全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 5期，2009年 5月 459
收稿 2009-01-09 修定 　2009-03-31
资助 国家烟草专卖局重点研究项目(TCKL06001)。
* E-mail: liugsh1851@163.com; Tel: 0371-63558121
受烤烟花叶病病毒侵染后叶中保护酶活性和超微结构的变化
刘国顺 1,*, 张彩霞 1, 王婵娟 1, 王新中 1, 刘清华 2, 李宽伟 3
1河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地, 郑州 450002; 2河南省平顶山市烟草公司, 河南平顶山 467000; 3河南省郏
县烟草公司, 河南郏县 467100
提要: 研究受侵染程度不同的烤烟花叶病烟株叶中保护酶活性和超微结构的结果表明，病毒伤害烟株的原因之一是不能及
时清除活性氧，导致活性氧和丙二醛积累，引起质膜伤害，最终导致超微结构破坏，烟株生长受抑制，生物量积累下降。
据此认为，烟草花叶病防治，除了防除病源外，还应注意超微结构的保护和恢复。
关键词: 烤烟; 花叶病; 保护酶活性; 超微结构
Changes in Protective Enzyme Activities and Ultrastructures of Flue-cured
Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Infected with Tobacco Mosaic Virus
LIU Guo-Shun1,*, ZHANG Cai-Xia1, WANG Chan-Juan1, WANG Xin-Zhong1, LIU Qing-Hua2, LI Kuan-Wei3
1National Tobacco Cultivation and Physiological and Biochemical Research Center, Henan Agricultural University, Zhengzhou
450002, China; 2Pingdingshan Tobacco Company of Henan Province, Pingdingshan, Henan 467000, China; 3Jiaxian Tobacco
Company of Henan Province, Jiaxian, Henan 467100, China
Abstract: Protective enzyme activities and ultrastructural alternation of flue-cured tobacco (Nicotiana tabacum)
infected with tobacco mosaic virus (TMV) were studied. The results showed that one of the reasons of the
injury caused by virus was that the reactive oxygen species could not be cleared timely, which induced the
accumulation of reactive oxygen species and malondialdehyde (MDA), further leading to membrane injury.
Ultimately, ultrastructures were destructed, the growth was inhibited, and the biomass accumulation declined.
All these results indicated that it is key important to protect and recover the ultrastructure as well as eliminate the
disease source for tobacco mosaic disease prevention.
Key words: flue-cured tobacco; tobacco mosaic virus; protective enzyme activities; ultrastructures
烟草普通花叶病是由烟草花叶病毒(tobacco
mosaic virus, TMV)引起的一种病毒病, 在我国各产
烟区都有分布, 大田危害严重时, 发病率可达100%,
对烤烟生产造成了严重威胁。以往对烟草感病株
超微结构以及病害胁迫下保护酶活性的研究多集中
在单一因素的探讨(黄遵锡和李红 1995; 胡向武等
1996; 周冀衡等 2000; 房保海等 2004; 商文静等
2007), 而将受侵染叶片保护酶活性的变化规律与超
微结构结合进行的研究较少。本文以受TMV侵染
后的烟草为研究对象, 探讨烤烟叶中保护酶系统和
超微结构对病害胁迫的响应机制, 以供烟草的抗病
育种和病害防治时参考。
材料与方法
试验于2007年在河南省平顶山市郏县烟草示
范田进行, 材料为烟草(Nicotiana tabacum L.)品种
‘中烟100’。试验地土壤类型为褐土, 质地中壤, 土
壤 pH 7.80, 有机质含量 12.0 g·kg-1, 全氮 0.75 g·kg-1,
碱解氮 76 mg·kg-1, 速效磷 8.4 mg·kg-1, 速效钾 105.9
mg·kg- 1。
烤烟移栽期为 5月 7日。于 6月 30日选取正
常株、轻度感病株(有轻微花叶症状, 感病植株只
在叶片上形成黄绿相间的花叶病斑, 叶片基本不变,
但叶肉会出现明显变薄或厚薄不均的症状)和重度
感病株(花叶明显且叶片严重畸形, 叶缘逐渐形成缺
刻并向下卷曲, 皱缩扭曲)每个处理 5株, 并采取第
15~16叶位叶片鲜烟叶, 去除主脉, 用于叶绿素和
保护酶活性的测定。叶绿素测定时, 用 80%丙酮
研磨提取, 以UV-754型分光光度计(上海亚研电子
科技有限公司)测定 663、646、470 nm处的OD
值, 然后计算叶绿素含量(李合生 2000)。过氧化氢
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酶(catalase, CAT)活性的测定按 Chance和Maehly
(1955)文中的方法; 超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)活性的测定按 Beauchamp和
F r i do v i c h ( 1 9 7 1 )文中的方法; 过氧化物酶
(peroxidase, POD)活性的测定按张志良(1990)书中
的方法; 丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量按张宪
政(1990)书中的方法。同时选取正常株和重度感
病株各处理 5株, 取第 15叶位叶片, 用去离子水洗
净, 棉布拭干, 在中脉附近取叶肉组织, 用刀片切成
1 mm×2 mm小片, 将切好的组织块迅速投入 2.5%
戊二醛固定液中, 抽气至完全下沉, 4 ℃下保存, 后
用磷酸缓冲液(pH 7.6)洗涤 3次, 每次 20 min。再
将该材料转移到 1%锇酸中, 置 4 ℃下后固定 4 h,
表 1 TMV侵染对烤烟生长的影响
Table 1 Effects of TMV infection on the growth of flue-cured tobacco
　　 处理 株高 /cm 茎围 /cm 叶长 /cm 叶宽 /cm 地上部鲜重 /g·株 -1
正常株 50.2cC 7.1bB 22.5cC 10.5cC 671.28cC
轻度感病株 46.8bB 6.5aA 18.3bB 8.3bB 650.39bB
重度感病株 40.5aA 6.6aA 14.3aA 7.8aA 570.78aA
　　表中小写字母表示差异显著(P<0.05), 大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
蒸馏水洗涤 3次, 每次 20 min; 随后经系列乙醇脱
水, 环氧树脂618包埋, LKB-V型超薄切片机(瑞典
LKB公司)切片, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,
在Hitachi H-600透射电子显微镜下观察并拍照(日
本HITACHI公司)。
烤烟生长的各种指标均依据YC/T142-1998烟
草农艺性状调查方法(investigating methods of
agronomical character of tobacco)调查。
实验结果
1 TMV侵染对烤烟生长的影响
从表1可以看出, 与正常株相比, TMV侵染后烤
烟生长受到显著抑制。感病株株高、叶长、叶宽
和地上部鲜重受抑制程度随感病程度的增加而提
高。除轻度感病株和重度感病株茎围差异不显著外
(P>0.05), 其余各指标均表现出极显著差异(P<0.01)。
2 TMV侵染对叶绿素含量的影响
正常株叶中的叶绿素总含量为 0.91 mg·g-1。
叶绿素 a/b比为 2.97。受 TMV侵染的叶中叶绿素
总含量表现出明显降低, 且随感病程度的提高下降
幅度增大; 叶绿素a/b比也同样降低, 由轻度感病株
的 2.82降低到重度感病株的 2.63。叶绿素总含量
和叶绿素a/b比在各处理间的差异均达到显著水平
(P<0.05) (图 1)。
3 TMV侵染对SOD、CAT和POD活性以及MDA
含量的影响
如图2所示, 轻度感病株叶片SOD活性明显高
于正常株, 说明感病前期病害胁迫可以诱导叶片
SOD活性升高, 减轻伤害; 重度感病株叶中SOD活
性略有下降, 但仍高于正常株。POD、CAT与
SOD活性变化规律相似, 均表现出正常株活性最低,
轻度感病株活性最高。MDA是细胞膜脂过氧化分
解的最终产物, 随感病程度的提高MDA含量逐渐
图 1 TMV侵染对烤烟叶绿素总含量及叶绿素 a/b的影响
Fig.1 Effects of TMV infection on the chlorophyll content
and chlorophyll a/b ratio in flue-cured tobacco leaves
图中字母表示差异显著(P< 0 .0 5 )。
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图 2 TMV侵染对烤烟叶中 SOD、CAT、POD
活性及MDA含量的影响
Fig.2 Effects of TMV infection on the activities of
antioxidative enzymes and MDA content
in flue-cured tobacco leaves
图中字母表示差异显著(P< 0 .0 5 )。
升高, 本文中重度感病株叶片已表现出严重畸形, 表
明膜脂过氧化程度高, 对叶片造成不可恢复的伤害。
4 TMV侵染后细胞超微结构的变化
如图 3-a1~a6所示, 正常株叶片的细胞结构正
常, 超微结构清晰, 细胞壁光滑, 没有异常的细胞内
含体或空泡化现象。栅栏组织中的叶绿体紧贴细
胞壁排列, 其中所含淀粉粒较大, 含有少量嗜饿颗
粒, 类囊体片层比例占较少部位。质膜紧贴细胞
壁。叶绿体呈梭形, 由双层外被膜包围, 外膜完整,
基粒片层和基质片层发育良好, 排列整齐有序。如
图3-b1~b4所示, 轻度感病株大部分叶绿体片层变得
模糊不清, 少量叶绿体类囊体片层虽然清晰, 但略
有膨胀, 无质壁分离现象, 可见病毒粒子, 线粒体不
清晰, 细胞核基本正常。如图 3-c1~c6所示, 重度
感病株叶肉细胞中的栅栏组织和海绵组织大部分细
胞已出现质壁分离现象, 细胞核固缩。部分叶绿体
变得肿胀畸形, 叶绿体被膜及类囊体膜破坏, 基质
外流, 其中所含淀粉粒比正常植株的要小, 淀粉颗
粒增多。类囊体片层肿胀或消失, 片层结构紊乱并
散布在细胞质中, 叶绿体之间的细胞质中含有大量
的线状或风轮状病毒。线粒体数量没有明显减少,
结构基本正常。细胞核明显有损伤、变形或固缩。
讨 论
植物在正常代谢活动中或逆境条件下均会产
生活性氧, 在前一种情况下, 细胞内活性氧的产生
和清除处于动态平衡状态, 活性氧水平很低, 不会
伤害细胞(Fridovich 1978; 马旭俊和朱大海 2003);
而在后一种情况下则会打破这个平衡, 以致细胞内
活性氧过量积累, 这些活性氧直接或间接启动膜脂
过氧化以及导致膜组分的改变(Keppler和Novacky
1987; 宋凤鸣等1996), 从而对植物细胞产生明显的
毒害作用。植物体内的 SOD、POD和 CAT等抗
氧化保护酶类能有效清除活性氧, 降低或消除活性
氧对膜脂的攻击能力。SOD能催化O2－· 生成H2O2,
而CAT和POD则进一步催化H2O2形成H2O和O2,
从而有效阻止O2－· 和H2O2的积累, 防止植物受到过
多的活性氧的伤害, 阻断毒性更强的活性氧自由基
的产生(马旭俊和朱大海 2003)。同时, POD在保
护酶蛋白以及植物细胞木质素的合成过程中起作
用, 由它所催化形成的木质素和植保素来抵抗和限
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图 3 TMV侵染对烤烟叶肉细胞超微结构的影响
Fig.3 Effects of TMV infection on mesophyll cell ultrastructures in flue-cured tobacco leaves
　　 a 表示正常株, b表示轻度感病株, c表示重度感病株。a1: 示栅栏组织中的叶绿体(×2 500); a2: 示海绵组织中的叶绿体(×2 500);
a3: 示维管束细胞中的细胞核、线粒体(×10 000); a4: 示叶绿体类囊体片层(×30 000); a5: 示栅栏组织中的叶绿体(×10 000); a6: 示维管
束中的线粒体(×30 000); b1: 示栅栏组织中的叶绿体(×2 500); b2: 示海绵组织中的叶绿体(×3 500); b3: 示叶肉细胞中的线粒体(×30 000);
b4: 示叶绿体类囊体片层(×30 000); c1: 示栅栏组织中的叶绿体(×2 500); c2: 示海绵组织中的叶绿体(×2 500); c3: 示维管束细胞中的细胞
核、线粒体(×10 000); c4: 示叶绿体类囊体片层(×30 000); c5: 示栅栏组织中的叶绿体(×10 000); c6: 示维管束中的线粒体及线状病毒
粒子(×30 000)。Ch1: 叶绿体; M: 线粒体; N: 细胞核。
制病毒粒子的侵入和扩散(Abeles和 Biles 1991)。
Young等(1995)认为植物细胞内酶活性的提高是适
应体内活性氧物质增加的一种保护性反应。在我
们的工作中, 轻度感病株叶中 SOD、POD和 CAT
活性均极显著上升(图2), 表明烤烟首先通过提高抗
氧化酶活性的方式响应 TMV侵染胁迫。然而, 随
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着TMV侵染时间的延长和病害加剧, 3种酶的活性
均下降, 此时活性氧的增加超过内源保护酶以及其
它抗活性氧物质的清除能力, 致使染病组织活性氧
累积和膜脂过氧化作用加强。MDA作为膜脂过氧
化的最终产物, 标志着膜脂过氧化的程度(陈少裕
1991; Devlin和 Gustine 1992; 葛秀春等 2000)。
MDA能降低细胞膜系统的电阻和膜流动性, 最终破
坏膜的结构及生理完整性, 进而加速组织细胞的死
亡和病症表现(Bowler等 1992; Tzeng和 Devay
1993)。本文中随感病程度的提高, MDA含量逐渐
升高, 重度感病株叶片已表现出严重畸形, MDA含
量显著、极显著高于正常株和轻度感病株, 表明膜
脂过氧化程度高, 对叶片造成了不可恢复的伤害。
在外观形态上表现为生长受到严重抑制, 地上部生
物量、叶长和叶宽等明显减少(表 1)。这说明轻
度感病株能更有效地消除活性氧以减轻危害, 重度
感病株虽也能抵御病害的侵染, 但效果较差。超微
结构的观察结果也表明了这一点。
烤烟叶中细胞超微结构的变化与病毒侵染对
叶片造成的伤害程度密切相关。正常条件下, 烟株
叶片的细胞结构完整。而病毒侵染后细胞超微结
构发生明显改变, 我们在试验中看到重度感病株叶
绿体结构受到严重破坏, 叶绿体瓦解, 被膜及类囊
体膜破坏, 基质外流, 基本上未见到有完整被膜的
叶绿体及其内的基粒结构, 并且在破坏的叶绿体中
还见到大量的病毒粒子堆积, 叶绿体结构的破坏, 从
而引起叶片褪绿, 导致叶绿素含量下降而产生浅绿
和暗绿相间的花叶症状。烤烟叶中叶绿素a/b值逐
步下降表明叶绿素a含量的减少比叶绿素b更快(图
1), 以致 PSII光合色素复合体发生改变(李燕宏等
2006), 进而导致单位面积叶片的光合作用能力下降,
于是烤烟地上部的生长受损, 据此我们认为TMV感
染细胞可能会伤害叶绿体, 导致叶绿体结构破坏和
光合作用功能减弱。这些表明TMV感染影响花叶
病症与叶绿体之间的关系最大, 也说明防治烟草花
叶病时, 除考虑防除病原以外, 还应注意保障叶绿
体的基本结构, 以维持叶片中物质合成活动与合成
能力的恢复。
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