全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (1) : 57～ 63
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
RNA 原位杂交技术及其在植物
基因表达研究中的应用Ξ
陈绍荣　杨弘远
(武汉大学生命科学学院发育生物学研究中心　武汉　430072)
IN S ITU RNA HY BR ID IZAT ION TECHN IQUE
AND ITS APPL ICAT ION TO STUD IES OF GENE
EXPRESSION IN PLANTS
Chen Shao rong　Yang Hongyuan
(R esearch Cen ter f or D evelopm en ta l B iology , Colleg e of L if e S ciences,W uhan U niversity　W uhan　430072)
关键词　RNA 原位杂交, 基因, 时空表达
Key words　In situ RNA hybridization, Gene, T empo ral and spatia l exp ression
原位杂交 ( In situ H ybridization) 是一种在细胞水平上研究基因表达调控的最直接有效的分子生物
学技术。这一技术最初应用于动物染色体上的基因物理定位〔1〕和特定mRNA 在组织中的空间定位〔2〕,
后来又作为诊断工具检测感染病毒的细胞〔3〕。到 80 年代后期, 原位杂交技术开始应用于植物基因表达
调控的研究〔4～ 6〕。
植物基因的时空表达研究是探讨植物生长发育机制的重要手段。由于 RNA 原位杂交技术能够精
确确定基因表达的时空分布, 而得到了越来越广泛的应用; 从营养器官生长发育〔7～ 9〕、生殖器官生长发
育〔10～ 13〕、自交不亲和性〔4〕、胚胎发生〔14, 15〕到种子和果实发育〔16, 17〕诸方面均有涉足。最近, 我们通过对
RNA 原位杂交技术的优化〔18〕, 在研究植物有性生殖、胚胎发生和光合器官发育等过程中的基因时空表
达方面获得了若干有意义的结果〔19～ 22〕。笔者拟从RNA 原位杂交技术的基本原理、操作流程、应用范围
以及应用前景作一简要介绍和讨论。
1　RNA 原位杂交的基本原理
原位杂交技术是从 Southern 和N o rthern 杂交技术衍生而来的, 可以分为染色体原位杂交和 RNA
原位杂交。染色体原位杂交是用标记的DNA 或寡核苷酸等探针来确定目标基因在染色体上的位置 (不
在本文讨论)。RNA 原位杂交是用同位素 (如3H、35S 和32P 等) 或非同位素〔如地高辛 (D IG) 和生物素
(B IO ) 等〕标记的双链DNA 或单链反义 RNA 探针, 对组织切片或装片的不同细胞中基因表达产物
mRNA (或 rRNA〔23〕)进行原位定位。分布于细胞中的mRNA 与反义RNA 探针互补而杂交产生双链的Ξ 收稿日: 1998211218, 修回日: 1999203229。第一作者: 男, 1956 年 11 月出生, 副教授, 博士, 从事植物发育生物学与分子生物学研究。国家自然科学基金重点项目资助课题 (批准号: 39730260)。
RNA。标记在反义链上的同位素经放射自显影; 非同位素经酶促免疫显色或免疫荧光反应而显示
mRNA 在植物组织细胞中的分布位置。用标记的有义RNA 作探针, 因与细胞内的mRNA 不互补而不能
杂交, 可以作为对照。植物生长发育过程中的基因表达有时空顺序差异。特异表达基因的转录产物
mRNA , 会在植物器官的特定发育时期和特定组织中检测到; 而非特异表达的mRNA 也会在不同发育
阶段和不同组织中检测到。
2　RNA 原位杂交的操作流程
操作过程应尽量避免 RN ase 污染, 耐高温器皿 180℃烘烤 8 h 以上, 其它器皿用氯仿冲洗; 溶液用
0. 1% 焦碳酸二乙酯 (D EPC) 处理或D EPC2H 2O (D EPC 处理过的蒸馏水) 配制, D EPC 是一种 RN ase 强
烈抑制剂。
RNA 原位杂交的操作流程为 (以组织切片和D IG 标记RNA 探针为例) : 材料固定与包埋→制片→
质粒DNA 线性化→D IG 标记的体外转录→预杂交→杂交→杂交后处理→免疫反应→显色反应→封片
观察。
材料固定是RNA 原位杂交非常重要的第一步, 其目的是保持细胞形态和核酸结构的完整性。固定
液有许多种, 一般可以分为促凝剂类和非促凝剂类, 前者沉淀大分子〔24〕而后者则交联蛋白质与
RNA〔25〕。促凝剂类又可分为酸性固定液和碱性固定液。酸性固定液能较好地保存染色质、核仁、纺锤体;
细胞质凝结成网状, 而有些细胞器如线粒体会溶解。酸性固定液包括 FAA、FPA、Cham berla in 液、
Carnoy 液和 Farm er 液等。碱性固定液能选择性地保存一些细胞结构, 如线粒体、核仁, 有时还有液泡;
但染色质、纺锤体以及细胞质的其它结构将被降解。非促凝剂起初用于电镜制片的材料固定, 现在因其
能很好地保存细胞结构也被光镜制片广泛应用。常用的非促凝剂包括戊二醛、丙烯醛和甲醛 (衍生于多
聚甲醛)等。丙烯醛和甲醛的交联能力比戊二醛弱, 但渗透性强。原位杂交的探针在固定组织中的渗透性
是很重要的, 所以丙烯醛和甲醛要比戊二醛更可取。然而, 实际操作中常用 2. 5% 多聚甲醛+ 0125% 戊
二醛的混合物。这样, 既使探针容易渗入又使细胞结构完整。
制片方法有多种, 如冷冻切片、石蜡包埋切片、PEG 包埋切片、树酯包埋切片以及微小材料的整体
装片。冷冻切片的优点是速度快, 不需要花太长的固定和包埋时间, 尤其对谷粒等坚硬材料有利; 缺点是
组织切片不容易保持完整性。石蜡切片应用最广泛, 因为其切片能较好地保持细胞形态并能长期保存。
PEG 和树酯包埋切片能够保持更加精细的细胞结构, 对胚珠等幼嫩材料尤为有利。为了牢固粘贴切片
而不致于在脱蜡、脱水、复水、预杂交、杂交、冲洗等一系列复杂过程中脱落, 粘贴剂的选择是很重要的。
一般采用 50 ΛgömL 多聚赖氨酸或 0115%～ 1% 明胶+ 0101%～ 0125% 硫酸铝钾。将洁净玻片浸入粘贴
溶液中使整个玻片都涂上粘贴剂。
探针有三种类型: DNA 探针、RNA 探针和寡核苷酸探针。双链DNA 探针最先用于原位杂交, 其优
点是比RNA 探针难以降解, 分子量大 (> 1 kb)能在细胞内形成网络而放大信号。其缺点是在组织内难
以穿透而影响效率。双链DNA 探针必须经变性以获得能与靶链杂交的单链, DNA 的重退火也会降低探
针的杂交能力。RNA 探针使用最为广泛, 其优点是比双链DNA 敏感性强, 不需要变性。RNA 2RNA 比
DNA 2RNA 要稳定得多, 而且可以使用较高的杂交和洗涤温度以减少非特异性信号。RNA 探针的最大
优点是反义和有义链都可以分别体外转录, 而有义链可作为非特异性杂交的背景对照。使用 RNA 探针
最关键的注意事项是防止 RN ase 污染。寡核苷酸探针是单链DNA , 很容易化学合成, 它们一般很短
(30～ 50 bp ) , 可以通过已发表的资料选择序列。寡核甘酸探针因为链短而容易在组织中扩散。其缺点是
因末端标记的量少而影响其敏感性, 并因杂交体的热不稳定性而引起杂交特异性的明显降低。
探针标记物大致分为同位素和非同位素两类。选择何种标记物主要依据不同要求, 如敏感性、速度、
分辨率和安全性而定。但是, 这些因素有时是相互冲突的。我们一般将分辨率和敏感性作为主要因素来
综合考虑。同位素标记物主要有32P、35S、3H。它们都是以不同的动能发射 Β粒子。32P 以高能 Β粒子引起
85 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　　
较宽范围的银粒散射而在短期内 (3～ 5 d) 产生可检测到的信号, 但没有单细胞水平的分辨能力, 适合于
组织区域性快速mRNA 定位。3H 具有最低的比活性和 Β粒子发射穿透力, 能获得很高的分辨率但需要
长达 3～ 6 周的放射自显影过程。原位杂交的敏感性和放射性自显影效果最好的是35S, 能在较短时间内
(5～ 10 d)获得较高分辨率的细胞 RNA 定位, 应用最为广泛。非同位素标记物主要有B IO、D IG、二硝基
苯酚、溴脱氧尿苷等, 为半抗原物质, 通过免疫酶促显色反应、免疫荧光反应或胶体金〔26〕来检测其信号。
以前因非同位素标记探针比同位素标记探针敏感性和分辨率差而较少使用。现在, 非同位素标记探针不
仅在精确定位方面达到或超过了同位素标记探针水平, 而且还具有同位素标记探针所没有的优点〔26〕。
例如, 免疫荧光系统可以多级放大, 提高信号的检出率和信噪比; 可与各种显微摄影技术 (如共聚焦激光
扫描显微镜、数字成像系统等) 配合进行精确的比色定量定位分析; 能使用两种以上的探针同时标记不
同的靶RNA 进行多色荧光原位杂交。另外, 非同位素标记探针还有安全、保存时间长、操作方便等优点。
DNA 和寡核苷酸探针标记的方法有随机引物法、缺口平移法和 PCR 法等, RNA 探针标记的方法为体
外转录。
预杂交有两个目的: 一是使探针更易接近靶 RNA ; 二是降低非特异性杂交背景。动物组织的预杂交
处理包括 012 mo löL HC l 处理、70℃热处理 (冷冻切片)、蛋白酶 K 处理和乙酰酐处理。酸处理打断
mRNA 二级结构, 分离多核糖体; 热处理使切片粘贴更加牢固; 蛋白酶 K 部分消化细胞蛋白质以及打断
蛋白质与RNA 的交联; 乙酰酐可中和组织中的正电荷以减少探针的非特异性杂交。植物组织原位杂交
借鉴了这些处理步骤〔27〕, 但不同的作者均作了必要的修改〔28, 29〕。我们用 012 mo löL HC l 打断mRNA 的
二级结构, 用 1% 牛血清白蛋白封闭切片上的正电荷, 得到了信号强、背景低的最佳效果〔18〕。
杂交条件对杂交信号的特异性和敏感性影响很大。主要参数包括温度、探针浓度和杂交持续时间,
它们随探针长度和溶液与组织对探针的竞争性不同而变化。常用杂交温度为 40℃和 45℃〔5, 6〕, 但其范围
可以为 37～ 60℃〔27, 29〕。尽管杂交信号在几小时内就可检测到, 但为了方便起见, 一般都在湿盒内过夜。
杂交液成分在不同的研究中有些变化, 但都含有盐、甲酰胺、葡聚糖、二硫苏糖醇和 RNA 传递体〔如po ly
(A )和酵母 tRNA 〕等。高浓度盐促进稳定; 甲酰胺降低杂交所需温度; 葡聚糖逐渐析出杂交液中的水分
而相应增加探针浓度以提高杂交效率; 二硫苏糖醇减少探针的非特异性杂交背景; RNA 传递体使探针
均匀分布。另外, 还有一些成分如D enhardt’s 液能减少探针的非特异性杂交, 但常被省除〔29〕。
杂交后处理的目的是通过严格的清洗而除去过量的探针。对于 RNA 探针还可以用RN ase 消化。
同位素标记探针与组织切片中靶RNA 杂交后, 用X2光片或乳胶进行放射自显影。显影时间长短主
要取决于mRNA 丰度和标记探针的同位素种类。乳胶的稀释既要混匀又要少搅拌, 以免产生气泡而增
加背景颗粒。可以先将几张空白载玻片浸入乳胶以除去气泡。乳胶不能重复使用。放射自显影后的切片
染色有多种染料。Dow 等〔23〕比较了曙红 Y、俾士麦棕、氯唑黑、固绿、甲苯胺蓝和天青B。他们的结果显
示, 用天青B 和甲苯胺蓝对染获得最好的组织染色和银粒反差。非同位素标记探针杂交后, 进行免疫酶
促显色反应或免疫荧光反应。以D IG 标记探针为例, 在抗D IG 抗体免疫反应过程中, 胎牛血清、正常绵
羊血清和正常兔血清均能起封阻作用。组织中的内源碱性磷酸酶能严重干扰显色过程。L evam iso le 是哺
乳动物碱性磷酸酶的有效抑制, 但对植物内源碱性磷酸酶的抑制效果不佳, 而现在还没有找到一种理想
的抑制剂〔29〕。52溴2氯232吲哚磷酸 (BC IP) 2氮蓝四唑 (NBT ) 显色反应很慢, 导致反应中间产物 (吲哚酚)
渗出至反应液中, 从而干扰杂交位点的精确定位并引起终产物的损失而降低信号。B lock 等〔30〕发现, 聚
已烯醇 (PVA )能减少这种渗出而增强信号。他们的实验结果表明, 10% 的 10 kD a PVA 能增强信号 5～
10 倍, 10% 的 70～ 100 kD a PVA 能增强信号至少 20 倍。
原位杂交不仅可以精确确定靶mRNA 的时空表达位置而且能够定量分析其表达水平。当然, 现在
还不能计算杂交体的绝对量以及与靶mRNA 拷贝数的关系。事实上, 很难使RNA 保存率和杂交变化率
以及控制程序标准化, 而只能将供试组织与对照作相对定量分析。通常通过杂交细胞的闪烁计数或核乳
胶放射自显影颗粒进行定量分析〔31〕; Dow 等〔23, 31〕通过乳胶银粒计数对 rRNA 作定量分析, 从而估算出
95　第 1 期　　　　　　　　陈绍荣等: RNA 原位杂交技术及其在植物基因表达研究中的应用
核糖体相对数量。N urnez 等〔32〕对杂交组织放射自显影的X2光片进行光密度分析, 将光密度测量数据与
校正曲线比较并转换成单位放射活性浓度。
3　RNA 原位杂交与其它技术的结合
原位杂交技术与其它技术的结合使用, 是深入了解基因表达调控机制的必要手段。与 N o rthern、
Southern 杂交以及免疫组织化学方法结合, 可以了解基因转录水平和转译水平的调控机制。Giaid 等〔33〕
将原位杂交与免疫定位先后在同一切片上使用得到满意结果。Dow 等〔23〕将原位杂交与共焦激光扫描显
微镜和计算机画面处理的三维重构技术结合, 计算出玉米胚囊中各细胞的核糖体的相对数量。R aikhel
等〔34〕将原位杂交与活体内标记结合, 研究了小麦胚芽凝集素mRNA 转录全过程。研究基因时空表达特
征的RNA 原位杂交技术从光镜水平发展到了电镜水平〔35〕。
4　RNA 原位杂交在植物基因表达研究中的应用范围
4. 1　特异基因表达定位
RNA 原位杂交技术从一开始就主要用于特异基因表达的空间定位〔2〕, 不但用于正常植物各种器官
组织发育, 而且用于体外培养器官发育的基因表达定位〔6, 36, 37〕。M artineau 等〔5〕用RNA 原位杂交技术检
测 C4 植物玉米叶片发现磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (PEPCase)mRNA 只在叶肉细胞中积累, 而核糖 1, 52
二磷酸羧化酶 (R uBPCase)大亚基mRNA 局限于维管束鞘细胞中表达。U ch ino 等〔38〕进一步发现两栖苔
草 E leocharis v iv ip ara 在陆生状态下为 C4 植物, PEPCase 和R uBPcase 小亚基mRNA 分别在叶肉细胞
和维管束鞘细胞中表达; 在淹水条件下为 C3 植物, R uBPcase 小亚基mRNA 在两种细胞中都表达,
PEPCase mRNA 则都不表达。Coen 等〔39〕通过原位杂交发现, 调控金鱼草花序与花芽转型分生组织的
f lo 基因, 短暂地表达于花芽发育的很早时期。f lo 基因最早在苞片原基中, 然后在萼片、花瓣和心皮原基
中表达, 但不在雄蕊原基中表达。
4. 2　非特异基因表达定位
非特异表达基因虽然没有器官组织的表达特异性, 但在植物发育过程中的不同阶段有着表达量的
时空差异〔40, 41〕。我们〔19～ 21〕以钙调素或磷酸化酶反义RNA 为探针, 研究烟草和水稻有性生殖过程中钙调
素和磷酸化酶基因的表达特征, 发现钙调素基因主要在烟草和水稻花药发育早期强烈表达, 集中在绒毡
层、药隔维管束、花粉母细胞等部位, 到发育成熟阶段则在表皮毛和花粉萌发孔等部位集中表达。水稻雌
蕊中的钙调素基因主要在柱头、花粉管通道和退化助细胞中表达。水稻雌蕊中的磷酸化酶基因在柱头、
花柱、子房壁以及维管组织中大量表达, 而胚珠中除合点部位外表达很弱。积累淀粉的胚乳细胞在初期
分裂阶段就比其它组织的表达量高, 到成熟阶段则强烈表达。W eber 等〔16〕研究了蔗糖运载体基因
(V f SU T 1)和己糖运载体基因 (V f T P 1)在蚕豆 (V icia f aba)种子发育过程中的表达特征。这两个基因的
表达产物在营养器官和种子中都能检测到。在胚胎中, V f SU T 1 和V f T P 1 mRNA 只在表皮细胞中检测
到, 并有不同的时空特征。V f T P 1 mRNA 在覆盖具有有丝分裂活性的薄壁组织的表皮细胞中积累, 而
V f SU T 1 mRNA 则在覆盖传递细胞和储藏组织的表皮细胞中表达。
4. 3　分离基因的功能分析
当前, RNA 原位杂交技术应用最广泛的方面是结合其它技术对分离的基因进行分析。其主要步骤
包括 cDNA 文库构建、文库筛选、Southern 和N o rthern b lo ts 分析、DNA 序列分析以及原位杂交定位分
析等〔41〕。其材料可以是正常植株或转座子, T 2DNA 以及其它方法产生的突变体〔37～ 39〕。T such iya 等〔46, 47〕
用水稻小孢子发育阶段的花药建立 cDNA 文库, 并通过差异筛选分离出两个小孢子时期花药优势表达
cDNA (O sc4,O sc6)。cDNA 核苷酸序列和推演的氨基酸序列与已知的分子没有明显的同源性。N o rthern
b lo t 表明O sc4 和O sc6 在单核小孢子期的花药中强烈表达, 而在二核和三核花粉期的花药中不表达。
RNA 原位杂交进一步揭示O sc4 和O sc6 只在单核小孢期花药的绒毡层中表达。这样为O sc4 和O sc6 的
06 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　　
功能分析提供了有用的资料。N adeau 等〔13〕用差异筛选法从不同发育时期的蝴蝶兰胚珠中分离出 7 个
cDNA 克隆 (O 39,O 40,O 108,O 126,O 129,O 137, 0141)。N o rthern b lo t 揭示, 4 个克隆仅在胚珠组织中表
达, 并具发育阶段特异性; 1 个为花粉管特异; 另外 2 个为非特异性克隆。再通过序列分析和原位杂交确
定了O 39 等 5 个基因的功能和时空表达位置。L uo 等〔48〕从金鱼草中分离出第一个控制花不对称性基因
(cy cloid ea)。cy cloid ea 基因在非常早的时期就在花芽分生组织的远轴区域表达, 此区域直接影响生长原
基的起始和生长速率。cy cloid ea 基因在远轴内一直表达到发育后期, 从而影响了花瓣和雄蕊的不对称
性、细胞大小和形态。在结合 RNA 原位杂交技术分析分离基因的功能方面已积累了相当丰富的资
料〔49～ 53〕。
4. 4　基因家族的功能差异分析
基因家族成员在结构和功能方面既有同源性〔10〕又有时空表达差异〔54〕。乙烯受体基因家族已分离出
5 个成员 (E T R 1、ER S 1、E T R 2、E IN 4、ER S 2)。H ua 等〔55〕以拟兰芥为材料, 用RNA 原位杂交技术检测这
5 个成员的表达特征, 发现它们虽然都属于广泛表达基因, 但有明显的时空表达差异。现在研究最为广
泛的是M AD S box〔56～ 58〕和Hom eobox〔59, 60〕等基因家族成员。
4. 5　外源基因在转基因植物中的表达定位
导入外源基因可以引起转基因产生各种类型的突变, 而这些突变体是用于基因分离和功能分析、植
物器官组织发育机制研究以及遗传育种的有用材料〔9, 11, 61〕。烟草 TA 56 基因启动子在不同发育时期花药
的环形细胞团、裂口和药隔部位有表达活性。Beals 等〔62〕将细胞毒素 TA 56öbarnase 基因与分别连结于三
种不同启动子 (T P 12、TA 20、L ECT IN )的抗细胞毒素 barstar 基因同时导入烟草植株。用原位杂交技术
检测含有 TA 56öbarnase 和 T P 12öbarstar 基因的花药。结果指出, barstar 和 barnase mRNA 均存在于含
有 TA 56öbarnase 和 T P 12öbarstar 基因的花药中; barstar mRNA 表达水平高于 barnase mRNA 表达水
平; 内源 T P 12 和 TA 56 mRNA 在 barnaseöbarstar 复合体存在条件下而免受降解。
4. 6　外源刺激引起的基因表达定位
外源刺激因素有光照、激素、高温、低温、糖、盐等等。P rocissi 等〔63〕用不同光照处理发育过程中的玉
米种子, 原位杂交实验显示其色素调节基因有光依赖性的时空表达差异。Peck 等〔64〕用乙烯处理蚕豆, 引
起豆荚钩状结构顶端不对称性伸长, 其基因表达有明显的位置差异。Perata 等〔38〕发现糖抑制大麦胚胎
中赤霉素依赖性信号传递途径, 赤霉素诱导的 Α2淀粉酶mRNA 的表达在糊粉层细胞内未受影响, 但在
胚胎细胞中受到抑制, 仅在盾片上皮细胞中表达。
5　RNA 原位杂交的应用前景
植物基因表达调控的研究, 对于深入探讨植物细胞代谢、分裂、分化机制, 有效控制植物生长发育的
生命过程有着十分重要的意义。RNA 原位杂交能够确定细胞甚至亚细胞水平的基因表达的时空特
征〔65〕, 对于植物生长代谢、成花过程育性转换、受精与胚胎发生等生命活动中的基因表达调控机制提供
直接的资料。原位杂交技术还会与其它分子生物学技术、显微操作技术、免疫学技术等结合, 深入研究基
因的结构、功能和表达的调控机制。发育调控基因的分离与功能分析可能会成为最热门的课题。在这方
面, 国内工作起步较迟, 需要进一步加以应用。
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