全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (1): 79~87　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0359 79
收稿 2014-10-30　　修定 2015-01-06
资助 上海市农科院青年科技发展基金(农科青年科技2012-
06)、浦东新区科技发展基金创新资金(PKQ2012-03)、公
益性行业(农业)科研专项(201403032)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: wmzhu69@hotmail.com; Tel: 021-62208660)。
异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草的抗低温胁迫能力
于力1,2,*, 阎君1,*, 张一鸣3,*, 刘士辉4, 张辉1, 刘娜1, 田守波1, 姚永康4, 朱为民1,**
1上海市农业科学院园艺研究所, 上海201106; 2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所, 上海200032; 3上海市
农业科学院, 上海201106; 4上海孙桥现代农业联合发展有限公司, 上海201210
摘要: 促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号系统在植物应对环境胁迫中发挥重要作用。为了探讨LeMPK3基因在低温胁迫
中的功能, 我们从番茄中分离了LeMPK3基因并将其转化到烟草中, 获得了异源表达LeMPK3基因的转基因烟草。RT-PCR
分析结果表明, 番茄幼苗在低温和高温胁迫及外源物质——过氧化氢(H2O2)、茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)处理下
LeMPK3基因的表达量提高。在烟草中异源表达LeMPK3基因可以提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧
化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性, 增加脯氨酸和可溶性糖的含量, 增强逆境相关基因的表达。说明异源表达
番茄LeMPK3基因提高烟草对低温的抗性。
关键词: 番茄; 低温胁迫; 转基因; LeMPK3
Ectopic Expression of Tomato LeMPK3 Improved Chilling Tolerance of Tobacco
(Nicotiana tabacum)
YU Li1,2,*, YAN Jun1,*, ZHANG Yi-Ming3,*, LIU Shi-Hui4, ZHANG Hui1, LIU Na1, TIAN Shou-Bo1, YAO Yong-Kang4, ZHU Wei-
Min1,**
1Horticulture Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2Institute of Plant Physiol-
ogy and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 3Shanghai
Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 4Shanghai Sunqiao Modern Agriculture United Development Limited
Liability Company, Shanghai 201210, China
Abstract: Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are important intracellular signaling events that
mediate signal transduction associated with the plant response to environmental stress. In order to investigate
the function of LeMPK3 under chilling stress, LeMPK3 was isolated from tomato (Lycopersicon esculentum)
and transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants were obtained. The transcription of LeMPK3 in tomato
leaves was up-regulated by low and high temperatures, and by the exogenous signaling molecules methyl jas-
monate (MeJA), salicylic acid (SA) and hydrogen peroxide (H2O2). Transgenic tobacco overexpressing
LeMPK3 accumulated less reactive oxygen species (ROS), more superoxide dismutase (SOD), peroxidase
(POD), catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) activities, more proline and soluble sugar contents, and
more stress-responsive genes expression, leading to enhancing low temperature stress tolerance compared to the
control plants.
Key words: tomato; low temperature stress; transgenic; LeMPK3
低温胁迫是限制植物生长季节和生长地域的
重要环境因子, 过度低温会对植物造成不同程度
的伤害, 甚至死亡(晋文娟等2013)。番茄起源于热
带、亚热带地区, 为喜温类作物, 对低温敏感。番
茄适宜的生长温度为15~33 ℃, 开花坐果最适温度
为25 ℃左右, 低于适宜温度时植株开花坐果受阻,
产量下降。冬春季低温胁迫限制了我国大部分地
区的番茄生产, 制约了番茄生产与周年供应。因
此, 有必要对番茄响应低温胁迫信号转导并调控
耐冷性分子机理进行研究。
植物有各种复杂的信号转导机制来适应外界
环境的变化。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-
activated protein kinase, MAPK)的级联系统被认为是
植物细胞将胞外刺激信号转换成胞内反应的主要
植物生理学报80
途径之一。MAPK信号的级联系统主要由3种功能
上相互联系的蛋白激酶MAPKKK、MAPKK和
MAPK组成。在这种蛋白磷酸化的模式中, 一种
MAPKKK能够磷酸化和活化某一特定的MAPKK,
MAPKK再磷酸化和活化某一MAPK。MAPK的激
活有利于它转运到细胞核内, 磷酸化与活化下游
的信号组分如转录因子, 从而调节基因表达(Zhang
和Klessig 2001; Nakagami等2005)。番茄中含有16
个MAPK基因, 在番茄响应生物胁迫和非生物胁迫
中发挥着重要作用(Kong等2012)。当受伤害、信
号多肽systemin、多糖、UV-B辐射、真菌的壳梭
孢菌素刺激时, LeMAPK1和LeMAPK2编码的蛋白
激酶磷酸化活性被激活(Higgins等2007)。番茄
MAPK基因沉默试验显示 , 番茄LeMAPK1、
LeMAPK2、LeMAPK3以及LeMKK2蛋白在Mi-1
介导的抗蚜虫反应中具有激酶活性(Li等2006)。
LeMAPK3蛋白在植株受到伤害时激酶活性升高,
同时转录水平上调, 但是在蛋白质水平含量没有
上升, 转录水平升高的时间滞后于活性的升高, 而
LeMAPK1和LeMAPK2蛋白在受到伤胁迫时活性
上升的同时 , 转录水平和蛋白水平都没有变化
(Holley等2003)。于力等(2012)研究发现热胁迫、
盐胁迫以及UV-B辐射能诱导LeMPK1基因的转录
水平上调, 将LeMPK1基因在番茄中超表达可以提
高番茄的耐热性。孔福苓等(2012)对番茄进行高
温处理, 发现LeMAPK12在雄蕊中的相对表达量增
高, 于12 h时达到顶点, 而后下降, 推测LeMAPK12
可能参与番茄花粉发育过程中的高温胁迫反应。
目前, 有关番茄MAPK基因的研究主要集中在生物
胁迫和高温胁迫, 尚未有低温胁迫下番茄MAPK基
因功能的报道。因此, 本文研究低温胁迫下番茄
LeMPK3基因的表达特性及功能, 具有重要的理论
与现实意义。
材料与方法
1 植物材料与处理
供试番茄(Lycopersicon esculentum L.)品种
‘1479’为纯合自交系, 由上海农科院园艺所提供。
试验在中科院上海植物生理生态研究所玻璃温室
中进行, 种子发芽后2片子叶时移入Hoagland (pH
6.0)营养液中, 温度为22/26 ℃ (夜/白), 水培4周后
用于以下试验。
将水培4周的番茄分别移栽到含有以下物质
的Hoagland营养液(温度25 ℃)中: (1) 10 mmol·L-1过
氧化氢(hydrogen peroxide H2O2); (2) 100 mmol·L
-1
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA); (3) 100
μmol·L-1水杨酸(salicylic acid, SA)。温度胁迫试验
中分别将植株放在低温(4 ℃)和高温(42 ℃)的光照
培养箱内。处理后的0、3、6、12和24 h取样, 液
氮冷冻后贮藏于–80 ℃冰箱, 用于基因表达分析。
转基因烟草(Nicotiana tabacum L. cv ‘NC89’)
种植于营养钵中, 温度控制在20/25 ℃ (夜/白), 待收
获转基因纯合烟草种子后, 将生长至5~6片真叶期
的转基因和野生型烟草进行4 ℃低温的胁迫处理,
24 h后取第2和第3片叶子, 液氮冷冻后贮藏于–80 ℃
冰箱, 用于生理指标测定和基因表达分析。
2 RNA提取及半定量RT-PCR
参考孔凡英等(2014)的方法, 提取RNA并反转
录为cDNA, 通过半定量RT-PCR分析LeMPK3基因
的表达特性。Leactin正向引物为: 5-TGCATCTT-
GCTGGTCGTG-3, 反向引物: 5-GGATTGCTG-
GAAGAGGACC-3; LeMPK3正向引物: 5-TATGG-
GTGCTGCTCAATTTC, 反向引物: 5-TTCAGG-
ATTCAACGCCAAAG-3。
3 LeMPK3基因的克隆、载体构建和遗传转化
根据NCBI已公布的LeMPK3基因(GenBank
登录号为NM 001247431)序列, 设计正向引物G1
(5-ATGGTTGATGCTAATATGGG-3)和反向引物
G2 (5-TTAAGCATATTCAGGATTCA-3), 扩增番
茄LeMPK3基因全长, 切胶回收PCR目的片段, 构
建成PBI121-LeMPK3载体, 并转化到大肠杆菌
DH5α感受态细胞中, 经酶切和测序验证后, 用冷冻
法转化导入农杆菌LBA4404感受态中。以‘NC89’
烟草叶片作为转化材料, 参考秦利军等(2014)的方
法, 用农杆菌介导的叶盘法进行转化。浸染后的愈
伤组织经卡那霉素筛选, 挑选新生抗性愈伤组织进
行分化、生根、炼苗, 最后移栽到花盆中培养。通
过基因组PCR筛选转基因烟草 , 正向引物35S:
5-TACGCAGCAGGTCTCTCAAG-3, 反向引物
LeMPK3: 5-TTAAGCATATTCAGGATTCA-3。并
通过半定量RT-PCR (见第2小节)筛选LeMPK3表达
量较高的3个株系, 收取T2代纯合体用于后续试验。
于力等: 异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草的抗低温胁迫能力 81
4 种子萌发和幼苗生长
将野生型和转基因T2代烟草种子(每株系约22
粒)播种于MS培养基上, 分别置于25和12 ℃光照培
养箱中, 40 d后统计每个株系的萌发率, 每处理3次
重复。
将在25 ℃萌发6 d的野生型和转基因烟草移
至25和12 ℃光照培养箱中, 40 d后统计每个株系的
根长, 每处理3次重复。
5 生理指标测定
将生长至5~6片真叶期的转基因和野生型烟
草进行4 ℃低温胁迫处理, 取样后测定H2O2、O2¯·、
脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶(super-
oxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase,
POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、抗坏血酸过氧
化物酶(ascorbate peroxidase, APX)的酶活性。参考
Jiang和Zhang (2001)的方法测定H2O2和O2¯·含量, 参
考Irigoyen等(1992)的方法测定脯氨酸和可溶性糖
含量, 参考Zong等(2009)的方法测定SOD、POD、
CAT、APX活性。
6 荧光定量PCR检测基因表达
采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM定
量分析抗逆相关基因的表达, 参考Cools和Ishii
(2002)的方法, 实时荧光定量PCR使用的引物见表
1。扩增体系为: SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL、
引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O
9.5 μL。扩增程序如下: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃
30 s, 40个循环; 以每30 s升高0.5 ℃的速率从55 ℃
缓慢递增到95 ℃, 进行溶解曲线分析。采用双标
准曲线法进行定量, 每个反应进行3个重复。
7 数据分析
以上所有试验数据均采用Excel 2007和SPSS
13.0软件进行统计分析。
表1 实时荧光定量PCR使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in real-time PCR
扩增基因 正向(5→3) 反向(5→3)
NtSOD AGCTACATGACGCCATTTCC CCCTGTAAAGCAGCACCTTC
NtPOD AAATGGTGGCGCTAGCCGGTG GCATTGAAGACGTGCCGCTGG
NtCAT AGGTACCGCTCATTCACACC AAGCAAGCTTTTGACCCAGA
NtP5CS GAACGGAGGTTGCTGATGGA TCCCACTTCGGACTGCTAGA
NtNCED1 AAGAATGGCTCCGCAAGTTA GCCTAGCAATTCCAGAGTGG
NtLEA5 TTGAATCTGGGGTTTTGGTT GGAAGCATTGACGAGCTAGG
NtADC1 CTTGCTGATTACCGCAATTTATC TAGGATCAGCAGCCCCCATAGCC
NtSAMDC CATTCACATTACCCCGGAAG AGCAACATCAGCATGCAAAG
Ntubiquitin TCCAGGACAAGGAGGGTAT CATCAACAACAGGCAACCTAG
实验结果
1 番茄LeMPK3基因的表达模式分析
采用RT-PCR分析番茄LeMPK3基因的表达模
式, 结果显示, LeMPK3基因在番茄的根、茎和叶
中均有表达, 但在叶中的表达量高于根和茎(图
1-A)。4 ℃低温胁迫下, 番茄叶片中LeMPK3基因
的表达量在3 h时开始积累, 6 h时到达最高值, 到12
h后开始减少(图1-B)。42 ℃高温胁迫下, 番茄叶片
中LeMPK3基因的表达量在3~12 h一直处于较高水
平(图1-C)。在外源施加H2O2、MeJA、SA后, 番茄
叶片中LeMPK3基因的表达量也显著提高, 而施加
H2O的对照中LeMPK3基因的表达量没有变化(图
1-D~G)。可见, 番茄LeMPK3基因参与逆境胁迫并
响应多种信号分子。
2 转基因烟草的鉴定
采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草, 收获的
T0代植株的种子经卡那霉素和基因组PCR筛选(结
果未列出), 得到9株转基因阳性植株。提取T2代转
基因植株的总RNA进行RT-PCR检测, 结果表明,
LeMPK3基因在转基因植株中有表达, 而野生型中
未检测到表达(图2)。选取表达量较高的OE-7、
OE-12和OE-13株系进行后续试验。
3 异源表达LeMPK3基因提高烟草耐冷性
由于4 ℃时烟草种子无法萌发(数据未列出), 因
此, 测定野生型和转基因烟草在12 ℃时种子的萌发
率和幼苗根长。结果显示, 25 ℃下野生型和转基因
植物生理学报82
烟草种子萌发率都接近100%; 而12 ℃时, 野生型的
萌发率只有50%, 而转基因烟草在80%左右(图3-A)。
25 ℃下野生型和转基因烟草的根长无显著差异;
而12 ℃时, 转基因烟草的根比野生型长(图3-B)。
图1 LeMPK3基因在不同组织(A)、非生物胁迫(B和C)和信号分子(D、E和F)处理下的表达模式
Fig.1 Expression profiles of LeMPK3 in different tissues (A), under abiotic stresses (B and C) and signalling molecules (D, E and F)
图2 半定量RT-PCR检测转基因植株中LeMPK3基因的表达水平
Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of gene expression levels in LeMPK3-ectopic expression plants
图3 异源表达LeMPK3基因提高烟草的低温抗性
Fig.3 Ectopic expression of the LeMPK3 gene in transgenic tobacco plants increased low temperature tolerance
**表示与对照相比差异极显著(P<0.01); 图4~6同此。
于力等: 异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草的抗低温胁迫能力 83
4 异源表达LeMPK3基因提高烟草的抗氧化能力
如图4-A和B所示, 在常温下, 野生型和转基因
烟草叶片中H2O2和O2¯·含量差异不显著, 而4
℃低温
胁迫下, 野生型植株叶片中的H2O2和O2¯·含量显著高
于转基因烟草。说明低温胁迫下转基因植株具有更
强的活性氧(reactive oxygen species, ROS)清除能力。
检测野生型和转基因烟草叶片中SOD、POD、
CAT和APX活性的结果表明, 常温下除OE-12的
APX活性高于野生型外, 其他株系4种酶的活性与
野生型无显著差异; 4 ℃低温胁迫处理后, 转基因
植株叶片中SOD、POD、CAT和APX活性显著高
于野生型(图4-C~F)。说明低温胁迫下转基因植株
具有更强的抗氧化酶活性, 有利于清除ROS。
5 异源表达LeMPK3基因增加了烟草中脯氨酸和
可溶性糖的含量
由图5可见, 4 ℃低温胁迫下, 转基因植株叶片
图4 低温胁迫下ROS积累和抗氧化物酶活性的变化
Fig.4 Changes in ROS accumulation and activities of antioxidant enzymes under low temperature stress
*表示与对照相比差异显著(P<0.05); 图6同此。
植物生理学报84
中脯氨酸和可溶性糖的含量显著高于野生型, 而
常温下两者无显著差异。说明低温胁迫下转基因
植株能积累更多的渗透调节物质, 增强对低温的
抗性。
6 异源表达LeMPK3基因增加了烟草中逆境相关
基因的表达
荧光定量PCR检测野生型和转基因烟草叶片
中8个逆境相关基因(NtSOD、NtPOD、NtCAT、
NtNCED1、NtP5C5、NtLEA5、NtADC1、NtSAMDC)
的表达, 结果显示, 常温下, 转基因植株叶片中8个
逆境相关基因的表达量均高于野生型; 4 ℃低温胁
迫下, 野生型和转基因植株叶片中逆境相关基因
的表达量都有所提高, 但后者高于前者(图6)。说
明异源表达LeMPK3基因增强了烟草中逆境相关
基因的表达。
讨　　论
植物在长期的进化过程中, 由于适应环境的
需要, 逐渐形成了一套完整的对外界刺激的反应机
制, 包括对外界刺激的感受、信号的放大、传输及
做出应答。在信号传递和应答过程中, MAPK级联
途径起着非常重要的作用。MAPK级联在不同层
级上存在着不同方式的调控, 如磷酸化水平、转录
水平、转录后可变剪接、翻译后修饰、细胞定位
等, 同时不同刺激会开启不同的途径。植物受到低
温胁迫时, 膜上受体感受低温信号后, 将信号向下
游传递。MAPK级联作为信号传递体, 将外部低温
信号级联放大, 传递到细胞核内, 诱导低温响应基
因的表达, 使植物获得抗冷性(丁洋等2010)。目前
对于植物中参与低温胁迫的MAPK的研究多集中
在模式植物拟南芥上, 对番茄MAPK级联通路的成
分、调控方式等信息还不完整, 因此研究低温胁迫
下番茄LeMPK3基因的表达特性及功能, 将有助于
进一步深入研究MAPK级联途径在低温信号转导
过程中的作用机制, 为研究植物抗冷信号转导机制
及其发生和发展规律提供参考。
MAPK在生物信息学上可以分为A、B、C、
D四组。番茄LeMPK3基因属于A组。大量研究表
明, A和B组MAPK参与植物对生物胁迫和非生物
胁迫响应(Feilner等2005; Hamel等2006)。OsMPK5
参与水稻对多种病害抗性的响应(Song和Goodman
2002)。拟南芥AtMPK6被多种生物逆境和环境逆
境因子激活(Feilner等2005)。本研究发现, 番茄
LeMPK3基因受低温和高温胁迫诱导, 在外源施加
H2O2、MeJA、SA后, 番茄叶片中LeMPK3基因的
表达量也显著提高, 异源表达番茄LeMPK3基因提
高了低温胁迫下烟草的萌发率和幼苗根长; 这与
前人关于A组MAPK基因参与生物胁迫和非生物
胁迫响应的研究结果相一致。
植物在低温胁迫下产生过多ROS, 而MAPK
信号系统在植物调节抗氧化系统中发挥重要作用
(Zong等2009)。在拟南芥中, AtMEKK1-AtMPK4
信号系统通过调节抗氧化系统相关基因来调控
ROS (Pitzschke等2009)。Kong等人(2011)研究发
现, 在烟草中异源表达ZmMKK4基因可以提高烟草
的抗氧化性, 从而提高烟草的抗旱性。本研究发
现在烟草中异源表达LeMPK3基因可以提高烟草
中SOD、POD、CAT和APX活性(图4-C~F), 降低
图5 低温胁迫下野生型和转基因烟草中脯氨酸和可溶性糖含量的变化
Fig.5 Changes in proline and soluble sugar contents in wild type and transgenic lines under low temperature stress
于力等: 异源表达番茄LeMPK3基因提高烟草的抗低温胁迫能力 85
图6 低温胁迫下野生型和转基因烟草中逆境相关基因的表达水平
Fig.6 The expression levels of stress-responsive genes in wild type and transgenic lines under low temperature stress
植物生理学报86
低温胁迫下植株叶片中H2O2和O2¯·含量(图4-A、B),
从而提高植株的耐寒性。后续的荧光定量PCR试
验也发现异源表达LeMPK3基因提高了烟草中
SOD、POD、CAT、APX基因的表达(图6), 从而提
高植株的抗氧化物酶活性。
脯氨酸和可溶性糖在植物抗逆适应性中发挥
重要作用。脯氨酸含量提高可以防止植物过度失
水和蛋白质变性, 提高膜系统的稳定性(Liu和Zhu
1997)。植物累积可溶性糖不仅可以降低细胞内水
势, 防止细胞过度失水, 还可以感知和调节ROS平
衡, 激活低温胁迫相关基因的表达(Heidarvand和
Amiri 2010)。本研究发现异源表达LeMPK3基因
提高了烟草中的脯氨酸和可溶性糖含量(图5), 后
续的荧光定量PCR试验也发现异源表达LeMPK3
基因提高了烟草中NtP5CS基因的表达量(图6), 而
NtP5CS基因是脯氨酸合成过程中的关键基因。因
此 , 脯氨酸和可溶性糖含量提高也是异源表达
LeMPK3基因提高烟草耐冷性的重要机制之一。
荧光定量PCR分析结果表明, 异源表达LeMPK3
基因提高了烟草中NtNCED1、NtLEA5、NtADC1
和NtSAMDC基因的表达量, 而NtNCED1基因是植
物合成脱落酸(ABA)过程中的关键基因, 因此可以
推断ABA参与了异源表达LeMPK3提高植株耐冷
性的过程。NtLEA5是编码胚胎晚期富集蛋白的基
因, 该基因编码的蛋白防止细胞失水, 保护细胞结
构和生物大分子物质的活性(Liu等2009)。多胺广
泛参与对植物逆境胁迫的响应, NtADC1和NtSAMDC
基因是植物生物合成多胺的关键基因(Takahashi和
Kakehi 2010)。因此, 转基因烟草中这些基因表达
量的提高, 说明异源表达LeMPK3基因促进合成更
多的ABA、LEA蛋白和多胺, 增强抵御低温胁迫
的能力。
综上所述, 番茄LeMPK3基因受低温、高温胁
迫和外源信号物质的诱导, 异源表达番茄LeMPK3
基因提高了低温胁迫下烟草的萌发率和幼苗根长,
增加了烟草中SOD、POD、CAT和APX活性, 降低
叶片中H2O2和O2¯·含量, 提高脯氨酸和可溶性糖的
含量, 增强逆境相关基因的表达, 从而提高转基因
烟草对低温的抗性。
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