全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (4): 369~374 369
收稿 2013-01-21　　修定 2013-02-21
资助 广东省科技计划项目(2010B020301010)。
* 通讯作者(E-mail: liling@scnu.edu.cn; Tel: 020-85211378)。
不同花生品种抗旱生理与AhNCED1基因表达的关系
陈艳萍, 何金丽, 李丽梅, 李玲*
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育工程重点实验室, 广州510631
摘要: 利用隶属函数对山东产地的4个花生品种进行抗旱性综合评价, 同时分析4个品种AhNCED1基因的表达情况, 研究
AhNCED1基因与不同花生品种抗旱性的相关性。结果表明, 花生品种间的抗旱性有显著差异, 抗旱性强弱为: ‘鲁花14
号’>‘花育33号’>‘海花1号’>‘花育24号’。干旱胁迫下, 叶片AhNCED1的表达量与其抗旱性呈正相关, AhNCED1基因可以作
为筛选抗旱花生品种的分子指标。
关键词: AhNCED1基因; 花生; 干旱胁迫; 抗旱性; 隶属函数
The Relationship between the Expression of AhNCED1 and Drought Resis-
tance Physiology of Different Peanut Varieties
CHEN Yan-Ping, HE Jin-Li, LI Li-Mei, LI Ling*
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal
University, Guangzhou 510631, China
Abstract: Four peanut varieties growing in Shandong were screened for drought resistance using the subordi-
nate function value. Meanwhile we analyzed the expression level of AhNCED1 gene and studied the relation-
ship between the AhNCED1 expression and the drought resistance. The results showed that drought resistance
between different varieties differed remarkably, ‘Luhua 14’>‘Huayu 33’>‘Haihua 1’>‘Huayu 24’. Under
drought stress, the expression level of AhNCED1 genes positively correlated with drought resistance, which
showed that the AhNCED1 gene could as a molecular marker to screen the highly tolerant peanut cultivar.
Key words: AhNCED1 gene; peanut; drought stress; drought resistance; subordinate function value
花生(Arachis hypogaea L.)是世界上重要的经
济和油料作物之一, 干旱是花生产量与质量提高
的主要限制因子, 严重制约着花生的产量和品质,
抗旱育种是干旱条件下提高作物产量经济有效的
手段(梁炫强等2004)。脱落酸是植物体内重要的
逆境响应激素, 参与植物对逆境胁迫如干旱﹑高
盐﹑低温等的应答(Boneh等2012)。在干旱胁迫反
应中 , 脱落酸通过调节气孔关闭、参与信号通
路、诱导相关基因及蛋白表达等途径提高植物抗
旱性(Verslues和Zhu 2005)。本课题组前期工作中,
研究了广东产地的10个花生品种抗旱性与其体内
ABA水平关系, 发现抗旱能力与体内ABA积累呈
正相关(刘吉升和李玲2006)。9-顺式环氧类胡萝
卜素双加氧酶(NCED)是调节ABA生物合成的关
键限速酶(胡博等2011; Hu等2010), 其表达水平与
内源ABA含量相关(Fujii和Zhu 2009)。番茄、玉
米和菜豆等作物在干旱胁迫条件下NCED基因表
达上调从而增加ABA的积累(Burbidge等1999; Tan
等1997; Qin和Zeevaart 2002)。我们2005年从耐旱
花生品种‘粤油7号’叶片中克隆得到AhNCED1基
因, 异位超表达AhNCED1可以显著提高拟南芥的
抗旱性(Wan和Li 2005, 2006)。
对于广东产地花生耐旱品种‘粤油7号’和敏旱
品种‘汕优523’抗旱性与其体内AhNCED1基因及蛋
白表达水平的关系, 我们的研究结果表明, 胁迫早
期, 品种抗旱性与AhNCED1基因及蛋白表达水平
呈正相关(胡博等2012b)。但有关其他地域花生品
种AhNCED1基因在干旱胁迫下的表达尚无报道,
不同产地不同花生品种间抗旱性与AhNCED1基因
表达的关系也不清楚。本研究以山东产地的4个
花生品种为材料, 分析AhNCED1基因在响应干旱
时的表达变化, 结合抗旱生理指标的变化, 建立
AhNCED1基因筛选花生抗旱品种的方法, 为进一
植物生理学报370
步探索花生抗旱机理和指导生产提供科学依据。
材料与方法
1 材料
花生(Arachis hypogaea L.)供试品种‘鲁花14
号’、‘海花1号’、‘花育24号’和‘花育33号’由山东
花生研究所馈赠。
2 方法
2.1 花生培养与胁迫处理
选取饱满花生种子浸泡过夜, 按2颗·盆-1的密
度种植于直径15 cm的盛有泥炭土和珍珠岩(3:1)的
塑料花盆中, 于30 ℃, 光照/黑暗为 16 h/8 h培养箱
中培养, 隔天浇1/4MS营养液, 培养至四叶期。随
机挑选长势相同的花生品种, 将花生带根部取出,
自来水洗净土壤, 浸泡于20% PEG6000 (W/V)中
0、2、12和24 h后取材保存, 以蒸馏水处理为对照
(刘吉升和李玲2006)。
2.2 叶片萎蔫指数的测定
采用目测法, 待花生种子长出两叶一心时, 停
止浇水, 使土壤自然干旱, 称重法计算土壤含水量,
当含水量达到75%, 每隔1 d用数码相机拍照, 根据
萎蔫程度评定萎蔫等级(岳桦和孙笑丛2011)。根
据花生在干旱过程中形态的动态变化, 将花生叶
片萎蔫指数分为6级(图1-A): 0级, 叶片自然外展,
叶色鲜绿有光泽, 植株坚挺; 1级, 叶片开始失去水
分, 无光泽, 顶一叶和顶二叶略微下垂; 2级, 叶片
继续失水, 皱缩, 下垂幅度加剧; 3级, 部分叶片出
现干硬卷曲; 4级, 所有叶片皱缩下垂, 叶色变黄; 5
级, 叶片完全失水, 下垂, 植株完全死亡。如果萎
蔫程度介于两个等级之间, 作为半级处理。
2.3 叶片相对含水量测定
按照Fukao等(2011)的方法。
2.4 叶片脯氨酸含量测定
按照张殿忠等(1990)的方法。
2.5 叶片ABA含量测定
参照Yue等(2012)的方法。
2.6 抗旱性评价
运用SPSS Statistics 17.0软件对某一指标性状
测定值进行显著性分析。按照张智猛等(2011)的
方法利用隶属函数值评价抗旱性。
2.7 AhNCED1基因表达分析
R N A抽提及c D N A的合成操作参照S u等
图1 正常生长条件和干旱胁迫下花生叶片表型(A)和萎蔫指数(B)
Fig.1 Leave morphology (A) and withered index (B) of peanuts under normal and drought stress
陈艳萍等: 不同花生品种抗旱生理与AhNCED1基因表达的关系 371
(2012)的方法。选择花生内参基因(18S)和表达基
因(AhNCED1), 根据已知基因序列, 利用Primer
Premier 5.0软件进行引物设计(表1)。qRT-PCR操
作过程参照Liu等(2011)的方法。相对表达量采用
delta delta CT法。
相比, 升高幅度最大, 为对照组的127倍。‘花育24号’
的升高幅度最低, 为对照植株的46倍(表2)。干旱胁
迫下不同花生品种叶片ABA含量均升高, 品种间
有差异, 其中‘鲁花14号’的升高幅度最大, 为对照
组花生的20倍。‘海花1号’的升高幅度最低, 为对
照的1.1倍(表2)。
3 花生品种抗旱性综合评价
采用与抗旱性密切相关的指标 (含水量、
脯氨酸含量、ABA含量、萎蔫指数 )的隶属函
数平均值对花生品种的抗旱性进行综合评价。
表1 花生内参基因和目的基因对应引物
Table 1 Primers for reference genes and target gene
基因 引物(5→3) 扩增片段大小/bp
18S F: TACGTCCCTGCCCTTTGTAC 168
R: CCTACGGAAACCTTGTTACGAC
AhNCED1 F: TTACCTGTGGGATTGTTTGC 81
R: ACATGAGCCTCTACTTCTGC
2.8 DIG探针制备与Northern杂交
按照Liu等(2011)的方法。总RNA变性后, 1.5%
甲醛变性胶分离, 通过20×SSC转移到尼龙膜(Am-
ersham Nylon N+)上, 以AhNCED1的cDNA为模板
采用特异引物(上游引物5-GTTCACGCCGTGAAAT-
TCCACA-3, 下游引物5-GCGCTTCAATCCAC-
CGGATACCA-3)合成探针, 50 ℃杂交过夜。洗膜条
件: 2×SSC含0.1% SDS, 常温2次, 1×SSC含0.1% SDS,
0.1×SSC, 65 ℃ 2次, 各10 min, 1×封闭液和DIG标
记抗体封闭30 min, 洗涤缓冲液洗膜45 min 3次, 探
测缓冲液平衡5 min, 压X光片, 显影, 定影, 扫描分析。
实验结果
1 干旱胁迫下不同花生品种叶片的萎蔫指数和含
水量变化
山东4个花生品种干旱胁迫处理7 d, ‘海花1
号’萎蔫指数最大, ‘花育24号’的萎蔫指数最小(图
1-B)。依据萎蔫指数划分标准依次评定为: 4.5级,
4级, 3级, 3.5级。正常生长条件下不同花生品种叶
片相对含水量无明显差异, 干旱胁迫下不同花生
品种叶片相对含水量均下降。经干旱胁迫24 h后,
‘鲁花14号’叶片相对含水量下降21.1%; ‘花育24号’
叶片相对含水量下降33.3% (图2)。
2 干旱胁迫下不同花生品种叶片脯氨酸和脱落酸
含量的变化
正常生长条件下花生叶片脯氨酸含量较低,
且品种间无显著性差异。干旱胁迫处理后花生叶
片脯氨酸含量急剧升高, 其中‘鲁花14号’与对照组
表2 正常生长条件与干旱胁迫下不同花生品种脯氨酸和
ABA含量变化
Table 2 Proline and ABA contents of peanut leaves in
different cultivars under normal and drought stress

处理 品种
脯氨酸含量/ ABA含量/
mg·g-1 (DW) μg·g-1 (DW)
对照 ‘鲁花14号’ 0.44±0.018Cc 0.39±0.001Dd
‘海花1号’ 0.70±0.051Cc 1.20±0.043Cc
‘花育24号’ 0.66±0.038Cc 3.34±0.113Bb
‘花育33号’ 0.83±0.230Cc 1.81±0.042BCc
干旱胁迫 ‘鲁花14号’ 55.60±1.710Aa 7.92±0.123Aa
‘海花1号’ 55.70±12.660Aa 1.33±0.104Cc
‘花育24号’ 30.40±0.740Bb 4.87±0.248Bb
‘花育33号’ 42.90±8.770ABab 3.77±0.113Bb
　　同列数据旁不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), 不同小写
字母表示差异显著(P<0.05)。
图2 正常生长条件与干旱胁迫下各品种相对含水量的变化
Fig.2 Relative water content of peanut leaves in different
cultivars under normal and drought stress
各柱形上不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), 不同小写
字母表示差异显著(P<0.05)。
植物生理学报372
从表3可见, 各品种的不同抗旱指标表现并不一
致, 表现为从0到1的连续变异或巨大差别, 而不
同品种在同一指标上的表现也不同。通过综合
隶属函数值定量反映出4个品种抗旱性强弱顺
序为: ‘鲁花14号’>‘花育33号’>‘海花1号’>‘花
育24号’。
表3 干旱胁迫下花生叶片生理指标的隶属函数值
Table 3 The subordinate function value of each physiological index of peanut leaves under drought stress
品种 相对含水量 脯氨酸含量 ABA含量 萎蔫指数 平均隶属函数 抗旱性排名
‘鲁花14号’ 1.000 1.000 1.000 0.333 0.833 1
‘海花1号’ 0.730 0.420 0 0 0.288 3
‘花育24号’ 0 0 0.027 1.000 0.257 4
‘花育33号’ 0.390 0.069 0.059 0.667 0.296 2
4 不同花生品种在干旱胁迫下叶片AhNCED1基
因的表达变化
干旱胁迫条件下叶片AhNCED1基因表达检测
结果表明(图3), 4个花生品种在正常生长条件下,
基因表达量都呈现低水平; 干旱胁迫初期(2 h)基因
表达量达到最大值, 其中‘鲁花14号’的表达量增幅
最大; 干旱胁迫12 h时以后, 基因表达量均逐渐降
低, 但高于干旱胁迫0 h的表达水平。在干旱胁迫2
h各品种抗旱性强弱与其基因表达程度成正比
(图3)。
讨　　论
本试验选择了反映干旱胁迫条件下与抗旱性
密切相关的4项指标, 采用隶属函数值法将其转换
成独立的综合指标, 评价得到山东省4个花生品种
抗旱性大小依次为: ‘鲁花14号’>‘花育33号’>‘海花
1号’>‘花育24号’, 这一结果与这些品种过去在生
产上的表现是一致的。虽然利用隶属函数法鉴定
作物抗旱性目前应用广泛, 但多数生理生化指标
测定程序复杂, 周期长, 不适于大量种质的耐旱性
鉴定。
ABA作为响应干旱胁迫的信号因子, 植物受
到干旱胁迫时积累ABA, 并通过蒸腾作用运输到
叶肉细胞, 通过跨膜转运至保卫细胞中, 激活多种
耐受水分缺失胁迫基因的表达, 并调节气孔关闭,
减少蒸腾作用(Hayashi和Kinoshita 2001)。AhNCED1
基因是花生体内ABA合成的关键酶基因。前期研
究结果表明, 广东产地花生品种‘粤油7号’和‘汕优
523’在干旱胁迫下, AhNCED1均上调, 抗旱性较强
品种‘粤油7号’上调幅度明显高于抗旱性较弱品种
‘汕优523’, 与脱水条件下2个品种叶片中ABA含量
变化一致(万小荣和李玲2006); 两个花生品种响应
干旱胁迫后叶片的维管组织中ABA分布增强, 含
量增加, AhNCED1蛋白分布也增强; 干旱胁迫初期
‘粤油7号’花生AhNCED1蛋白分布强于‘汕优523’
(胡博等2012b); AhNCED1转基因花生植株在干旱
胁迫下, AhNCED1蛋白及ABA含量均提高(覃铭等
图3 干旱胁迫下不同花生品种叶片AhNCED1基因的
表达变化
Fig.3 AhNCED1 gene expression of peanut leaves in different
drought resistant cultivars under drought stress
A: 干旱胁迫处理0、2、12和24 h叶片的qRT-PCR分析结果;
B: 干旱胁迫处理2 h叶片的Northern-blot分析结果。
陈艳萍等: 不同花生品种抗旱生理与AhNCED1基因表达的关系 373
2010); ‘粤油7号’在响应干旱胁迫初期时(1 h)叶片
气孔开度下降较快, 引发气孔关闭, 其叶片相对含
水量较高, 保水能力较强, 表明干旱胁迫下花生叶
片AhNCED1蛋白表达可能影响气孔开闭(胡博等
2012a)。本实验结果(图3)显示: 干旱胁迫0 h, 4个
花生品种叶片AhNCED1基因表达量均维持较低水
平, 胁迫初期(2 h)表达量迅速上升, 达到峰值, 此时
4个花生品种的抗旱性强弱与其基因表达量成正
比。可能是干旱胁迫早期, 首先触发根系AhNCED1
的表达, 促进根源ABA的合成, ABA随维管束运输
至叶片(Li等2011), 同时AhNCED1启动子存在顺式
作用元件ABRE (ABA responsive element)区域, 与
AhNCED1启动子的结合, 启动AhNCED1表达。干
旱胁迫和ABA处理均可提高ABA响应元件的活性
(Liang等2009), 促进AhNCED1大量表达, 合成
ABA。随着胁迫时间延长(12 h)表达量均回落; 胁
迫末期(24 h), 表达量进一步降低, 但仍高于对照组
水平。说明在干旱胁迫早期, AhNCED1基因表达
量不断增多, 脱落酸的合成不断增加, 随着干旱时
间延长, 植株的自我调节能力已遭到不同程度严
重破坏, AhNCED1分解速率超过合成速率, 表达量
下降。干旱胁迫后各品种AhNCED1基因表达情况
与叶片ABA含量变化情况一致, 说明其高抗旱性
与其整株植物体内AhNCED1基因表达量显著上调
和ABA含量增加有关。此结论与广东省花生品种
抗性生理分析的结果相符合(Hu等2013), 说明
AhNCED1基因表达量一定程度上可以反映花生抗
旱性, 具有较普遍的意义, 可以将此阶段(胁迫早
期) AhNCED1表达量作为判定花生抗旱性的一个
依据。这4个品种叶片AhNCED1蛋白表达情况, 以
及其他产地花生品种的抗旱性与基因表达规律还
需进一步研究。
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