全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (5): 661~667　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0313 661
收稿 2014-07-07　　修定 2014-11-24
资助 辽宁省科技计划项目(2012214001)和沈阳大学重点实验室
基金项目(SYU-KF-L-05)。
* 通讯作者(E-mail: ji.lanzhu@iae.ac.cn; Tel: 024-83970302)。
虎杖提取物对黄瓜防御酶系的影响
王远遐1,2, 姬兰柱1,*, 刘艳1, 易雪梅1,2, 张悦1,2
1中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳110016, 2中国科学院大学, 北京100049
摘要: 本文采用热回流法提取虎杖乙醇提取物, 测定不同浓度虎杖提取物处理下，黄瓜幼苗叶片中过氧化物酶(POD)、多
酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶(CHT)和β-1,3-葡聚糖酶(GLU)等活性的变化。结果表明, 40 mg·L-1虎杖
提取物处理下, 黄瓜叶片POD和GLU (2~5 d)活性明显高于对照, PPO和CHT活性呈现M型变化趋势, 且PPO、PAL和CHT活
性与对照相比变化无规律。400 mg·L-1虎杖提取物处理的黄瓜幼苗叶片的POD、PPO和CHT活性明显高于40 mg·L-1的, 但
也一定程度上降低了GLU活性。
关键词: 虎杖; 黄瓜; 防御酶系
Effect of Extract of Polygonum cuspidatum on Defensive Enzymes of Cucumis
sativus
WANG Yuan-Xia1,2, JI Lan-Zhu1,*, LIU Yan1, YI Xue-Mei1,2, ZHANG Yue1,2
1Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China; 2University of Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100049, China
Abstract: The ethanol extract was obtained from Polygonum cuspidatum by hot reflux extraction. The activities
of peroxidase (POD), polyphenol oxidase (PPO), phenylalanine ammonialyase (PAL), chitinase (CHT) and
β-1,3-glucanase (GLU) in leaves of Cucumis sativus seedling were measured under different concentrations of
extract of P. cuspidatum. The results showed that under the treatment of 40 mg·L-1 extract, the activities of POD
and GLU (2–5 d) of cucumber leaves were higher than those of control. And the activities of PPO and CHT
showed a trend of M. Compared with the control, the activities of PPO, PAL and CHT were irregular. Under the
treatment of 400 mg·L-1 extract, the activities of POD, PPO and CHT were obviously higher than those of 40
mg·L-1 extract, but the activity of GLU was decreased at a certain extent.
Key words: Polygonum cuspidatum; Cucumis sativus; defensive enzymes
虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物, 又名阴阳
莲、黄低榆、斑杖、苦杖、汤酸杆等, 药用部位
为根及根茎, 根茎富含大黄酸、大黄素、大黄素
甲醚等羟基蒽醌类化合物, 具有抗炎、抑菌、抗
病毒及抗肿瘤等多种生理活性(国家药典委员会
2010; Meng等2010)。
近年来, 虎杖临床应用广泛, 成为医药界的研
究热点之一。陈文强等(2012)研究表明, 虎杖内生
放线菌发酵液对大肠杆菌(Escheichia coli)、沙门
氏菌(Salmonella typhl)、白色念珠菌(Monilia albi-
can)等有不同程度的抑菌活性。公衍玲等(2008)研
究不同产地虎杖药材的有效成分含量及抑菌活性,
结果表明不同产地虎杖的白藜芦醇含量有显著性
差异, 而大黄素含量无明显差异, 同时, 各地虎杖
对金黄色葡萄球菌(Staphylococlus aureus)和枯草
杆菌(Bacillus subtilis)的抑菌活性均较强。卢成瑛
等(2005)通过正交实验得到在90%乙醇作为溶
剂、60 ℃的提取条件下处理3 h, 湘西虎杖提取物
对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌(Shigella
dysenteroae)生长的抑制效果明显, 但对酵母菌
(Saccharomyces cerevisiae)无明显的效果。冯晓元
等(2005)用菌丝生长速率法测定虎杖提取物对桃
褐腐菌(Monilinia fructicola)的抑制作用。Herger
等(1988)的研究表明, 虎杖叶子的提取液不仅对葡
萄白粉病菌(Uncinula necator)显示出很好的抑菌
活性, 而且有助于提高葡萄的抗病性。以上研究
均证明, 虎杖除具有良好的生理活性之外, 对多种
植物病原菌也有明显的抑制作用, 作为植物源杀
植物生理学报662
菌抑菌剂有一定的研究前景。
植物诱导抗病性最早发现于20世纪初, 60年
代开始有比较系统的研究, 现已成为国际上农业
研究领域的热点, 并被认为是植物保护的一种新
途径、新技术(Herger等1988)。植物诱导抗病性是
指植物受物理的、化学的或生物的诱导物处理后,
对有害病原物侵染产生抗性的现象 (刘堆淑
2008)。迄今, 已发现2,6-二氯异烟酸(INA)、苯并
噻唑类制剂(BTH)和氨基丁酸(BABA)等多种诱导
物可诱导黄瓜产生对病原菌的抗性 (刘喜存等
2006)。诱导抗病性使植物代谢物质发生改变, 引
起植物体内生理生化变化, 主要包括可溶性碳水
化合物和酚物质含量增加、活性氧迸发、植物保
卫素的产生和积累、植物防御酶系多种酶活性的
变化及病程相关蛋白的积累等(李堆淑2008; 范志
金等2005)。植物防御酶与植物抗病性有着密切的
关系, 对植物防御酶活性的诱导是植物最重要的
一种生理生化抗病机制。张莉等(2007)的研究表
明, 虎杖提取物通过作用于几丁质酶、苯丙氨酸
解氨酶和β-1,3葡聚糖酶, 在常温下即可对青霉病
原菌(Penicillum expansum)引起的梨(Pyrus bret-
schneideri)果实青霉病的发病率和病斑直径显示
出明显的抑制效果。张弘等(2007)对虎杖不同根
溶剂提取物的研究表明, 在所选择的5种萃取溶剂
中, 乙醇提取率最高, 用于防治黄瓜白粉病, 具有
一定的实际应用价值。因此, 以虎杖乙醇回流提
取物为研究对象, 测定其对黄瓜叶片过氧化物酶
(peroxidese, POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxi-
dase, PPO)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammo-
nialyase, PAL)、几丁质酶(chitinase, CHT)和β-1,3-
葡聚糖酶(β-1,3-glucanase, GLU)等一些植物防御
酶活性的影响, 探究虎杖提取物对黄瓜诱导抗病
性的生理生化机制, 为其作为植物源农药的应用
和开发提供理论依据, 提高虎杖的应用价值。
材料与方法
1 供试植物
黄瓜(Cucumis sativus Linn.)品种为‘长春密
刺’, 由沈阳化工研究院农药生物测定中心提供。
2 提取物的制备及药液配制
虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)干
燥根茎, 购自沈阳东北大药房。将其进一步阴干,
粉碎, 40目过筛。
热回流法制备虎杖乙醇提取物, 称取根粗粉
50 g, 置于500 mL圆底烧瓶中, 加约200 mL乙醇,
水浴加热回流2~3 h, 振摇数次, 用布氏漏斗趁热滤
出提取液。药渣再加乙醇以浸没为度(约200 mL),
如上法再热提1次。残渣用布氏漏斗抽滤、压干,
弃去。合并2次提取液, 旋转蒸发仪减压浓缩至无
溶剂味为止, 提取物于4 ℃冰箱保存备用。称取虎
杖乙醇回流提取物, 用90%丙酮(丙酮:水=9:1)溶解
得到母液, 用含有0.1%吐温80的自来水稀释得到
40和400 mg·L-1的溶液各50 mL备用。
3 试材处理
黄瓜种子45 ℃温汤浸种20 min后, 移至常温下
浸种24 h, 在30 ℃恒温箱中催芽48~72 h, 选择芽势一
致的种子点播, 每盆1粒。播种后的纸杯放在温室中
于25~30 ℃条件下培养, 光照充足, 每24 h浇水1次,
保证土壤完全湿润。幼苗长至2叶1心期供实验用。
使用旋转台式作物喷雾机进行喷雾处理, 喷
雾压力为1.5 kg·cm-2, 喷液量约为100 mL·m-2, 即2
cm的叶片正反面喷匀, 用药量为0.5 mL。处理后
自然风干, 每个处理24株黄瓜苗, 处理后试材放置
在作物通风箱中晾干2~3 h。
虎杖提取物处理后1、2、3、5、7和9 d定时
取样, 每处理取3株黄瓜的叶片(第3叶)各1片, 将黄
瓜叶片用蒸馏水冲洗、吸干、称重, 迅速放入液
氮罐中冷冻, 然后移至–80 ℃冰箱中保存, 分别制
备粗酶液。
4 粗酶液的制备
4.1 过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙
氨酸解氨酶(PAL)粗酶液的制备
取黄瓜叶片样品, 放入研钵中, 按1:5 (W/V)加
入0.05 mol·L-1 pH 7.2的磷酸缓冲液(含1%乙烯吡
咯烷酮), 冰浴研磨成匀浆。将匀浆液全部移入离
心管中, 于10 000 r·min-1离心10 min, 上清液分装到
3个1.5 mL离心管中, 放入–80 ℃冰箱保存备用。
4.2 几丁质酶(CHT)和β-1,3-葡聚糖酶(GLU)酶液
的制备
黄瓜叶片样品放入研钵中, 按1:5 (W/V)加入
0.05 mol·L-1 pH 5.2乙酸钠缓冲液(含1%聚乙烯吡
咯烷酮), 冰浴研磨成匀浆。将匀浆全部移入离心
管中, 于10 000 r·min-1离心10 min, 上清液分装到2
个1.5 mL离心管中, 放入–80 ℃冰箱保存备用。
王远遐等: 虎杖提取物对黄瓜防御酶系的影响 663
5 酶活性的测定
5.1 过氧化物酶(POD)活性的测定
以愈创木酚作底物, 采用改进的沈其益等(1978)
的方法。反应体系包括1 mL 0.05 mol·L-1 pH 7.2的
磷酸缓冲液、0.5 mL 8% H2O2、1 mL 0.05 mol·L
-1
愈创木酚和适量酶液。加入酶液后在37 ℃下测定
2 min内的470 nm下的ΔOD值。对照以1 mL三蒸
水代替H 2O 2。酶活性单位 (U)为ΔOD·mg
-1(蛋
白)·min-1。
5.2 多酚氧化酶(PPO)活性的测定
参照廖春英等(2003)的方法测定PPO活性。
反应体系包括1.5 mL 0.05 mol·L-1 pH 6.8的磷酸缓
冲液、1.5 mL 0.05 mol·L-1的邻苯二酚和适量的酶
液混合均匀, 在37 ℃下测定398 nm波长下2 min内
OD的变化值(30 s记录1次)。空白以三蒸水代替酶
液。酶活性单位(U)为ΔOD·mg-1(蛋白)·min-1。
5.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定
参照胡景江等(1992)的方法并稍有改进。反
应体系包括1 mL 0.05 mol·L-1 pH 8.8的硼酸缓冲
液、20 mmol·L-1 L-苯丙氨酸和40 μL酶液混合均
匀。在40 ℃反应30 min, 然后加0.5 mL 20%三氯乙
酸终止反应, 3 000 r·min-1离心10 min, 测定上清液
在290 nm波长下OD值。空白以三蒸水代替酶液。
酶活性单位(U)为ΔOD·mg-1 (蛋白)·min-1。
5.4 几丁质酶(CHT)活性的测定
参照Berger和Reynolds (1958)的方法, 以胶体
几丁质为底物, 测定CHT活性。取胶状几丁质溶
液0.2 mL, 加入0.1 mol·L-1的乙酸缓冲液(pH 4.5)
0.1 mL、酶液0.2 mL (空白以三蒸水代替酶液), 混
合均匀。40 ℃反应1 h后, 流水冲洗冷却, 15 000
r·min-1离心2 min。取0.25 mL上清液, 加入40 μL
10%脱盐蜗牛酶, 37 ℃水浴反应1 h, 加入0.1 mL四
硼酸钾(0.8 mol·L-1)沸水浴3 min, 冷却后加二甲氨
基苯甲醛(DMAB) 2 mL, 混匀并在37 ℃保温20
min, 冷却后于585 nm下测定其OD值。同时建立
以N-乙酰氨基葡萄糖(NAG)标准曲线, 测定CHT活
性。以每小时1 mg蛋白从胶状几丁质中释放1 mg
N-乙酰氨基葡萄糖为一个酶活性单位(U) [1 mg
(N-乙酰氨基葡萄糖)·mg-1 (蛋白)·h-1]。
5.5 β-1,3葡聚糖酶(GLU)活性的测定
参照汤章城等(1999)的方法并有所改进。反
应体系包括0.1 mL (0.05 mol·L-1 pH 5.0的乙酸钠缓
冲液, 含1%昆布多糖)乙酸钠反应液、0.16 mL 0.05
mol·L-1的乙酸钠缓冲液(pH 5.0)和100 μL酶液(空
白以三蒸水代替酶液)混匀, 37 ℃保温1 h, 加入0.3
mL 3,5-二硝基水杨酸试剂煮沸5 min, 立即冷却, 定
容至3 mL, 于540 nm下测定其OD值, 采用DNS法
测定还原糖的量。同时以葡萄糖制标准曲线。以
1 mg·h-1蛋白还原昆布多糖释放1 mg葡萄糖为1个
酶活性单位(U) [1 mg (葡萄糖)·mg-1 (蛋白)·h-1]。
6 数据分析
利用Origin软件和SPSS软件进行数据处理与
分析。
实验结果
1 虎杖提取物对黄瓜叶片过氧化物酶(POD)活性
的影响
由图1可知, 40和400 mg·L-1的虎杖提取物处
理使黄瓜叶片POD活性明显升高。40 mg·L-1虎杖
提取物处理的黄瓜叶片POD活性从第3天起逐渐
升高, 第7天达到峰值(6.053 U), 然后略有下降。
400 mg·L-1虎杖提取物处理的POD活性也从第3天
起急剧上升, 第9天达到峰值(10.973 U), 并且明显
高于40 mg·L-1虎杖提取物处理和对照。
2 虎杖提取物对黄瓜叶片多酚氧化酶(PPO)活性
的影响
由图2可知, 对照的PPO活性上升, 在第2天和
第9天分别达到峰值。40 mg·L-1虎杖提取物处理的
PPO活性呈现M型变化趋势, 在第2天和第5天达到
图1 虎杖提取物处理后黄瓜叶片POD活性的变化
Fig.1 Changes in POD activity of cucumber leaves after
treatment with extract of P. cuspidatum
植物生理学报664
在第2天活性最低为0.480 U, 然后上升, 第9天达到
最大值, 峰值为1.020 U, 明显高于其他两种处理。
4 虎杖提取物对黄瓜叶片几丁质酶(CHT)活性的
影响
由图4可知, 随着时间延长, 对照的CHT活性
先上升后下降再上升。40 mg·L-1虎杖提取物处理
的CHT活性呈现M型变化趋势, 在第2天和第7天达
到峰值, 分别为0.262和0.253 U, 之后急剧下降。
400 mg·L-1虎杖提取物处理的CHT活性在第2天下
降至最低为0.178 U, 第3天起CHT活性逐渐上升,
变化趋势与40 mg·L-1虎杖提取物处理的一致; 第7
天达到峰值0.372 U, 显著高于其他两个处理; 第9
天略微下降, 但也高于其他处理。
峰值, 分别为1.590和3.050 U, 第2个高峰比对照提
前, 之后下降。400 mg·L-1虎杖提取物处理的PPO
活性随处理时间持续上升, 从第3天起高于其他两
个处理, 并且在第9天达到3.960 U, 与其他两个处
理差异显著。
3 虎杖提取物对黄瓜叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)
活性的影响
由图3可知, 对照的PAL活性呈现M型变化趋
势, 而虎杖提取物处理的都是先下降后升高。40
mg·L-1虎杖提取物处理的PAL活性在第3天活性最
低为0.485 U, 之后逐渐上升, 在第9天到达高峰, 峰
值为0.820 U。而400 mg·L-1虎杖提取物处理的PAL
图2 虎杖提取物处理后黄瓜叶片PPO活性的变化
Fig.2 Changes in PPO activity of cucumber leaves after treat-
ment with extract of P. cuspidatum
图3 虎杖提取物处理后黄瓜叶片PAL活性的变化
Fig.3 Changes in PAL activity of cucumber leaves after treat-
ment with extract of P. cuspidatum
图4 虎杖提取物处理后黄瓜叶片CHT活性的变化
Fig.4 Changes in CHT activity of cucumber leaves after treat-
ment with extract of P. cuspidatum
5 虎杖提取物对黄瓜叶片β-1,3葡聚糖酶(GLU)活
性的影响
由图5可知, 对照的黄瓜叶片GLU活性缓慢上
升, 但变化不明显。40 mg·L-1虎杖提取物处理的
GLU活性从第1天起迅速上升 , 第3天达到峰值
2.800 U, 然后迅速下降; 第7天达到最低值, 接近
400 mg·L-1虎杖提取物处理的。而400 mg·L-1虎杖
提取物处理的GLU活性先下降后上升再下降, 基
本低于其他处理, 由此说明, 400 mg·L-1虎杖提取物
处理没有提高GLU活性。
讨　　论
大量研究表明, 植物的抗病性是体内抗病基
王远遐等: 虎杖提取物对黄瓜防御酶系的影响 665
因及这些基因通过酶蛋白的表达、调控抗病物质
的产生来决定的。POD与植物抗病性反应的密切
关系, 表现在清除活性氧、阻止活性氧形成时的
重要作用(Xu等2008; 阚光锋2002)。本实验中, 虎
杖提取物诱导黄瓜叶片后, 其体内POD活性迅速
上升 , 400 mg·L-1处理的POD活性明显高于40
mg·L-1处理及对照, 且有继续升高的趋势, 这与赵
娟(2012)的研究结果不尽相同, 说明虎杖提取物处
理后, 可能就是通过增加POD活性激活黄瓜本身
清除体内活性氧的能力、诱导抗病代谢过程的发
生。另一方面, POD与超氧化物歧化酶(SOD)、过
氧化氢酶(CAT)共同构成植物体内的防御酶系, 协
同作用于植物体内的有效活性氧清除系统。萨日
娜(2012)对不同品种马铃薯(Solanum tuberosum)抗
病机制的研究表明, 抗性除了其本身基因外, 与体
内防御酶系(CAT、SOD和POD)也有密切关系, 防
御酶活性提高的时间早晚、变化幅度大小, 因品
种及环境条件等多种因素而异, 这也可以作为马
铃薯抗病机理研究的又一个线索性生理指标。而
探索黄瓜叶片内CAT和SOD对虎杖提取物的响应
机制, 以及POD与CAT、SOD之间的协同作用, 这
也为进一步实验提供新的思路。
植物的抗病物质包括植保素、木质素和萜类
化合物 , 这些物质均是重要的次生代谢产物。
PAL、POD和PPO可形成多种抗菌作用产物, 是抗
病反应中的关键酶(袁瑞玲等2008)。PAL是植物抗
病代谢莽草酸途径的关键酶和限速酶, 是与细胞
内木质素的生成和沉积有关的防御酶(李世贵等
2010)。而POD和PPO也是植保素、酚类物质合成
的重要酶(闫艳华等2011; 张林青等2008)。陈庆河
等(2003)对防御酶系(PAL、POD和PPO)的研究表
明, 番茄(Lycopersicon esculentum)经青枯无毒菌株
(Ralstonia solanacearum)处理后, 体内与抗病反应
有关的PAL、POD和PPO活性显著增加, 且PAL活
性变化最敏感。这与本实验的研究结果大体一致,
当黄瓜叶片受到虎杖提取物的直接诱导后, POD、
PPO和PAL活性均有不同程度升高。400 mg·L-1处
理PPO活性高于40 mg·L-1, 40 mg·L-1处理时出现2
个高峰, 且第2个高峰较对照提前, 说明虎杖提取
物对PPO活性有良好的诱导激活作用。400和40
mg·L-1虎杖提取物处理PAL活性均先下降后上升,
且最低值分别出现在第2和3天, 第9天显著高于对
照, 说明PAL活性对虎杖提取物诱导相当敏感。而
张晓静(2012)以山药(Dioscorea opposite)叶片4种
不同溶剂提取液处理接种白粉病的黄瓜幼苗, 其
叶片内防御酶活性变化的强度和幅度均有明显差
异, PAL、POD和PPO活性均呈现先升高后降低的
趋势。姜爱丽等(2009)研究纳他霉素与维生素C联
用前后对采后甜樱桃(Cerasus avium)中PAL、POD
和PPO的活性比较, 发现联用后酶活性比单用有显
著的增加, 证明3种酶之间存在协同抗病作用。以
上研究中涉及的不同溶剂处理导致的防御酶活性
差异以及不同防御酶之间的协同作用, 也为进一
步实验提供拓展性的建议。
CHT和GLU是植物建立系统抗病性的标志
酶, 与果实抗病性也有密切关系, 其酶活性的提高
是植物抗逆性增强的很好体现。几丁质和β-1,3-葡
聚糖是真菌细胞壁的主要成分, 可分别被CHT和
GLU降解, 因此, CHT和GLU可以破坏许多病原真
菌细胞壁, 造成细胞死亡(张莉等2007)。包妍妍
(2013)的研究中, 西芹(Apium graveolens)鲜根及根
际区物丙酮浸提液处理黄瓜叶片后, CHT和GLU
活性均高于对照, 且与黄瓜枯萎病(Fusarium ox-
ysporium)发病率呈负相关。Zhang等(2011)研究发
图5 虎杖乙醇提取物处理后黄瓜叶片GLU活性的变化
Fig.5 Changes in GLU activity of cucumber leaves after treat-
ment with extract of P. cuspidatum
植物生理学报666
现, 损伤接种扩展青霉(Penicillum expansum)的苹
果(Malus pumila)采用β-氨基丁酸处理后, 其CHT
和GLU活性相比对照均有显著升高, 实验结果表
明β-氨基丁酸可诱导苹果与抗病性相关的关键性
酶活性。Jin等(2009)采用茉莉酸甲酯处理采后桃
(Prunus persica), CHT和GLU等与抗病性相关酶的
活性, 与对照相比均有增加, 从而有效提高采后桃
的抗病能力。本实验中, 虎杖提取物对黄瓜体内
CHT和GLU活性诱导作用不明显, 400 mg·L-1提取
物处理的CHT活性仅在后期超过对照, 第7天达到
峰值, 之后又呈下降趋势。而40 mg·L-1处理的CHT
活性保持在对照左右变化, 且幅度较大, 第9天活
性更趋于0。40 mg·L-1处理的GLU活性仅在第2~5
天高于对照, 而400 mg·L-1处理的GLU活性始终低
于对照, 说明400mg·L-1处理抑制GLU活性。这与
上述研究结果明显不一致, 由此可推测, CHT和
GLU并不是黄瓜体内抗病性发挥作用的主要原因,
这有待于进一步研究。
综上所述, POD、PPO、PAL、CHT和GLU共
同构成植物抗病密切相关的防御酶系。虎杖提取
物处理能诱导黄瓜叶片这5种酶呈现不同的变化
趋势, 这为进一步验证黄瓜体内防御酶与其抗病
机制的相关性提供基础, 为其进一步开发成生物
防治农药提供理论依据。
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