全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 1期，2010年 1月 4 7
收稿 2009-10-22 修定 　2010-01-04
资助 校院联合资助项目(070196)和新疆维吾尔自治区科技重
大专项(2 007 3113 8-3 )。
* 通讯作者(E-mail: zengyouling@xju.edu.cn; Tel: 0991-
8 5 8 3 2 5 9 )。
盐穗木甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的克隆及其在盐胁迫下的表达分析
关波, 胡有贞, 张富春, 曾幼玲 *
新疆大学生命科学与技术学院, 新疆生物资源基因工程重点实验室, 乌鲁木齐 830046
提要: 根据我们实验室已发表的植物甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)的同源保守区设计引物, 通过RT-PCR扩增获得了由1 503
个核苷酸组成的盐穗木BADH 基因开放阅读框, 推测该基因编码500个氨基酸, 分子量约为54.49 kDa的多肽。推测的盐穗
木 BADH氨基酸序列中包含一段甜菜碱醛脱氢酶中高度保守的十肽序列(VTLEL GGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨酸
残基(Cys)。序列比对结果显示, 盐穗木BADH 与盐地碱蓬、中亚滨藜、盐爪爪以及菠菜等的核苷酸序列同源性在 81%以
上, 与水稻的同源性也达到 68%。半定量 RT-PCR分析结果表明, 盐穗木 BADH基因的表达受盐胁迫诱导, 推测BADH可
能与盐穗木具有较强的耐盐能力有关。
关键词: 盐穗木; 甜菜碱醛脱氢酶; 基因克隆; 表达分析
Molecular Cloning and Expression Analysis of Betaine-Aldehyde Dehydroge-
nase Gene from Halostachys caspica (Bieb.) C. A. Mey
GUAN Bo, HU You-Zhen, ZHANG Fu-Chun, ZENG You-Ling*
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang
University, Urumqi 830046, China
Abstract: The complete open reading frame of betaine-aldehyde dehydrogenase (BADH) gene was cloned from
Halostachys caspica using the method of reverse transcription PCR (RT-PCR), and the primers were designed
according to the published sequences of BADH cDNA. The sequence of BADH was 1 503 bp, encoding a 54.49
kDa protein of 500 amino acids. The deduced amino acid sequence contained a conserved decapeptide sequence
(VTLEL GGKSP) of BADH and cysteine associated with enzyme function. The results of sequence alignment
showed that HcBADH shared 81% and above homology with BADHs from Suaeda salsa, Atriplex centralasiatica,
Kalidium foliatum and Spinacia oleracea, and shared a 68% homology with Oryza sativa. The results of semi-
quantitative RT-PCR revealed that the expression of HcBADH gene was induced by salt stress, and BADH might
be related to the salt tolerance of Halostachys caspica.
Key words: Halostachys caspica; betaine-aldehyde dehydrogenase; gene cloning; expression analysis
盐穗木为藜科盐穗木属中的盐生和旱生的多
汁半灌木植物, 耐盐性极强, 是盐土荒漠地区的主
要野生植物之一, 主要分布于新疆塔克拉玛干沙
漠、焉耆盆地、吐鲁番盆地以及天山北麓。许
多藜科植物都可以通过积累甜菜碱来应对盐胁迫和
水分胁迫。甜菜碱是细胞内无毒的广泛存在的一
类相容性有机溶质, 在盐胁迫下它可维持细胞的渗
透平衡, 有效地稳定酶以及蛋白复合体的季铵结构,
维持高盐浓度下膜的有序性(Chen和Murata 2008)。
一般来说植物中甘氨酸甜菜碱的合成途径为: 胆碱
在胆碱单加氧酶(choline monooxygenase, CMO)和
甜菜碱醛脱氢酶(betaine-aldehyde dehydrogenase,
BADH)的催化下经由两步氧化反应而生成甘氨酸甜
菜碱。自从Weretilnyk和Hanson (1990)从菠菜中
克隆得到 BADH基因后, 甜菜(McCue和 Hanson
1992)、碱蓬(Li等 2003; Moghaieb等 2004)、碱
茅(杨铮等2007)等植物的BADH基因也相继得到克
隆。本文从新疆盐生植物盐穗木中克隆获得了
BADH基因, 并对其在盐胁迫下的表达进行了分析。
材料与方法
盐穗木[Halostachys caspica (Bieb.) C. A. Mey]
种子采自新疆五家渠北沙窝盐碱干旱地, 植物培养
方法同曾幼玲等(2007)。植株长至同化枝长约 15
cm时, 用含有不同浓度(0、100、300、500、700
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mmol·L-1) NaCl的Hoagland营养液浇灌植株根部进
行胁迫处理, 4 d时收集各处理同化枝后放入液氮
中, 提取总 RNA。
反转录酶M-MLV、DNA 酶、ExTaq 酶、
pMD18-T测序载体、DNA 分子量标准以及其他
RT-PCR相关试剂均购自 Takara公司, 大肠杆菌
DH5α菌株为本实验室保藏菌。Trizol试剂购自
Invitrogen公司, PCR 产物回收试剂盒由北京天根
生物技术有限公司提供, PCR引物由上海生工生物
工程技术服务公司合成。其它试剂均为分析纯。
经盐处理的盐穗木同化枝用 Trizol法提取总
RNA。cDNA第一链的合成以及盐穗木 BADH开
放阅读框(ORF)的 PCR 扩增条件参考曾幼玲等
(2007), 略有改动。测序样品送上海生工生物工程
技术服务公司测序。
采用DNAman软件将获得的BADH基因进行
核苷酸及氨基酸序列分析, 并与GenBank (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)中的数据进行同源
性比对分析。
经不同浓度( 0、1 0 0、3 0 0、5 0 0、7 0 0
mmol·L-1) NaCl 处理的盐穗木同化枝总 RNA用无
RNA酶的DNA酶处理20 min, 以除去总RNA中的
DNA。以酚氯仿抽提除去DNA酶, 2倍体积的无
水乙醇沉淀总 RNA, 室温晾干后用无RNA酶的水
溶解, cDNA第一链的制备方法同上。用 Primer 5.0
设计盐穗木BADH特异性引物 rp1和 rp2作为半定
量检测引物, 引物序列为 rp1: 5 CAGCCTATTG-
GTGTTGTTGGAT 3; rp2: 5 CAGGATGAGATAC-
TAATGGTG 3, 扩增片段为 241 bp。PCR 反应条
件为 94 ℃预变性 2 min; 94 ℃变性 30 s, 59 ℃退火
30 s, 72 ℃延伸 30 s, 26 个循环; 72 ℃延伸 5 min。
反应产物进行 1.2%的琼脂糖凝胶电泳, 以Actin-2
为内参对照基因, 其扩增引物为Actin P1: 5 AAGAT-
CTGGCACCACACCTTC 3, Actin P2: 5 CACAC-
CATCACCAGAATCGA 3, 扩增片段约为 250 bp。
PCR 反应条件为94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s,
52 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 30 s, 26 个循环, 72 ℃延
伸 5 min, 反应产物进行 1.2%的琼脂糖凝胶电泳。
结果与分析
1 盐穗木BADH基因编码序列的获得
以提取的盐穗木总 RNA为模板, Oligo(dT)为
引物反转录得到第一链 cDNA, 再以第一链 cDNA
为模板, 设计的盐穗木 BADH基因全长引物进行
PCR反应扩增得到了与预计大小一致的长约1 500
bp的片段, 对该片段进行琼脂糖凝胶回收, 与
pMD18-T载体连接并转化筛选阳性克隆进行测序。
2 盐穗木BADH cDNA 序列分析和同源性分析
序列分析表明, 盐穗木BADH基因包括起始密
码子和终止密码子在内的核苷酸序列长度为1 503
bp, 编码含500个氨基酸的多肽, 理论分子量约54.49
kDa, 等电点为 5.09。推测的盐穗木BADH氨基酸
序列中包含一段甜菜碱醛脱氢酶中高度保守的十肽
序列(VTLEL GGKSP)以及与酶功能有关的半胱氨
酸残基(Cys), 这些残基可能包含NAD+结合位点和
酶催化位点(González-Segura等2002, 2005; Ishitani
等 1995)。5’端的不典型信号肽QLFIDGE表明该
酶可能定位于叶绿体中(Weret ilnyk和 Hanson
1990)。
盐穗木 BADH 基因在NCBI网站中进行Blast
比对结果显示, 盐穗木 BADH与盐地碱蓬(Suaeda
salsa, 登录号 DQ641924)的核苷酸序列同源性为
96.68%, 与中亚滨藜(Atriplex centralasiatica, 登录
号AY093682)、菠菜(Spinacia oleracea, 登录号
FJ595952)以及盐爪爪(Kalidium foliatum, 登录号
DQ923617)等的核苷酸序列同源性分别为87.36%、
87.09%和 81.57%, 与水稻(Oryza sativa, 登录号
AB001348)的同源性也达到66.8%, 表明克隆获得的
cDNA为BADH cDNA。此基因序列已在GenBank
上注册(登录号 EF471356)。从核苷酸序列的系统
进化树分析中可以看出, 盐穗木BADH基因同几种
藜科植物BADH的亲缘关系较近, 与水稻BADH的
亲缘关系较远。
3 盐穗木BADH推测的氨基酸序列系统分析
盐穗木BADH氨基酸序列和藜科植物盐地碱蓬
(Suaeda salsa)、辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis)、
三角叶滨藜(Atriplex triangularis)、中亚滨藜
(Atriplex centralasiatica)、鞑靼滨藜(Atriplex
tatarica)、盐爪爪(Kalidium foliatum)、菠菜
(Spinacia oleracea)和甜土植物水稻(Oryza sativa)的
氨基酸序列进行系统进化分析的结果表明, 盐穗木
BADH与碱蓬属的亲缘关系最近, 其次是滨藜属和
菠菜属, 而与水稻的亲缘关系较远(图 1)。
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图 1 盐穗木与其他物种间BADH氨基酸序列的系统进化关系
Fig.1 Phylogenetic relationship among BADH amino acid sequences of H. caspica and other species
图 2 不同浓度NaCl处理的盐穗木同化枝中 BADH基因的表达
Fig.2 Expression of BADH gene in H. caspica assimilating branches with different NaCl concentration treatments
4 不同浓度NaCl 胁迫下盐穗木BADH 基因转录水
平的表达分析
对经不同浓度(0、1 0 0、3 0 0、5 0 0、7 0 0
mmol·L-1) NaCl处理的盐穗木BADH基因进行半定
量 RT-PCR分析的结果显示(图 2), 未做NaCl胁迫
处理的盐穗木BADH的mRNA含量相对较低, 而经
NaCl处理的盐穗木BADH基因的mRNA含量则明
显呈现上调趋势, 尤其是用300 mmol·L-1 NaCl处理
的样品, 其表达量显著高于不做NaCl处理的。已
有的研究结果表明, 盐胁迫可诱导植物中BADH基
因的表达(Wood等 1996; Moghaieb等 2004; Dong
等 2006; 曾幼玲等 2007; 杨峥等 2007; 刘振林等
2009), 本文中盐穗木BADH基因的表达受盐诱导的
结果与这些结果相一致。王俊华等(2007)采用RP-
HPLC法测定长期盐胁迫下盐穗木中甜菜碱含量的
结果表明, 随着盐浓度的升高, 甜菜碱的含量呈现
先增加后减少的趋势, 在NaCl浓度为300 mmol·L-1
时达到最大, 本文中BADH基因表达的结果也与之
一致。
总之, 本文克隆获得了新疆真盐生植物盐穗木
BADH基因, 并在盐胁迫下做了表达分析, 丰富了
BADH的基因资源, 从而为进一步研究盐穗木耐盐机
制以及获得基因工程改良的耐盐植株奠定了基础。
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