全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 223~228 223
收稿 2010-12-03　　修定 2011-01-07
资助 山西省青年科技基金(2008021042)和山西大学青年科技基
金(2007108)。
* 通讯作者(E-mail: kdongmei@sxu.edu.cn; Tel: 0351-
7010599)。
火炬松组织培养研究和应用进展
万婷, 孔冬梅*
山西大学生命科学学院, 太原030006
摘要: 从离体再生途径、影响因素、遗传转化、存在问题等方面对火炬松组织培养研究和应用进展作了介绍和讨论, 以期
对同类树种相关研究的开展提供参考。
关键词: 火炬松; 器官发生; 体细胞胚胎发生; 遗传转化
Progress of Research and Application of Loblolly Pine (Pinus taeda L.) Tissue
Culture
WAN Ting, KONG Dong-Mei*
College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: Recent progress in research and application of loblolly pine (Pinus taeda L.) in vitro culture was in-
troduced and discussed. This review focused on regeneration programs, influencing factors, genetic transforma-
tion and existing problems. It was aimed to provide references to related studies on other similar tree species.
Key words: Pinus taeda L.; organogenesis; somatic embryogenesis; genetic transformation
针叶树的离体培养和植株再生是植物组织培
养研究中难度较大的一个领域。随着人们对无性
系林业的日益重视, 世界各国对针叶树的组织培
养给予了特别关注。经过近20年的发展, 针叶树
已从组织、器官培养深入到细胞、原生质体培养,
逐步实现从理论研究到应用实践的跨越, 尤其在
离体培养与植株再生各环节技术指标上取得了重
大突破。然而纵观全球针叶树组织培养, 仅有少
数几个树种的体胚发生技术在生产上得到应用,
大部分组织培养技术仍停留在实验室研究阶段,
尤其是在松属树种中仍存在不少困难。火炬松
(Pinus taeda L.)是针叶树中少数几个组织培养技
术相对成熟的树种之一, 系统了解其培养技术研
究及应用进展, 对同类树种相关研究的开展具有
借鉴意义。
火炬松原产美国东南部, 是世界南方松中分
布最广、生长面积最大、木材年产量最高、蓄积
量最多的绿化和造林用速生针叶树种, 上世纪30
年代引入我国, 目前已成为我国南方省区大面积
造林的重要经济树种。火炬松的组织培养研究始
于上世纪70年代。1987年Gupta和Durzan首次从改
良的MS培养基上, 以未成熟合子胚为外植体, 获得
火炬松体细胞胚和再生植株。之后, 对火炬松不
定芽诱导、体细胞胚发生和植株再生技术的研究
不断深入, 并取得了很大进展。
1 火炬松组织培养植株再生途径
通过组织培养获得火炬松再生植株有器官发
生和体细胞胚胎发生2种途径。器官发生包括直
接发生和间接发生2种方式, 直接器官发生耗时短,
操作简便。间接器官发生需先诱导愈伤组织, 再
经器官分化形成再生植株, 愈伤组织培养不受季
节限制, 污染率低, 诱导率高。体胚发生途径则多
通过间接方式发生, 即先诱导生成胚性愈伤组织
(胚性胚柄团), 再从胚性愈伤组织诱导体细胞胚并
使其成熟和萌发, 进而得到完整植株。通过体胚
发生获得再生植株的优点是, 在一个培养物上所
能发生的胚状体数量往往比不定芽数多, 且发生
速度快, 结构完整, 无需诱导生根环节, 成苗率
高。对于火炬松, 这2种发生途径都有其重要意
义。
1.1 火炬松器官发生植株再生研究进展
火炬松的组织培养研究始于上世纪70年代。
植物生理学报224
之后相继有研究以成熟合子胚为外植体直接诱导
形成不定芽, 并经根的诱导获得了再生植株(阙国
宁等1997; 唐巍等1997; Tang和Guo 2001)。唐巍和
欧阳藩(1998)还通过成熟合子胚培养获得了器官
性愈伤组织, 从愈伤组织诱导不定芽, 并诱导芽苗
生根获得了再生植株, 不定芽的诱导率达58.2%,
生根率达46%。
1.2 火炬松体胚发生植株再生研究进展
1987年Gupta和Durzan以火炬松未成熟合子
胚为外植体 , 首次经体胚发生途径获得再生植
株。此后, 有关研究大量开展, 火炬松体胚发生再
生植株成功的研究越来越多, 生理生化及分子生
物学方面的研究也得以深入(Becwar等1990; 唐巍
等1998)。其中唐巍等(1998)以24个火炬松基因型
成熟种胚为外植体, 获得完整植株, 成活率最高达
25%。在此基础上, 生物反应器、低温冷藏技术及
人工种子生产等应用研究也得以迅速发展。这些
技术的发展也大大促进了火炬松体胚发生植株再
生技术的应用。据报道, 美国Weyerhaease公司和
Westvaco公司已将火炬松体胚发生技术应用于苗
木商业化生产。
2 影响火炬松离体培养植株再生的主要因素
火炬松组织培养过程受多种因素的影响, 了
解这些影响因素的作用规律将有利于火炬松的快
速繁殖和工业化生产。
2.1 外植体的生理状况
到目前为止, 火炬松成功的离体培养所使用
的外植体均为合子胚。器官发生植株再生以成熟
的合子胚为外植体, 不定芽或器官性愈伤组织通
常发生于子叶或下胚轴(Tang和Guo 2001; 阙国宁
等1997)。体胚发生多以幼嫩合子胚为外植体, 发
育早期太小的合子胚不容易剥离, 此时可用包含
合子胚的雌配子体接种(Gupta和Durzan 1987)。合
子胚的发育阶段是影响体胚发生的一个主要因素,
通常适合体胚诱导的发育阶段只是一个很短的时
间。Becwar等(1990)研究发现, 7月6日到8月3日取
材的合子胚上获得体胚的最高诱导率, 同时发现
体胚诱导与合子胚的形态学密切相关, 合子胚长
度小于0.5 mm时(在子叶原基发育之前)最适合诱
导体胚。唐巍等于1998年打破了幼嫩合子胚发育
状态和取材季节的束缚, 首次以成熟合子胚为外
植体建立了体胚发生和植株再生技术体系, 尽管
再生频率只有6.1%~18.4%。
2.2 基因型
不同基因型的外植体需要的最适培养条件不
同, 而在相同诱导条件下, 其不定芽诱导和体胚发
生情况有明显差异。
对3种基因型(Hb、Ma和Mc)火炬松不定芽诱
导的研究发现 , 不同基因型不定芽的分化、伸
长、生根情况有显著差异。其中, 基因型Hb的不
定芽分化率最高, 达58.2%; 不定芽的伸长生长速
率以Ma最快, 达0.05 cm·d-1; Ma的生根频率最高,
达46%。扫描电镜观察还发现, 3种基因型不定芽
原基的发生部位不同, Ma和Mc的不定芽原基主要
发生在子叶上, Hb则在子叶和上胚轴部位都可形
成大量不定芽原基(唐巍等1997)。间接器官发生
的研究表明, 基因型Ma的愈伤组织诱导率、不定
芽分化率、伸长生长速率和生根率都高于另外2
种基因型(唐巍和欧阳藩1998)。
对火炬松8个自由授粉家系体胚发生的研究
发现, 家系E-440单位体积培养物获得的胚性培养
物数量最多。对3个家系进行的研究也表明在相
同培养条件下 , 不同家系胚性愈伤组织的诱导
率、体细胞胚的得率均有所不同(Tang等2001a)。
MacKay等(2006)对火炬松不同家系体胚诱导的研
究也得出上述相似的结论。同时还发现, 在体胚
发生起始时存在很强的遗传累积效应和母体效应,
因此在取材时选择优良的亲本特别是母本至关重
要。
2.3 培养基的营养成分
培养基是植物组培最重要的基质, 不同培养
基由于其营养成分及含量不同, 培养效果也有所
不同。
Tang等 (1998)在使用不同倍性TE培养基
(0.5、0.75、1.0、1.25和1.5倍TE培养基)诱导火炬
松成熟合子胚不定芽的分化时发现, 1.25倍的TE
培养基上不定芽分化率最高(73.5%), 每个胚上芽
数最多(3.9个), 在间接不定芽诱导研究中, 也得出
相似的结论(唐巍和欧阳藩1998)。阙国宁等(1997)
研究发现, 总含盐量、总含氮量以及NH4
+与NO3
-
的比值对不定芽诱导效果至关重要, 当培养基中
盐分含量为0.45%, 含氮量达到840.86 mg·L-1,
万婷等: 火炬松组织培养研究和应用进展 225
NH4
+:NO3
-=1:2时, 所有种胚均不能诱导愈伤组织
和不定芽 , 并逐渐死亡。适当降低盐分含量到
0.21%, 总含氮量为186 mg·L-1, NH4
+:NO3
-=1:3时,
分化情况明显改善。这表明高盐、高氮以及较高
NH4
+ (例如目前常用的MS培养基)不合适火炬松不
定芽诱导。低盐培养基, 尤其是降低甚至完全去
除NH4
+可促进不定芽发生的结论在其他多种松类
树种中也有报道。
Becwar等(1990)在对火炬松胚性愈伤组织的
诱导研究中发现, 在其他条件相同时, 降低盐浓度
的改良MS培养基(MSG)上诱导率最高, 其次是
DCR培养基。Li等(1998a)也发现, DCR1、LP和
BM1三种培养基中, BM1培养基比DCR1诱导率高,
但LP对诱导无效。Tang等在2001(a)年深入研究了
不同营养成分的培养基对火炬松体胚发生的影响,
研究中使用了DCR、B5、LP、MSG、改良MS、
SH、TE和LOB等8种基本培养基, 结果发现, 在其
他条件相同情况下, 胚性愈伤组织诱导的最高频
率发生在改良MS培养基和LOB培养基上。
大量研究表明, 火炬松器官发生和体胚发生
受培养基中无机盐浓度的影响较大。器官发生要
求培养基中存在较高浓度的Mg2+、Mn2+、Zn2+、
K+, 较低浓度的NH4
+, 且总盐浓度不宜过高, 中盐
一般有利于不定芽的形成; 体胚发生则需要适当
降低NO3
−和NH4
+的浓度, 通常低盐浓度有利于体
胚发生, 而高盐对于胚培养有不同程度的毒害作
用。在促进火炬松体胚成熟、萌发的研究中, Pull-
man等(2003)也得出相似的结论, 即低盐的培养效
果要好于高盐培养基。
2.4 植物生长调节剂
植物生长调节剂在离体培养形态发生过程中
起着不可替代的作用。在火炬松不定芽的形成中
使用较多的是6-苄氨基腺嘌呤(6-benzylaminopu-
rine, BA); 培养基中添加适宜浓度组合的2,4-二氯
苯酚代乙酚(2,4-D)、BA和激动素(kinetin, KT)时,
体胚诱导情况较好, 而在体胚成熟阶段则必须有
脱落酸(abscisic acid, ABA)的存在。Silveira等
(2004)在研究与细胞生长有关的生物化学和生理
参数时进一步从理论上证实了这一点。
2.4.1 植物生长调节剂对器官发生的影响 火炬松
不定芽的诱导要求适当浓度的生长素与细胞分裂
素配合使用, 最常用的生长素是萘乙酸(1-naphthl-
cetic acid, NAA)和3-吲哚丁酸(3-indolebutyric acid,
IBA), 使用浓度一般不超过1 mg·L-1, 细胞分裂素则
以BA最为有效, 适宜浓度为2~5 mg·L-1 (唐巍等
1997; 阙国宁等1997)。NAA或IBA和BA组合条件
下的直接不定芽分化频率明显高于不含BA的处
理, 表明BA在直接不定芽的分化过程中起重要作
用, 但培养基中BA浓度不宜过高。Tang等(1998)
研究发现, 提高BA浓度虽然可以诱导较高的不定
芽发生率, 但这些芽小, 发育慢, 当BA浓度达到
8~16 mg·L-1时, 不定芽诱导率急剧降低, 发育明显
缓慢。器官性愈伤组织的诱导以10 mg·L-1 NAA和
4 mg·L-1 BA组合效果较好, 将二者浓度降低为原
来的1/4则有利于愈伤组织的增殖, 之后使用0.5
mg·L-1 IBA与2 mg·L-1 BA组合能有效诱导不定芽
的分化(唐巍和欧阳藩1998)。形成的不定芽通常
需要转移到降低生长素浓度、去除细胞分裂素的
培养基上进行伸长培养, 适当浓度的GA3有利于芽
的伸长(唐巍等1997)。高度达到2 cm的健壮芽苗
应及时转至低含量以至不含生长素的培养基中进
行生根诱导, 适宜条件下经10~15 d培养就可长出
3~5条白色的根, 生根率可达80%~85% (阙国宁等
1997)。
2.4.2 植物生长调节剂在体胚发生过程中的作用 火
炬松体胚发生也要求适当浓度的生长素和细胞分
裂素配合使用, 2,4-D是诱导体胚发生最常用也最
有效的生长素, 其次是IBA和NAA, 细胞分裂素多
使用BA或KT (Li等1998a; Tang等2001a)。Tang等
(2001a)对火炬松体胚发生不同阶段适合的生长调
节剂做了具体研究, 发现在胚性愈伤组织诱导阶
段, 8 mg·L-1 2,4-D、4 mg·L-1 BA与4 mg·L-1 KT组合
处理可获得最高诱导率16.9%, 当把2,4-D换成
NAA或IBA (均为8 mg·L-1)时, 诱导率明显降低, 表
明2,4-D是火炬松胚性愈伤组织诱导最有效的生长
素。继代培养基中生长素和细胞分裂素的浓度都
降低为诱导阶段的1/5, 胚性愈伤组织的增殖效果
较好。
适当浓度的ABA对火炬松体细胞胚的成熟是
必须的。研究发现, 低浓度的ABA (10 mg·L-1)导致
胚性组织过量增殖, 形成的第2阶段的胚较少, 没
有第3阶段的胚形成; 20 mg·L-1是子叶胚形成所需
植物生理学报226
要的最低ABA浓度; ABA为40 mg·L-1时产生的第2
阶段和第3阶段的胚数量最多; 当ABA浓度为4
mg·L-1时, 形成前期子叶胚和子叶胚的频率最高; 5
mg·L-1的ABA可促进体胚萌发成植株(Li等1997;
Pullman等2003; De Silva等2008)。由此可见, 火炬
松体胚成熟早期需要较低浓度的ABA, 中期ABA
浓度升高可促进后期萌发, 萌发时需要降低ABA
浓度。
2.5 渗透压
糖类是培养基上最常用的渗透调节剂, 不同
糖类在离体培养中会起到不同的效果。Tang等
(2008)发现, 分化培养基中添加2%葡萄糖时火炬
松不定芽诱导率最高(83.7%), 每个胚上不定芽数
最多(5.8个), 诱导效果明显好于甘露糖、果糖和山
梨糖。与糖类相比, 聚乙二醇(polyethylene glycol,
PEG)是一种不发生胞质分离的渗透剂。改变肌醇
浓度也可起到调节渗透压的作用。通常需将火炬
松胚性组织转移到添加PEG或提高肌醇浓度的培
养基上, 以促进体胚的成熟(Tang等1998)。有数据
显示, 如果成熟培养基中不含PEG, 多数体胚停留
在早期阶段不能进一步成熟, 促进体胚成熟的最
适PEG浓度是5%~7.5% (Li等1997, 1998b); 而13%
PEG 8000能够明显促进火炬松体胚萌发(Pullman
等2003)。体胚在成熟后期到萌发之前, 对渗透压
也有严格要求。体胚需通过机械方法或延长培养
时间的方法来进行部分干化。若不经干化处理,
体胚很难形成功能性的芽分生组织, 植株的成活
率低(Tang等2001a)。
2.6 培养基的物理状态
火炬松植株再生不定芽发生途径中一般以固
体培养基为宜, 固化剂多使用0.7%琼脂, 而2 g·L-1
Gelrite则是胚性培养物诱导的较适水平, 降低其浓
度可导致诱导率降低, 褐化率增高, 而提高其浓度
则可导致胚性培养物质量下降(Li等1998b)。
在火炬松体胚发生过程中, 用愈伤组织建立
起的细胞悬浮培养系, 细胞可保持活性达4个多月,
细胞密度与体胚增殖速率有直接关系, 最适宜的
密度是1 mL细胞压积(packed cell volume)(Tang
2001)。有研究认为, 在固体培养基上覆盖一层液
体培养基时, 火炬松胚性愈伤组织的诱导率显著
增加, 当将固体培养基中NAA的浓度从2 mg·L-1降
低至0.3 mg·L-1且覆盖液中含0.3 mg·L-1 NAA和9
mg·L-1 ABA时诱导率最高(Pullman和Skryabina
2007)。
2.7 附加物
很多附加成分以适当方式加入培养基后可以
在一定程度上改善火炬松体胚培养效果, 而有的
附加成分则是培养所必须的。例如, 在火炬松体
胚发生中, 高浓度的肌醇、L-谷氨酰胺、水解酪蛋
白和5.0 mg·L-1 AgNO3使胚性愈伤组织的诱导率和
增殖率显著提高 ; 在培养基中添加一种由250
mg·L-1 2-(N-吗啉代)乙磺酸、0.5 mg·L-1叶酸和0.05
mg·L-1维生素H组成的缓冲液, 则可以通过维持培
养基的pH值, 来改善体细胞胚的诱导和生长状况
(Pullman等2005a); 0.1 mg·L-1 paclobutrazol (一种赤
霉素抑制剂)可显著提高胚性愈伤组织的诱导率
(Pul lman等2005b)。最新研究发现 , 0 .5~1 .0
mmol·L-1柠檬酸可显著促进早期体胚的生长和增
殖, 且当柠檬酸位于胚性组织表面时, 刺激作用更
明显(De Silva等2008)。
2.8 环境条件
光照和温度是影响火炬松离体培养的主要环
境因素。
在直接不定芽诱导中, 暗培养有利于不定芽
原基的诱导, 不定芽的分化、伸长和生根等则需
要光照, 培养温度以(23±1) ℃为宜(唐巍等1997)。
在间接不定芽发生途径中, 愈伤组织的诱导可在
黑暗条件下进行, 不定芽的分化则在14 h·d-1的光
照条件下发生, 温度以(25±1) ℃为宜(唐巍和欧阳
藩1998)。体胚发生中, 胚性愈伤组织的诱导和增
殖在黑暗条件下进行, 温度23~25 ℃, 之后的发育
则在16 h·d-1的光照条件下进行, 温度23~28 ℃, 光
照强度40 μmol·m-2·s-1 (Tang和Guo 2001)。
3 再生植株的锻炼和移栽
与其他针叶树相似, 高度适宜、健康强壮的
火炬松试管苗即可用于移栽。移栽前应先在自然
光下瓶内炼苗数天, 移栽时小心清洗根部附着的
培养基, 移栽后要注意温度、光照等环境条件的
逐渐过渡, 特别是湿度条件。在移栽初期, 通常覆
盖塑料薄膜以保持较高湿度, 之后逐渐撤除薄膜
直至苗木完全暴露于自然条件下。移栽基质多选
用珍珠岩:泥炭藓:蛭石=1:1:1 (V/V/V)的混合基
万婷等: 火炬松组织培养研究和应用进展 227
质。试管苗的成活率与其移栽前的生长状况和炼
苗情况密切相关, 研究表明, 高于3 cm的健康植株,
驯化时间为16 d时, 再生植株的成活率最高(Tang
等2001a)。
4 利用组培体系进行基因转导
遗传转化是植物组织培养应用的一个主要方
面, 但就针叶树而言, 成功获得转化目的基因植株
的例子并不多, 火炬松也是如此。火炬松遗传转
化上使用过的方法有两种, 即农杆菌介导和粒子
轰击。目前, 由于限制条件较多且操作复杂, 粒子
轰击的方法使用较少。
Sederoff等1986年首次成功进行了火炬松基
因转化, 他们通过农杆菌介导法将细菌基因转入
了火炬松。之后陆续有火炬松遗传转化的尝试,
但多数研究只获得转报告基因的瞬时表达。Tang
等(2001b)通过土壤农杆菌与外植体共培养的方法
首次从火炬松获得稳定转化的植株, 火炬松遗传
转化的研究才有了突破性进展。使用根癌农杆菌
株LBA 4404 [含有质粒pBIGM (带有Mt1D和
GutD)]感染火炬松的成熟合子胚, 在含有15 mg·L-1
卡那霉素的选择培养基上产生器官性的转基因愈
伤组织和转基因再生植株, 耐盐性检测证实, 转基
因愈伤组织和再生植株的耐盐性增加了 (Tang
2002)。
火炬松转化基因的表达率受多种因素影响。
Tang等(2001b)选择土壤农杆菌株GV3101 (含质粒
pPCV6NFHyg-GUSINT)来转化火炬松的7个家系,
发现家系11 - 1 0 2 9获得最高频率的G U S表达
(100%), 每个胚上蓝斑数达300个。在共培养成熟
胚的子叶、下胚轴、胚根和共培养成熟合子胚的
愈伤组织和芽中发现了GUS报告基因的表达。通
过PCR分析、Southern杂交, 结合DNA/T-DNA分析
证实, 外源基因成功整合到了火炬松中。除外植
体的基因型外, 转化率还受共培养时间、处理方
法、农杆菌菌株的影响 , 使用改良的农杆菌株
EHA105与火炬松成熟合子胚共培养的研究发现,
共培养21 d, 使用pCAMBIA1301和pTOK47并用超
声波处理的转基因植株中GUS表达率最高(Tang
2003; Tang等2004)。
Tang和Vanessa在2002年通过粒子轰击法对火
炬松成熟合子胚进行转化的研究也取得了成功,
转基因愈伤组织和转基因植株的发生率因基因型
不同而异; 在3种不同大小(0.6、1.0和1.1 mm)的金
粒子中, 使用最小的金粒子, 基因转化的效率最高;
而不同水平的氦气压并不影响转化率。
5 展望
火炬松组织培养已获得了较稳定的不定芽和
体胚发生体系, 在此基础上进行的细胞悬浮培养
及遗传转化等研究, 为通过基因工程进行火炬松
的遗传改良打下了基础, 但仍存在一些问题阻碍
相关技术的实际应用, 如: 不定芽虽能大量增殖但
生根率低, 培养周期长; 外植体的选用仅局限于合
子胚, 无法保持母本优良性状; 体细胞胚的诱导频
率低, 在培养过程中一些细胞系会失去体胚发生
能力; 体细胞胚发生不同步, 体胚苗生根困难等。
如何克服这些问题将是下一步火炬松组培研究的
重要内容。
人工种子生产是体胚发生技术应用的一个重
要方面。Gupta和Durzan (1987)已可以使在液氮中
短期保存的体细胞胚恢复活力, 并将其用海藻酸
钠包裹制成了人工种子, 但这方面仍有很大的研
究空间, 如研究长期保存技术, 简化操作过程, 降
低成本等。
结合分子生物学技术, 探讨火炬松组织培养
形态发生的生理生化机制, 进一步进行基因转化
的研究, 分离形态发生相关基因等, 将会促进火炬
松组培技术发展及其在商业生产上的应用, 同时
对促进其他针叶树离体培养研究, 推进整个无性
系林业的发展具有积极意义。
参考文献
阙国宁, 房建军, 葛万川, 张守英, 毛秋娟(1997). 火炬松、湿地松、
晚松组培繁殖的研究. 林业科学研究, 10 (3): 227~232
唐巍, 欧阳藩, 郭仲琛(1997). 火炬松成熟合子胚培养直接器官发生
和植株再生. 云南植物研究, 19 (3): 285~288
唐巍, 欧阳藩(1998). 火炬松 (Pinus taeda L.)合子胚愈伤组织的器
官发生和植株再生. 实验生物学报, 31 (1): 87~93
唐巍, 欧阳藩, 郭仲琛(1998). 火炬松成熟合子胚直接体细胞胚胎发
生和植株再生. 应用与环境生物学报, 4 (2): 103~106
Becwar MR, Nagmani R, Wann SR (1990). Initiation of embryogenic
cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus
taeda L.). Can J For Res, 20: 810~817
De Silva V, Bostwick D, Burns KL, Dioham CD, Skryabina AM, Sul-
lards C, Wu D, Zhang YL, May SW, Pullman GS (2008). Isola-
tion and characterization of a molecule stimulatory to growth of
somatic embryos from early stage female gametophyte tissue of
植物生理学报228
loblolly pine. Plant Cell Rep, 27: 633~646
Gupta PK, Durzan DJ (1987). Biotechnology of somatic poly-
embryogenesis and plantlet regeneration in loblolly pine. Biol/
Technology, 5: 147~151
Li XY, Huang FH, Edward E, Gbur JR (1997). Polyethylene glycol
promoted development of somatic embryos in loblolly pine (Pi-
nus taeda L.). In Vitro Cell Dev Biol Plant, 33: 184~189
Li XY, Huang FH, Gbur JrEE (1998a). Effect of basal medium,
growth regulators and Phytagel concentration on initiation of
embryogenic cultures from immature zygotic embryos of lob-
lolly pine (Pinus taeda L.). Plant Cell Rep, 17: 298~301
Li XY, Huang FH, Murphy B, Edward E, Gbur JR (1998b). Polyethyl-
ene glycol and maltose enhance somatic embryo maturation in lob-
lolly pine (Pinus taeda L.). In Vitro Cell Dev Biol Plant, 34: 22~26
MacKay JJ, Becwar MR, Park YS, Corderro JP, Pullman GS (2006).
Genetic control of somatic embryogenesis initiation in loblolly
pine and implications for breeding. Tree Genet Genomes, 2: 1~9
Pullman GS, Johnson S, Peter G, Cairney J, Xu N (2003). Improving
loblolly pine somatic embryo maturation: comparison of somatic
and zygotic embryo morphology, germination and gene expres-
sion. Plant Cell Rep, 21: 747~758
Pullman GS, Johnson S, Tassel V, Zhang Y (2005a). Somatic embryo-
genesis in loblolly pine (Pinus taeda) and Douglas fir (Pseudot-
suga menziesii): improving culture initiation and growth with
MES pH buffer, biotin, and folic acid. Plant Cell Tiss Org Cult,
80: 91~103
Pullman GS, Mein J, Johnson S, Zhang Y (2005b). Gibberellin inhibi-
tors improve embryogenic tissue initiation in conifers. Plant Cell
Rep, 23: 596~605
Pullman GS, Skryabina A (2007). Liquid medium and liquid overlays
improve embryogenic tissue initiation in conifers. Plant Cell
Rep, 26: 873~887
Sederoff R, Stomp AM, Chilton WS, Moore LW (1986). Gene transfer
into loblolly pine by Agrobacterium tumefaciens. Biol/Technol-
ogy, 4: 647~649
Silveira V, Floh EIS, Handro W, Guerra MP (2004). Effect of plant
growth regulators on the cellular growth and levels of intracel-
lular protein, starch and polyamines in embryogenic suspension
cultures of Pinus taeda. Plant Cell Tiss Org Cult, 76: 53~60
Tang W (2001). Enhanced somatic embryogenesis and plant regenera-
tion from embryogenic cultures derived from mature loblolly
pine zygotic embryos by suspension culture and medium selec-
tion. J For Res, 3 (2): 1~9
Tang W (2002). Regeneration of transgenic loblolly pine expressing
genes for salt tolerance. J For Res, 13 (1): 1~6
Tang W (2003). Additional virulence genes and sonication enhance
Agrobacterium tumefaciens mediated loblolly pine transforma-
tion. Plant Cell Rep, 21: 555~562
Tang W, Guo ZC (2001). In vitro propagation of loblolly pine via
direct somatic organogenesis from mature cotyledons and hypo-
cotyls. Plant Growth Regul, 33: 25~31
Tang W, Guo ZC, Ouyang F (2001a). Plant regeneration from em-
bryogenesis cultures initiated from mature loblolly pine zygotic
embryos. In Vitro Cell Dev Biol Plant, 37: 558~563
Tang W, Sederoff R, Whetten R (2001b). Regeneration of transgenic
loblolly pine (Pinus teada L.) from zygotic embryos transformed
with Agrobacterium tumefaciens. Planta, 213: 981~989
Tang W, Luo HS, Ronald J, Newton (2004). Effects of antibiotics on
the elimination of Agrobacterium tumefaciens from loblolly pine
(Pinus taeda) zygotic embryo explants and on transgenic plant
regeneration. Plant Cell Tiss Org Cult, 70: 71~81
Tang W, Ou YF, Guo ZC (1998). Factors affecting adventitious bud
differentiation of loblolly pine from mature zygotic embryos cul-
tured in vitro. Dev Reproduc Biol, 7 (1): 49~54
Tang W, Vanessa S (2002). Genetic transformation of Pinus taeda by
particle bombardment. J For Res, 13 (2): 91~97