomatal aperture of leaves decrese faster so that it have strong
water holding abilities. In conclusion, stomatal closure has relevance to AhNCED1 protein expression under
water stress conditions. Treating with naproxen, the expression of AhNCED1 significantly inhibited, the sto-
matal closure increased rapidly. The changes of AhNCED1 protein expression may affect stomatal closure of
leaves.
Key words: AhNCED1 protein; Arachis hypogaea; water stress; stomatal aperture
ABA参与调控植物发育的诸多重要过程, 尤
其作为触发植物对逆境胁迫应答反应的传递体,
参与调控植物对逆境胁迫如干旱、高盐、低温等
产生的应答(Weiner等2010)。9-顺式环氧类胡萝卜
素二加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,
NCED)是ABA合成途径的关键酶, 其表达水平与
内源ABA含量相关(Fujii和Zhu 2009), 调节果实
成熟和植物在胁迫条件下体内的ABA合成(Iuchi
等2000)。玉米VP14基因(即NCED)的诱导表达与
植物A B A水平的增加成平行关系 ( S c h r a u t等
2004)。NCED是多基因编码蛋白, 玉米、大豆、
拟南芥、番茄、甜橙及鳄梨的NCED氨基酸序列
有60%同源(Hu等2010a)。
干旱胁迫可诱导NCED基因的表达。番茄、
鳄梨、玉米和菜豆在干旱胁迫条件下NCED表达
与体内ABA的变化一致(Herde等1999; Chernys和
Zeevaart 2000; Qin和Zeevaart 2002), 即诱导NCED
基因表达增加了ABA的积累。本课题组前期工作
从干旱诱导的耐旱花生中克隆得到其NCED编码
基因, 命名为AhNCED1, 水分胁迫时AhNCED1基
因表达增强与ABA含量的提高变化一致 , 外施
ABA转化拟南芥129B08/nced3突变体能恢复其表
型, 说明AhNCED1基因参与水分胁迫时ABA的生
植物生理学报816
物合成(Wan和Li 2006)。过表达AhNCED1可提高
转基因花生的干旱抗性(覃铭等2010)。ABA引起
的气孔关闭, 其机制已受到广泛深入的研究, 拟南
芥叶片在水分胁迫下, ABA含量增加以及ABA诱
导基因(ATHB6和RD29B)表达增强, 激活ABA生物
合成引起气孔关闭(Kim等2010)。但水分胁迫下
ABA合成关键酶AhNCED1的表达与气孔开度变
化相关方面的研究仍不清楚。
本文研究花生在响应水分胁迫(30% PEG
6000)过程中植株体内AhNCED1蛋白表达与叶片
气孔开度的变化, 为了解AhNCED1蛋白在花生响
应水分胁迫影响的抗旱性提供基础。
材料与方法
1 材料
花生(Arachis hypogaea L.)抗旱品种‘粤油7’和
敏旱品种‘汕优523’, 由广东省农业科学院作物研
究所提供。选取饱满种子浸泡过夜, 播种于盛有
浇透水的蛭石和泥炭土(1:1)的直径为10 cm的圆形
花盆中, 培养至四叶期。将培养至四叶期的花生
植株根部(1)置于30% PEG6000溶液中0、1、3、
7、10、24、48 h, (2)置于1 mmol·L-1萘普生
(naproxen, Nap)溶液中24 h, (3)置于含1 mmol·L-1
Nap的30% PEG6000溶液中24 h, 然后取叶片作为材
料。
2 方法
2.1 叶片相对含水量测定
取水分胁迫下花生不同抗旱品种四叶期叶片
洗净吸干称鲜重, 105 ℃杀青致死, 80 ℃烘至恒重,
冷却至室温, 称取干重, 用鲜重减去干重再除以鲜
重来计算叶片相对含水量。
2.2 叶片气孔观察
将花生叶片叶背切取1.0 cm×0.5 cm的长方形
叶块, 置于4%戊二醛溶液固定, 4 h, 0.1 mol·L-1磷
酸缓冲液冲洗3次(共2 h), 锇酸处理3 h, 蒸馏水洗3
次, 醇溶液梯度脱水后至于冰箱冻结过夜。将干
燥后的叶样用导电胶粘贴在电镜专用铜台上, 置
于1B-5型离子溅射仪真空罩内, 6 mA电流喷镀白
金4 min后, JSM-T300扫描电镜观察。对不同处理
的叶片气孔进行观察拍照; 每个处理叶片取3个视
野, 每个视野取25个气孔, 用电镜标尺测量气孔宽,
计算气孔开度。
2.3 AhNCED1基因表达
叶片总RNA参照异硫氢酸胍法(Dixon等2006)
进行提取。制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶, 预电
泳后将RNA转移到硝酸纤维素膜(Hybone N+)上:
6 mA·cm-2恒流转移3 h; 80 ℃烘烤1 h, 4 ℃保存备
用。探针合成采用特异引物(上游引物5 GGATC-
CATGGCTGCTTACACGTGT 3 , 下游引物
5 GAGCTCAGTAGATAGGTAAAAGGT 3), 以
AhNCED1的cDNA为模板, 用[α32P]dCTP标记:
35 ℃杂交12~24 h; 28 ℃洗膜2次(每次30 min); 压
膜(防止污染磷屏), 压磷屏12 h。
2.4 AhNCED1蛋白表达
三氯醋酸-丙酮沉淀法(Endo等2008)提取总蛋
白, 由原核表达产物制备的抗血清作为第一抗体,
第二抗体为Sigma公司的碱性磷酸酶标记羊抗兔
IgG (IgG-AP), 采用Dupont公司的Polysereen PVDF
膜, NBT/BCIP显色。按照Hu等(2010b)的方法分析
AhNCED1蛋白表达, 两个品种蛋白上样量都为50 μg。
实验结果
1 水分胁迫下不同花生品种叶片相对含水量和气
孔开度的变化
‘粤油7’与‘汕优523’叶片的相对含水量在干
旱胁迫处理期间降低, ‘粤油7’在胁迫0至10 h叶片
的相对含水量明显减少, 下降了32.4%, 而在随后
的10 h至48 h间变化较小; ‘汕优523’叶片的相对含
水量持续下降, 处理7 h时叶片的相对含水量降幅
较大, 48 h时‘汕优523’叶片的相对含水量为‘粤油
7’的49.6% (图1)。
扫描电镜结果显示, 水分胁迫下‘粤油7’及‘汕
优523’的叶片气孔逐步关闭。水分胁迫0 h两者的
气孔开放程度大致相同, ‘粤油7’叶片气孔在水分
胁迫处理初期(1 h)即出现关闭(图2-A), 气孔开度
下降28.93%, 并且在随后的1 h至24 h间下降缓慢;
而‘汕优523’在水分胁迫处理初期(1 h)降低了
9.81%, 前7 h内气孔开度下降缓慢, 在胁迫处理后
期7 h至24 h间气孔开度下降较为明显(图2-B)。
2 水分胁迫下不同花生品种叶片AhNCED1蛋白
表达变化
Western blotting结果表明, 水分胁迫处理期间
胡博等: 水分胁迫下花生叶片AhNCED1蛋白表达与气孔开度的变化 817
‘粤油7’叶片AhNCED1蛋白表达明显强于‘汕优
523’, 其叶片在水分胁迫初期(1 h) AhNCED1蛋白
表达明显增强, 其后表达量略下降, 48 h又快速增
加; ‘汕优523’在水分胁迫初期AhNCED1蛋白的表
达没有明显的变化, 直到处理7 h有微弱增加(图3)。
3 水分胁迫下不同花生品种叶片AhNCED1基因
表达变化
Northern blotting结果显示 , ‘粤油7’叶片
AhNCED1基因的表达在水分胁迫初期(1 h)时明
显增强, 然后其表达量略有减少, 水分胁迫48 h
AhNCED1基因表达再度明显增强; ‘汕优523’在
水分胁迫初期表达没有明显的变化, AhNCED1基
因在水分胁迫24和48 h时表达才明显增强(图4)。
图1 水分胁迫下不同花生品种叶片相对含水量的变化
Fig.1 Changes in relative water content of peanut leaves
in different drought resistant cultivars under water stress
图2 水分胁迫下不同花生品种叶片气孔开度的变化
Fig.2 Stomatal aperture of peanut leaves in different drought resistant cultivars under water stress
A: 气孔关闭情况(标尺=10 μm); B: 气孔开度变化(每个处理叶片取3个视野, 每个视野取25个气孔, 电镜标尺测量气孔开度)。
植物生理学报818
4 Nap处理对不同花生品种叶片AhNCED1基因和
AhNCED1蛋白表达以及气孔开度的影响
水分胁迫24 h时 , 2个品种花生叶片内的
AhNCED1基因和AhNCED1蛋白的表达都明显增
加; 气孔开度急剧下降, ‘粤油7’下降79.36%, ‘汕优
523’下降50.27% (图5); Nap是ABA生物合成的抑
制剂, 当Nap处理后, 两个品种叶片中AhNCED1基
因和AhNCED1蛋白的表达急剧减弱, 几乎检测不
到(图5-A), 气孔开度增加(图5-C); 当Nap和PEG共
同处理下, ‘粤油7’的基因和蛋白表达明显强于‘汕
优523’, 气孔开度也较‘汕优523’小(图5)。
讨　　论
水分胁迫引起植物叶片气孔关闭, 蒸腾量减
少, 同时根系吸水量减少, 使植物体相对含水量降
低(Donner等2009)。本研究中抗旱花生品种‘粤油
7’在水分胁迫处理过程中相对含水量变化较小, 而
抗旱性弱品种‘汕优523’叶片在水分胁迫期间相对
含水量持续下降, 说明抗旱性强的品种保水能力
可能较强。实验表明, 抗旱性强品种在胁迫下叶
片ABA含量明显升高(刘吉升和李玲2006), 有利抑
制气孔开放或导致气孔关闭(Schachtman和Goodg-
er 2008), 本实验观察‘粤油7’在水分胁迫初期气孔
开度下降明显, 而‘汕优523’在中后期气孔开度明
显下降。说明抗旱性强的品种能响应水分胁迫较
快关闭气孔, 降低蒸腾量。同时发现30% PEG处理
1 h时耐旱品种气孔开度下降程度远远大于敏感品
种, 但处理7 h后两个品种叶片含水量才出现较大
差异(图1、2), 可能由于抗旱品种和敏旱品种在水
分胁迫初期都引发机体内的一系列变化应对外界
胁迫, 虽然初期两者之间气孔开度差异较大, 但叶
片气孔开度减小, 植株体内气孔蒸腾阻力增加, 到
减少叶片水分的散失量需要一定的时间, 敏旱品
种也通过降低气孔密度等变化维持胁迫初期叶片
的含水量, 因此水分胁迫处理1~3 h时叶片含水量
的差异远没有气孔开度差异显著。
ABA作为响应干旱胁迫的信号因子, 植物在
受到干旱胁迫时积累ABA, 并通过蒸腾作用运输
到叶肉细胞, 通过跨膜转运至保卫细胞中, 激活多
种耐受水分缺失胁迫基因的表达, 并调节气孔关
闭, 减少蒸腾作用(Hayashi和Kinoshita 2001)。
AhNCED1是花生ABA合成途径的关键酶。转
AhNCED1基因花生植株在水分胁迫下, AhNCED1
蛋白表达增强, ABA含量提高(覃铭等2010)。水分
图3 水分胁迫下不同花生品种叶片AhNCED1蛋白的表达变化
Fig.3 AhNCED1 protein expression of peanut leaves in different drought resistant cultivars under water stress
图4 水分胁迫下不同花生品种叶片AhNCED1基因的表达变化
Fig.4 AhNCED1 gene expression of peanut leaves in different drought resistant cultivars under water stress
胡博等: 水分胁迫下花生叶片AhNCED1蛋白表达与气孔开度的变化 819
图5 Nap和PEG处理对不同花生品种叶片AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达以及气孔开度的影响
Fig.5 Effects of Nap and PEG on AhNCED1gene, AhNCED1 protein expression and stomatal aperture
of peanut leaves in different drought resistant cultivars
A: Nap、PEG和Nap+PEG处理下‘粤油7’和‘汕优523’叶片AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达变化(Actin为AhNCED1基因表达内参);
B: Nap、PEG和Nap+PEG处理对‘粤油7’和‘汕优523’叶片气孔开闭的影响(标尺=10 μm); C: Nap、PEG和Nap+PEG处理对‘粤油7’和‘汕优
523’叶片气孔开度的影响。
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胁迫1 h叶片AhNCED1翻译水平增加, 复水后其表
达又迅速降低(Hu等2010b)。水分胁迫下, 拟南芥
叶片中ABA含量升高, 引发保卫细胞开启K＋外流
通道, 同时抑制K＋内流通道活性, 使内流量减少,
叶片气孔开度受抑或关闭气孔(Kim等2010)。本研
究发现‘粤油7’在胁迫处理1 h, 叶片中AhNCED1基
因和AhNCED1蛋白就大量表达, 表明响应胁迫反
应迅速, 在48 h时出现第二次表达高峰(图3、4)。
这可能是因为在水分胁迫初期, 花生植株快速响
应, 触发叶片AhNCED1转录、翻译, AhNCED1基
因和AhNCED1蛋白表达水平快速升高, 促进ABA
的合成, 引发一系列相关反应, 从而缓解胁迫带来
的伤害。同时AhNCED1启动子存在顺式作用元件
ABRE区域, 水分胁迫下ABA处理均可增强此作用
元件与AhNCED1启动子的结合, 提高启动子活性,
促进AhNCED1基因和蛋白表达, 促进ABA合成
(Liang等2009), 进而可能通过正反馈调节AhNCED1
基因和蛋白再次出现高水平表达。本实验发现‘粤
油7’叶片AhNCED1蛋白表达高, 气孔开度下降快;
‘汕优523’叶片AhNCED1蛋白表达较低, 气孔开度
下降慢。进一步用ABA合成抑制剂Nap处理花生,
发现叶片AhNCED1基因和AhNCED1蛋白的表达
减弱, 但气孔开度快速增加(图5)。 推测水分胁迫
引起花生叶片的AhNCED1基因和AhNCED1蛋白
的表达增强, 使内源ABA合成增加, 这部分升高的
ABA水平可能引发气孔关闭, 而Nap处理降低了
ABA含量, 使叶片气孔由水分胁迫时的关闭快速
打开。水分胁迫下花生叶片AhNCED1蛋白表达可
能与气孔关闭相关, 更为确切的证据有待于进一
步研究。
参考文献
刘吉升, 李玲(2006). 不同品种花生的抗旱能力及其与内源ABA的
关系. 植物生理学通讯, 42 (6): 1115~1116
覃铭, 胡博, 刘璨, 李玲, 罗虹(2010). AhNCED1基因转化花生研究.
热带亚热带植物学报, 18 (3): 277~282
Chernys JT, Zeevaart JAD (2000). Characterization of the 9-cis ep-
oxycarotenoid dioxygenase gene family and the regulation of ab-
scisic acid biosynthesis in avocado. Plant Physiol, 124: 343~353
Dixon DA, Tolley ND, Kristi BS, Martinez ML, Weyrich AS, Morrow
JD, Prescott SM, Zimmerman GA (2006). Expression of COX-2
in platelet-monocyte interactions occurs via combinatorial regu-
lation involving adhesion and cytokine signaling. J Clin Invest,
116: 2727~2738
Donner TJ, Sherr I, Scarpella E (2009). Regulation of preprocambial
cell state acquisition by auxin signaling in Arabidopsis leaves.
Development, 136: 3235~3246
Endo A, Sawada Y, Takahashi H, Okamoto M, Ikegami K, Koiwai H,
Seo M, Toyomasu T, Mitsuhashi W, Shinozaki K et al (2008).
Drought induction of Arabidopsis 9-cis-epoxycarotenoid dioxy-
genase occurs in vascular parenchyma cells. Plant Physiol, 147:
1984~1993
Fujii H, Zhu JK (2009). Arabidopsis mutant deficient in 3 abscisic
acid-activated protein kinases reveals critical roles in growth, re-
production, and stress. Proc Natl Acad Sci USA, 106: 8380~8385
Hayashi M, Kinoshita T (2011). Crosstalk between blue-light and
ABA-signaling pathways in stomatal guard cells. Plant Signal
Behav, 6: 1662~1664
Herde O, Cortés HP, Wasternack C, Willmitzer L, Fisahn J (1999).
Electric signaling and Pin2 gene expression on different abiotic
stimuli depend on a distinct threshold level of endogenous absci-
sic acid in several abscisic acid-deficient tomato mutants. Plant
Physiol, 119: 213~218
Hu B, Liu X, Hong L, Li L, Luo GY (2010a). Expression and local-
ization of Arachis hypogaea 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase
1 (AhNCED1) of peanut under water stress. Biotechnol Biotech-
nol Eq, 24 (1): 1562~1568
Hu B, Wan X, Liu X, Guo D, Li L (2010b). Abscisic acid (ABA)-
mediated inhibition of seed germination involves a positive feed-
back regulation of ABA biosynthesis in Arachis hypogaea L. Afr
J Biotechnol, 9: 1578~1586
Iuchi S, Kobayashi M, Yamaguchi SK, Shinozaki K (2000). A stress-
inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved
in abscisic acid biosynthesis under water stress in drought-
tolerant cowpea. Plant Physiol, 123: 553~562
Kim TH, Böhmer M, Hu H, Nishimura N, Schroeder JI (2010). Guard
cell signal transduction network: advances in understanding
abscisic acid, CO2, and Ca
2+ signaling. Annu Rev Plant Biol, 61:
561~591
Liang J, Yang L, Chen X, Li L, Guo D, Li H, Zhang B (2009). Clon-
ing and characterization of the promoter of the 9-cis-epoxycaro-
tenoid dioxygenase gene in Arachis hypogaea L. Biosci Biotech-
nol Biochem, 73: 2103~2106
Qin X, Zeevaart JAD (2002). Overexpression of a 9-cis-epoxycarote-
noid dioxygenase gene in Nicotiana plumbaginifolia increases
abscisic acid and phaseic acid levels and enhances drought toler-
ance. Plant Physiol, 128: 544~551
Schachtman DP, Goodger JQD (2008). Chemical root to shoot signal-
ing under drought. Trends Plant Sci, 13: 281~287
Schraut D, Ullrich CI, Hartung W (2004). Lateral ABA transport in
maize roots (Zea mays): visualization by immunolocalization. J
Exp Bot, 55: 1635~1641
Wan X, Li L (2006). Regulation of ABA level and water-stress toler-
ance of Arabidopsis by ectopic expression of a peanut 9-cis-
epoxycarotenoid dioxygenase gene. Biochem Biophys Res Com-
mun, 347: 1030~1038
Weiner JJ, Peterson FC, Volkman BF, Cutler SR (2010). Structural
and functional insights into core ABA signaling. Curr Opin Plant
Biol, 13 (5): 495~502