全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (12): 2280~2286　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.05432280
收稿 2015-10-16　　修定 2015-11-09
资助 国家自然科学基金青年科学基金项目(31101095)和北京师
范大学教师发展基金项目。
* 通讯作者(E-mail: zhouxiaojin0811@163.com; Tel: 010-
82106135)。
RNA原位杂交技术在玉米研究中的应用
李洁1, 于明1, 邴杰1, 周晓今2,*
1北京师范大学生命科学学院, 北京100875; 2中国农业科学院生物技术研究所, 北京100081
摘要: RNA原位杂交技术是在组织显微水平研究目标基因时空表达分布的重要技术手段。在植物中, 原位杂交技术广泛应
用于拟南芥和水稻的研究, 而在玉米的研究中该技术应用较晚, 实验技术体系尚有待优化和完善。文章以玉米为材料探索
和优化原位杂交实验技术体系, 并着重对实验的方法步骤、技术要点、结果分析等方面进行讨论和总结。实验结果表明,
优化后的实验技术体系能够特异的检测到目标基因在玉米雄花中表达分布。
关键词: RNA原位杂交; 基因表达; 玉米
The Application of RNA In Situ Hybridization Technique in Maize
LI Jie1, YU Ming1, BING Jie1, ZHOU Xiao-Jin2,*
1College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China; 2Biotechnology Research Institute, Chinese Academy
of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: RNA in situ hybridization technique is important in the detection of the temporal and spatial expres-
sion of functional genes at a histological level. In situ hybridization technology has been widely used in studies
towards Arabidopsis and rice, but few studies have been reported in maize, possibly due to its technique diffi-
culties. In this article, the authors explored and optimized the experimental system of in situ hybridization tech-
nique by using different maize tissues, especially summarized the method and steps, the key points of technolo-
gy, typical results, etc. The results suggest that the optimized in situ hybridization technique is able to
specifically detect the target gene in the tassel of maize.
Key words: RNA in situ hybridization; gene expression; maize (Zea mays)
对基因表达模式的研究是探索基因功能的
重要手段之一。一直以来Northern杂交和实时荧
光定量PCR (real-time quantitative PCR)都是分析
基因时空表达特征的关键技术, 但其局限性在于
无法直观地分析目标基因在组织显微或亚显微水
平的表达分布情况(徐云远等2002)。因此, 根据
核酸分子杂交的基本原理和免疫组织化学的方法
发展而来的原位杂交技术(in situ hybridization,
ISH) (Gall和Pardue 1969; John等1969)为此提供了
行之有效的解决途径(徐云远等2002; 林大何等
2007)。对于植物而言, 绝大多数植物中的基因没
有开发商业化的抗体资源, 因此基于核酸探针的
mRNA组织原位杂交技术为植物基因表达模式的
研究提供了技术支持和便利 (李虹颖和苏彦华
2012; 柳美玲等2013)。
近年, 随着玉米基因组序列的破译和发布, 对
玉米生长发育、生理功能、株型密植以及高产稳
产的研究已逐渐成为作物研究领域的热点和主
流。mRNA原位杂交技术作为一项探索目标基因
时空表达模式的关键技术在玉米研究中的应用也
逐渐起步和开展。该技术可清楚的展示目标基因
在组织显微水平的表达分布, 为研究玉米重要基
因的功能提供线索。本文在参考Javelle等(2011)提
供的植物mRNA组织原位杂交方法的基础上, 以玉
米雄花特异表达基因Zm13为例(Hamilton等1992;
Heiss等1996), 系统介绍mRNA组织原位杂交的实
验原理、方法步骤和结果分析, 为今后开展相应
的研究工作提供技术支持和参考。
材料与方法
1 试剂
DIG RNA Labeling Kit (Roche, 1175025)、
Blocking Reagent (Roche, 11096176001)、Anti-Di-
李洁等: RNA原位杂交技术在玉米研究中的应用 2281
goxigenin-AP Fab Fragments (Roche, 11093274910)
和NBT/BCIP (Roche, 1681451)以及实验所用的酶
和化学试剂均购置于Roche和Sigma, 有机试剂购
置于北京化工。
2 取材和固定
本实验选取的材料为玉米(Zea mays L.)的雄
花、三叶期幼苗的根、叶和基部分生组织以及授
粉20 d的籽粒。植物材料常用的固定液有: FAA固
定液、卡诺固定液和PFA (4%多聚甲醛)固定液。
本实验选用FAA固定液(50%无水乙醇、10%甲醛
和5%冰醋酸)的效果较好。固定包埋所需试剂均
用已灭菌的1%焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,
DEPC)水溶液配制。
先将固定液和材料置于冰上, 快速将材料上
需要固定的部分取下放入固定液中, 一般来说材
料的大小以10 mm×5 mm×3 mm以内为宜。将装
有固定液和材料的玻璃小瓶放在真空泵中, 抽真
空5~20 min至有小气泡从材料表面释放时, 更换新
鲜的固定液。该步骤需要重复进行直至材料沉入
玻璃瓶底部, 其目的主要为使固定液能更好的渗
透进入细胞内部, 以便充分的固定材料。抽真空
完毕后, 将材料浸泡在固定液中并置于4 ℃过夜。
3 组织包埋
组织包埋包括材料的脱水、透明、浸蜡和包
埋等步骤, 方法如下。
脱水: 预先准备不同浓度梯度的酒精, 置于4
℃备用。酒精浓度和脱水时间分别为: 50%乙醇, 1
h; 70%乙醇, 1 h; 85%乙醇, 1 h; 95%乙醇, 1 h;
100%乙醇, 1 h, 3次。脱水步骤在4 ℃冰箱里的摇
床上进行。如果实验无法按期完成, 可将材料保
留在70%的乙醇中于4 ℃放置数天。
透明: 所有步骤均在室温进行并轻微摇晃。透
明溶液和处理时间如下: 25%二甲苯-75%乙醇, 50%
二甲苯-50%乙醇, 75%二甲苯-25%乙醇, 100%二甲
苯(2次), 每步0.5~1 h。然后配置50%二甲苯-50%石
蜡(已融化)溶液, 将材料浸泡于其中42 ℃过夜。
浸蜡: 100%纯蜡, 60 ℃保温2 d, 期间更换5~6
次纯蜡。
包埋: 包埋前1 h先更换一次纯蜡。浸蜡完成
后二甲苯应该完全被液体石蜡取代。包埋一般在
60 ℃的恒温展台上进行。为后续实验能顺利得到
所需部位的切面, 包埋时应将材料按照之前设计
好的方位摆放。包埋完成后将材料迅速放置于冰
上冷却。如有条件, 可以使用包埋机(Leica)和配套
的包埋耗材, 可使包埋过程更加便捷和减少操作
失误对材料带来的影响。包埋完成后, 材料可放
置于4 ℃短期保存。
4 探针准备
4.1 探针区域的选择和目的片段的克隆
对于目标基因, 可以选择一个或者多个该基
因的特异序列作为探针。探针的长度以150~
1 200 bp为宜(Javelle等2011)。本实验选择玉米花
粉特异表达基因Zm13的特异区域设计探针。克
隆探针序列的上下游引物分别为 : 5 ′-TTCTC-
GAGAAGGACAGCCACGAGGAGGA-3 ′和
5′-TTTCTAGAAGATGGGCTTGTGCCTGGG-3′,
探针长度为443 bp。将探针的DNA序列克隆至
pEASY-T3载体的多克隆位点上。连接载体的探
针序列两侧分别具有T7和SP6 RNA聚合酶的启
动子, 因此可应用T7和SP6 RNA聚合酶及带有地
高辛(digoxigenin, DIG)标记的UTP进行体外转录获
得含有地高辛标记的正义和反义RNA探针(Roche
DIG RNA Labeling Kit)。此外, 在体外转录之前
需要通过限制性内切酶将pEASY-T3载体线性化,
以获得体外转录的模板。值得注意的是, 为防止
转录出非目的RNA, 应选用产生5′凸出末端的限
制内切酶线性化载体, 且应尽量酶切完全。
4.2 体外转录探针
体外转录探针所需的反应体系为: 10×NTP
Labeling Mixture 2 μL、10×Transcription Buffer
2 μL、Protector RNase Inhibitor 1 μL、T7或SP6
RNA Polymerase 2 μL、线性化的DNA模板1 μg,
用DEPC水补足反应体系至20 μL, 于37 ℃反应
2 h。反应完成后, 添加2 μL RNase-free DNase I,
于37 ℃孵育15 min以消化DNA模板。然后, 加入
2 μL 0.2 mol·L-1 EDTA终止反应, 并加入1/10体积
的4 mol·L-1 LiCl和2.5倍体积的无水乙醇, 于–70 ℃
放置30 min沉淀RNA探针。之后, 于4 ℃、13 000
r·min-1离心15 min回收探针, 75%乙醇洗涤沉淀一
次, 并用20 μL DEPC水配置的TE溶解探针。取
1 μL探针进行MOPS甲醛变性胶电泳, 检测其完
整性, 其余探针于–70 ℃保存。
植物生理学报2282
探针水解: 若正反义探针的长度大于250 bp,
则最好将其水解为150 bp左右的探针, 以利于其
穿透杂交组织, 从而获得更好的杂交效果(Javelle
等2011; 柳美玲等2013)。水解步骤如下: 将纯化
后的探针与等体积2×碳酸盐缓冲液(80 mmol·L-1
NaHCO3, 120 mmol·L
-1 Na2CO3)混合, 60 ℃水解
若干分钟。水解时间需要根据以下公式进行精确
的计算: 水解时间T=(起始片段长度–最终片段长
度)/(K×起始片段长度×最终片段长度); K＝0.11
kb·min-1; 最适宜的终片段长度一般为150 bp。反
应完成后加入1/20体积10%的冰醋酸终止反应。
反应终止后回收探针 : 在水解反应体系中加入
1 μL 100 mg·mL-1 tRNA, 1/10体积3 mol·L-1醋酸
钠(pH 5.2), 以及2.5倍体积预冷的100%乙醇, –80
℃沉淀30 min。然后4 ℃、13 000 r·min-1离心20
min, 弃上清; 加入500 μL 70%的乙醇洗涤沉淀, 离
心后弃上清, 自然风干沉淀。最后加入50 μL 50%
的去离子甲酰胺重悬沉淀, –80 ℃保存备用。
4.3 探针浓度的半定量检测(点杂交)
为节约探针和避免过量使用造成的高背景,
需要对体外合成的探针进行点杂交定量。将地高
辛标记试剂盒中的Control RNA和DIG标记的RNA
探针做梯度稀释, 取各稀释浓度的探针1 μL点于
NC膜上, 并于120 ℃烘烤30 min固定核酸。按DIG
试剂盒的使用说明书进行DIG抗体杂交和显色反
应。通过比较体外转录获得的探针与Control RNA
的强度, 估算合成好的RNA探针的浓度。
5 切片
使用Leica RM2135切片机将材料切成厚度为
8~10 μm的蜡带。用毛笔将蜡带置于DEPC水上。
待蜡带完全展开后, 用多聚赖氨酸包被的载玻片
捞取蜡带, 使蜡带完整的吸附于载玻片上。捞片
后沥干载片上多余的水, 并于42 ℃烤片24 h (徐云
远等2002; 李洁2008)。烤片过程中注意材料与载
片之间是否有气泡产生, 若有气泡则需要用解剖
针将气泡扎破, 使材料和载片更好的贴合。
6 原位杂交
6.1 切片的预处理
原位杂交前的预处理包括石蜡切片的脱蜡复
水、蛋白酶K消化、乙酰化和切片的脱水。
切片的脱蜡复水包括以下步骤: 100%二甲苯
室温10 min (2次), 50%二甲苯-50%乙醇室温2 min;
100%乙醇(2次)、90%乙醇、70%乙醇、50%乙
醇、30%乙醇、10%乙醇、DEPC水(2次), 每步室
温2 min。
蛋白酶K消化: 37 ℃预热蛋白酶K缓冲液(100
mmol·L-1 Tris-HCl pH 8.0, 50 mmol·L-1 EDTA), 加
入蛋白酶K至终浓度为2.5 µg·mL-1。将切片放入蛋
白酶K溶液, 37 ℃处理15 min, 之后用DEPC水室温
洗3次, 每次2 min。
乙酰化: 将载玻片于100 mmol·L-1 pH 8.0 的三
乙醇胺中浸泡10 min。然后加入乙酸酐至终浓度
为0.25% (m/V), 室温放置10 min, 2×SSC洗2次, 每
次5 min。
切片的脱水: 将切片依次置于10%乙醇、30%
乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、100%乙
醇(2次)中脱水, 每步室温2 min。然后将载玻片置
于42 ℃烘干1 h以备用。
6.2 杂交
首先配制杂交液A和杂交液B。配制杂交液A
7.72 mL (5 000 µL甲酰胺, 1 000 µL 10×Blocking
Reagent, 600 µL 5 mol·L-1 NaCl, 100 µL 1 mol·L-1
Tris-HCl pH 7.5, 20 µL 500 mmol·L-1 EDTA pH 7.5,
0.5 g硫酸葡聚糖, 1 000 μL DEPC水), 将杂交液A分
装为每管77.2 µL, 于42 ℃预热备用。配制杂交液B
22.8 µL (2.5 µL 20 mg·mL-1 PolyA, 1.5 μL 10 mg·mL-1
tRNA, 探针1~5 μL, DEPC水补足体系至22.8 µL), 并
于80 ℃变性5 min, 其后迅速置于冰上防止复性。
将杂交液A和杂交液B混合, 均匀涂于载玻片上(每
片100 µL)。加盖Parafilm膜, 于含有0.3 mol·L-1
NaCl-50%甲酰胺的湿室中50~55 ℃杂交过夜。
6.3 杂交后的处理
杂交后的处理包括洗片、地高辛抗体杂交和
显色等步骤。
洗片: 40 mL 37 ℃预热的2×SSC室温洗片20
min, 重复2次, 以洗去大多数未结合的探针。再用
25 µg·mL-1的RNase A (用RNase缓冲液配置)于37
℃处理30 min以消化所有未杂交的探针, 其后用37
℃预热的RNase缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl pH
7.5, 500 mmol·L-1 NaCl, 1 mmol·L-1 EDTA)洗片2
次。自该步骤之后所有操作均无需对RNase进行防
护。之后进行低严谨和高严谨洗片: 将载玻片置于
载玻片架中, 浸于1 L 2×SSC中洗片30 min (低严谨
洗片); 之后将载玻片浸于1 L 0.5×SSC中55 ℃洗片
李洁等: RNA原位杂交技术在玉米研究中的应用 2283
30 min (高严谨洗片)。洗片时以小转子低速搅动。
地高辛抗体杂交: 先用1×PBS室温洗片5 min,
之后将载玻片置于0.5%的封闭液(用1×PBS稀释
10×Blocking Reagent至0.5×)中室温封闭60 min。
将DIG抗体Anti-Digoxigenin-AP Fab Fragments按
1:500的比例稀释(稀释液为含有1 g·L -1 BSA的
1×PBS)后滴加于载玻片上; 加盖Parafilm膜, 于含
有1×PBS的湿室中室温孵育60~120 min。杂交后
用1 L的1×PBT (PBS中加入Tween-20至终浓度为
0.1%)洗片3次以去除未结合的抗体, 每次10 min,
洗片时以小转子低速搅动。
显色: 将载玻片置于显色缓冲液TNM50 (100
mmol·L-1 Tris-HCl pH 9.5, 100 mmol·L-1 NaCl, 5
mmol·L-1 MgCl2·6H2O)中平衡5 min; 之后在载玻片
表面滴加2%的NBT/BCIP显色液(用TNM50配置)室
温避光反应0.5~36 h; 待信号显现后用TE溶液终止
反应。
6.4 封片镜检
准备不同浓度的酒精对载玻片进行梯度脱水:
30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%
乙醇、100%乙醇(2次), 每步室温2 min; 二甲苯浸
泡2次, 每次室温5 min。之后滴加中性树胶并加盖
盖玻片进行封片, 42 ℃烤片1 d, 待树胶彻底干燥定
型后即可镜检。
实验结果
1 电泳检测体外转录的RNA探针
将探针的DNA序列克隆至pEASY-T3载体的
多克隆位点上。通过设计的限制性内切酶将载体
线性化。以线性化的载体作为模板体外转录获得
地高辛标记的RNA探针, 探针电泳检测结果如图1
所示。从图1可知, 体外转录的正、反义RNA探针
大小在300~500 bp之间, 和实验设计的探针长度一
致, 且无明显的非特异转录的RNA条带。
图1 电泳检测体外转录获得的RNA探针
Fig.1 RNA probes synthesized by in vitro transcription
M: DNA分子量标准; 1:体外转录获得的正义RNA探针; 2:体
外转录获得的反义RNA探针。
2 点杂交半定量RNA探针标记效率
点杂交的目的是为了对探针的浓度和地高辛
标记效率进行初步的定量分析。根据点杂交的结
果指导后续杂交实验中探针的用量。RNA探针的
点杂交结果如图2所示。从图2可知, 将RNA标准
品和正、反义RNA探针分别进行了梯度稀释(10-1~
图2 原位杂交正反义探针浓度的半定量检测
Fig.2 The labeling efficiency of sense and anti-sense RNA probes were determined by semi-quantitative assay
将DIG标记的RNA标准品和体外转录获得的探针进行梯度稀释后点于NC膜上, 与抗地高辛的抗体进行点杂交反应。标准品的原始
浓度为100 ng·μL-1, 10-1~10-6倍稀释后浓度为10 ng·μL-1~0.1 pg·μL-1。
植物生理学报2284
10-6倍), 点杂交后将探针与标准品的显色结果进行
比较, 大致判断正反义探针的浓度。图中点杂交
结果显示Zm13反义探针的浓度为100~150 ng·μL-1,
Zm13正义探针浓度为20~50 ng·μL-1。
3 组织原位杂交结果
本实验以玉米雄花特异表达基因Zm13为例探
索和优化原位杂交实验体系。已有文献报道Zm13
基因在玉米雄花中特异表达(Hamilton等1992;
Heiss等1996), 本实验以包括雄花在内的玉米不同
组织器官为材料开展原位杂交实验, 检验优化后的
原位杂交技术体系在玉米中的应用效果。Zm13在
玉米不同器官的原位杂交结果如图3所示。因为进
行了封片, 所以杂交信号显示为蓝色。从结果可
知, Zm13的反义探针在玉米花粉中特异地检测到
蓝紫色的阳性信号(图3-A、B), 而Zm13的正义探针
未检测到阳性信号(图3-E、F)。此外, 在根、叶、
基部分生组织和籽粒等组织器官中均没有检测到
Zm13反义探针的杂交信号(图3-C、D、G、H)。该
图3 Zm13在玉米不同组织器官中的原位杂交实验结果
Fig.3 The histochemical localization of Zm13 was examined in various tissues of maize by in situ hybridization
A、B、E、F为Zm13在玉米雄花中的原位杂交结果; 其中A、B为反义探针的杂交结果, 蓝紫色示阳性信号; E、F为正义探针杂交结
果, 示阴性对照。C、D、G、H示反义探针的杂交结果, 所取组织分别为幼叶纵切、基部分生组织纵切、幼根横切以及授粉后20 d籽粒的
纵切。标尺=100 μm。
李洁等: RNA原位杂交技术在玉米研究中的应用 2285
结果与之前文献报道Zm13只在玉米雄花中特异表
达的研究结论相符(Hamilton等1992; Heiss等1996),
但原位杂交实验获得的结果更为精确和直观, 可以
从显微水平检测到目标基因所在组织的具体表达
部位, 为揭示该基因的功能提供了进一步的线索。
讨　　论
原位杂交技术不仅可以应用于玉米、水稻、
拟南芥等模式植物, 在动物中也具有非常广泛的
应用(Schulte-Merker等1992; Thisse和Thisse 2008;
张春霞和刘锋2013)。此外, 在miRNA的研究中,
原位杂交技术也是非常重要的研究手段, 在动植
物中都有相关的报道(Liu等2012; 刘卓琦等2014;
Cassidy和Jones 2014)。在不同物种中原位杂交实
验的原理、方法、步骤基本一致, 只是针对不同
的物种和组织需要在实验细节上做进一步的调整
和探索, 以获得最佳效果。在实验操作中有以下
几个方面值得注意和探讨。
1 原位杂交实验的整体设计与安排
原位杂交实验过程较为繁复, 因此我们将该
实验体系的操作流程和时间安排归纳总结为图
4。实验操作者通过参考图4能对原位杂交实验的
整体操作过程有一个全面的了解和把握。如图所
示, 在原位杂交实验初期可同时进行两个部分的工
作, 即材料的固定包埋和探针的制备。完成这两个
部分之后可以进入切片和杂交步骤, 最后进行封片
镜检。若实验顺利, 一个月能完成整个杂交实验。
此外, 包埋好的材料和RNA探针可以在冰箱保存
一段时间, 以便对此前的实验结果进行反复验证,
后续重复实验的时间可缩短至10 d左右。值得注
意的是, 从材料固定到探针杂交在内的各个步骤都
要防止切片中的mRNA或者探针RNA的降解而造
成它们之间的非特异性结合。图4中白色框所示为
需要严格遵守RNA操作规范的步骤, 灰色框所示
则为无须避免RNase污染的步骤。因此, 对于白色
框所示步骤除要严格地对试剂、耗材进行去除
RNase的操作外, 还需尽量保持实验环境的洁净以
减少与RNase的接触。
2 材料的固定和包埋
材料固定的质量直接影响组织中mRNA的完
整性和原位杂交结果的可靠性。因此, 为获得较好
的结果, 应使材料获得充分的固定。本研究使用抽
真空的方法促进固定液深入组织内部, 可在短时间
内固定组织细胞。同时, 4 ℃过夜可增强固定的效
果, 有效维持mRNA的完整性; 但是也应该注意避
免过度固定, 如固定时间超过16 h, 则可使杂交信号
减弱。对于密度较大且不易固定的组织, 可以视需
要将其切为小块后固定。如玉米籽粒这样的组织,
可以选择合适的角度将其切开后再固定, 并适当延
长抽真空时间(6~8 h)和脱水时间(每步2~3 h)。
3 杂交预处理中蛋白酶消化、乙酰化的目的和意义
原位杂交前一般需要对脱蜡复水的切片进行
蛋白酶消化处理。蛋白酶消化的目的是降解细胞
内被固定的蛋白, 以便探针能渗透进入细胞, 并与
目标mRNA发生作用。蛋白酶的消化与后续杂交
时间的长短以及杂交信号的强弱密切相关, 因此
对于不同材料在这个步骤的处理时间也需要摸
索。此外, 也有研究报道在蛋白酶消化处理后可
用固定液对材料中的RNA进行短时的再固定, 以
图4 mRNA组织原位杂交实验流程图
Fig.4 A flowchart showing the process of mRNA in situ
hybridization
白色框为需要严格遵守RNA操作规范的步骤, 灰色框为无须
避免RNase污染的操作步骤。
植物生理学报2286
减少蛋白酶消化对细胞内RNA的影响。在蛋白酶
消化后还需要对切片进行乙酰化处理, 其目的是
通过乙酰化将蛋白酶消化后暴露于氨基酸表面的
正电荷中和, 以防止探针与这些带正电荷的氨基
酸非特异的结合。需注意的是乙酸酐有一定的毒
性, 因此该部分操作应该在通风橱中进行。
4 杂交过程中的注意事项
杂交时所加探针的浓度需要通过点杂交粗略
的估算。对于未知基因的杂交实验, 可能还需要通
过比较不同浓度探针的杂交结果, 确定该探针杂交
的最佳浓度, 探针浓度范围可在0.25~2 ng·kb-1·μL-1
之间。若杂交液中探针的浓度为0.5 ng·kb-1·μL-1,
每张片子所需杂交液的体积为100 μL, 那么对于500
bp的探针而言每张片子所需探针的量约为25 ng。
此外, 杂交温度一般为50~55 ℃, 杂交时间一般需要
过夜。杂交完成后加入RNase A, 目的是消化未杂
交的单链RNA和非特异杂交的双链RNA以获得更
加特异的杂交信号。该步骤之后所使用的试剂、耗
材都无需去除RNase, 可在普通实验环境下操作。
5 原位杂交特异性的控制和背景的处理
在实验过程中, 如何判断切片中显色的区域
是背景色还是目的基因信号, 是一个比较关键的
问题。对于未知基因而言, 可以在基因不同的特
异区域设计2~3个探针, 比较不同探针的杂交结果,
从而确定该基因的特异杂交信号。实验中正义探
针的杂交结果(阴性对照)对研究某个功能不明基
因的表达是有必要的。根据对比正、反义探针的
显色结果可以明确目的基因的特异信号区域。若
没有阴性对照, 又想要判断目的基因是否有特异
性表达, 可以根据显色深浅区域各个细胞细胞质
中的色素沉淀情况而定。不能根据切片中某区域
颜色的深浅来判断, 因为各个区域的细胞密度是
不同的, 虽然可能细胞质中色素沉淀是一样的, 但
由于某个区域细胞密集, 所以看起来颜色就比其
他区域颜色深, 导致出现假阳性结果(林大何等
2007)。此外, 杂交的温度、杂交液的配方、蛋白
酶处理时间等都可以根据不同的材料和探针情况
做一定的调整, 以得到最佳实验效果。
总的来说, 原位杂交技术不仅可以特异、灵
敏的检测目标基因在不同组织水平的表达和分布,
还能初步判断该基因在组织不同细胞区域的表达
强弱。原位杂交技术的这一优点也是它表达分析
技术无法比拟的。因此, 原位杂交技术在动植物
目标基因的表达分析以及功能研究等方面具有独
特的、不可替代的应用价值。
参考文献
李虹颖, 苏彦华(2012). 水稻RNA原位杂交体系的优化. 南京农业
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