全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 153~159 153
收稿 2010-09-29 修定 　2010-11-18
资助 北京市园林绿化局育种专项(Y1HH201000103)和农业
部 “948” 项目(2008-G3)。
* 通讯作者(E-mail: hongbo1203@163.com; Tel: 010-
6 2 7 3 2 6 4 1 )。
‘神马 ’ 菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化
魏倩 1, 李超 1, 杨英杰 2, 徐彦杰 2, 高俊平 2, 洪波 1,*
1东北林业大学园林学院, 哈尔滨 150040; 2中国农业大学观赏园艺与园林系, 北京 100193
摘要: 逆境诱导转录因子DREB1A基因在植物中的超量表达能够提高植株对低温、干旱、盐渍、高温等非生物胁迫的耐性。
从菊花中克隆得到 DgDREB1A基因, 构建了转基因表达载体 pBIG-DREB1A, 并转入农杆菌 LBA4404中; 在建立了菊花高
效再生体系的基础上, 优化受体再生体系, 通过根癌农杆菌介导将DgDREB1A基因转入切花菊 ‘神马 ’品种。PCR结果显
示, 在获得的38株卡那霉素抗性植株中有8株为阳性,表明外源基因已整合到转化植株基因组中, 转化效率为3‰。本研究
为培育综合抗逆性良好的菊花新品种奠定工作基础。
关键词: 切花菊; 克隆; DREB1A基因; 遗传转化体系
Isolation and Homologous Genetic Transformation of DREB1A in Chrysanthe-
mum cv. ‘Jinba’
WEI Qian1, LI Chao1, YANG Ying-Jie2, XU Yan-Jie2, GAO Jun-Ping2, HONG Bo1,*
1College of Landscape and Architecture, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Department of Ornamental
Horticulture, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: Overexpression of the stress-inducible transcription factor gene DREB1A in transgenic plants con-
ferred strong tolerance to abiotic stresses, such as salt, low temperature, dehydration and heat stresses. We
cloned DgDREB1A gene from chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium Ramat.) cv. ‘Jinba’, built transgene
expression vector pBIG-DREB1A and transformed the vector into Agrobacterium LBA4404. Based on the highly
efficient regeneration systerm which had been established previously, we optimized the regeneration system of
recipient material, and transferred the DgDREB1A gene into chrysanthemum plants through Agrobacterium-
mediated transformations, and obtained 38 resistant plants. PCR analysis results showed that 8 plants of them
were positive. We built the genetic transformation system of the cut chrysanthemum cv. ‘Jinba’, and this will
supply fundamental materials for the further selection.
Key words: cut chrysanthemum; clone; DREB1A gene; genetic transformation system
逆境诱导转录因子DREB (dehydration respon-
sive element binding protein)能特异地与干旱反应元件
DRE (dehydration responsive element)结合, 诱导许多
下游逆境基因的表达, 产生对低温、干旱及高盐等
逆境的响应。刘强等(2000)从拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中分离出 5个 DREB, 可以分为 DREB1
(D ER B 1A、D RE B 1B、D RE B 1C )和 D RE B 2
(DREB2A、DREB2B)两类, 其中, DREB1A受低
温迅速诱导表达并激活下游多个低温反应基因的表
达, 从而实现植株抗冻性的提高, 转基因植株研究
发现, DREB1是调节低温反应基因表达且增强抗冻
性的转录激活因子, 不受外源ABA的诱导, DREB1B
基因对 D R E B 1 A 和 D R E B 1 C 基因有负调控,
DREB1A和DREB1C基因具有相似的功能(Gilmour
等 2000; Kasuga等 1999; Jaglo-Otosen等 1998; Liu
等 1998)。近年来, 在芸苔中转入 DREB1基因增
强了植株对低温胁迫的耐性(Jaglo等2001); 将拟南
芥中 CBF3/DREB1A基因转入番茄, 转化株对低温
和氧化胁迫耐性均显著提高(Hsieh等2002); 在地被
菊花 ‘Fall Color’中, 转入 35 S和 rd29A启动子驱
动的 AtDREB1A基因, 转基因植株具有很强的低
温、干旱和盐渍耐性(Hong等 2006; 洪波等 2006,
2005)。由于DREB转录因子在提高植物抗逆基因
工程中的作用显著, 利用遗传转化技术提高植物抗
冬性成为研究的重点。
植物生理学报154
菊花品种‘神马’是目前国内市场的畅销品种,
具有花色纯正、耐运耐贮、吸水性强、瓶插寿
命长、市场销量大、经济效益高、易于栽培管
理等优点, 广为栽培应用。但是, 冬季生产能耗成
本高严重影响着切花菊的周年生产规模与供应范
围, 尤其是在北方设施环境下, 在切花菊生产中存
在着低温莲座现象, 严重影响了切花的观赏性和经
济效益。因此通过转基因手段改良现有品种, 扩大
切花菊周年性生产规模, 获得耐低温的菊花新品种,
已经成为市场的需求。
本研究从菊花中克隆DREB1A基因, 构建其遗
传转化载体, 并通过农杆菌介导法转入切花菊‘神
马’品种, 以期获得低温抗性良好的切花菊新种质,
为切花菊冬季生产降低成本、培育综合抗逆性良
好的菊花新品种提供基础材料。
材料与方法
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.) ‘神
马’ (‘Jinba’)品种由北京新华园艺有限公司惠赠; 大
肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、JM109和根
癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404、
EHA105由本实验室保存; pGEM-Teasy载体购自
Promega公司; 质粒pBIG由中国农业大学观赏园艺
与园林系观赏植物采后与逆境生理实验室惠赠。酶
和生化试剂分别购自 Sigma、TaKaRa、Promega、
Amersco等公司。
菊花总RNA采用Trizol试剂提取; RACE所用
试剂盒购自CLONTECH公司(SMARTTM cDNA Li-
brary Construction Kit), 步骤详见试剂盒说明书; 凝
胶回收采用鼎国生物工程公司的A0141 DNA快速
纯化/回收试剂盒; 连接采用Promega公司的pGEM-
T Easy Vector System; 质粒的扩增、提取、酶
切、鉴定及转化、筛选参照 Sembrook和 Russell
(2002)的方法进行。
选用质粒 pBIG, 携带 CaMV35S启动子, 载体
中构建有 NPTII植物选择基因(图 1)。
转化载体 pBIG-DgDREB1A构建时所用引物
为pBIG-Dg1A XbaI: 5 ACTTCTAGATAATGGCT-
ACTTTTATCCAAT 3; pBIG-Dg1A BamHI: 5 ACT-
GGATCCTCAAAAACTCCATAATGACACAT 3。
组织培养温度为 22~25 ℃, 16 h光照, 8 h黑
暗, 光强 300~400 μmol·m-2·s-1。农杆菌培养采用
200 r·min-1的恒温摇床, 温度为 28 ℃。本实验室
已建立再生体系: 将叶片在诱导培养基(MS+1 mg·L-1
BA+0.25 mg·L-1 2,4-D)上诱导 15 d后转到分化培
养基(MS+1 mg·L-1 BA+0.25 mg·L-1 NAA); 分化培养
1周后转到继代培养基(MS+0.02 mg·L-1 BA+0.02
mg·L-1 NAA)培养 15 d后转到生根培养基(1/2 MS+
0.1 mg·L-1 NAA)继续培养。为了优化受体再生体
系, 剪取 0.5 cm见方的幼嫩叶片接种到含有 0~10
mg·L-1浓度卡那霉素(kanamycin, Kan)的再生培养基
中, 观察Kan对外植体再生的影响; 剪取 1.5~2 cm
的再生苗接种到含有 0~10 mg·L-1浓度Kan的生根
培养基中, 光照培养 20 d后, 观察不同浓度Kan对
再生苗生根的影响, 从而确定最适转化选择压。
遗传转化采用农杆菌介导法。其中, 农杆菌
侵染浓度为OD600=0.5~0.7时, 用1/2MS液体培养基
稀释 30倍。外植体预培养 2 d, 侵染时间为 10 min,
共培养 2 d, 诱导和筛选培养基附加有 5 mg·L-1 Kan
和 100 mg·L-1头孢霉素(cefalexin, Cef), 每隔 2周转
接 1次。抗性芽生根培养时, 添加 5 mg·L-1 Kan。
待抗性植株长至 7~8 cm高时, 取少量叶片进行分
子检测, 同时进行继代繁殖, 用于阳性植株的抗性
分析等后继试验。
图 1 pBIG载体示意图
Fig.1 pBIG vector schematic map
魏倩等: ‘神马 ’ 菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化 155
采用 SDS-酚法提取抗性植株的DNA。根据
筛选标记基因NPTII基因序列设计引物, 引物序列
为上游引物: 5 CTATGACTGGGCACAACAGAC-
AATC 3; 下游引物: 5 CAAGCTCTTCAGCAAT-
ATCACGGGT 3。PCR反应程序为: 95 ℃预变性
5 min; 94 ℃变性 30 s, 60 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1
min, 33个循环; 最后 72 ℃延伸 10 min。取 10 μL
PCR反应液在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
实验结果
1 菊花 ‘神马 ’ 品种DREB1A基因的分离
我们采用 Trizol试剂(鼎国)提取了菊花的总
RNA, 反转录得到 cDNA。在NCBI上检索到地被
菊 DgDREB1A的全长序列, 利用引物设计软件
Primer5设计克隆引物, 使用TaKaRa公司的高保真
酶 Pyr扩增得到了 860 bp的片段, 其大小与预期相
一致(图 2)。
回收所得到的产物, 经连接、转化、鉴定和
测序得到如图 3 序列。
使用DNAMAN翻译DgDREB1A (1~860), 推
定的蛋白质序列包含 204个氨基酸(图 4)。
将该序列与已知发表的DgDREB1A序列相比
图 3 DgDREB1A基因核苷酸序列
Fig.3 Nucleotide acid sequence of DgDREB1A
图 2 DgDREB1A全长 860 bp
Fig.2 The 860 bp of DgDREB1A full sequence
1: 分子量标准(DL2000); 2: 1/10稀释的 cDNA扩增产物。
植物生理学报156
对的结果显示, 该序列与已知序列一致, 证明已经
克隆到了正确的DgDREB1A cDNA全长, 可以用
于构建表达载体。
2 DgDREB1A基因转化载体的构建
2.1 转基因载体的构建
选用表达载体 pBIG, 经改造后含有Kan选择
标记基因 NPTII, 植物组成型表达启动子 35S以及
必要的多个酶切位点。PCR采用 25 μL体系, 使用
TaKaRa的高保真酶 Pyr, 反应产物经 1%琼脂糖电
泳观察, 回收目标片段。将 PCR产物用 XbaI和
BamHI双酶切, 电泳后回收的基因片段, 与用XbaI和
BamHI双酶切并电泳回收的 pBIG载体连接, 构建
成转基因载体pBIG-DgDREB1A, 转化E. coli DH5α
感受态细胞, 涂板培养过夜, 在含卡那霉素的LB琼
脂板上挑取单菌落, 小量提取质粒, 酶切确认插入
后送菌液测序, 最终确认重组质粒构建成功。
图 4 推定的DgDREB1A氨基酸序列
Fig.4 The deduced amino-acid sequences of DgDREB1A
图 5 pBIG-DgDREB1A质粒构建示意图
Fig.5 pBIG-DgDREB1A plasmid construction schematic map
2.2 重组质粒向农杆菌中的转化
将 pBIG-DgDREB1A转入农杆菌LBA4404和
EHA105中(具体步骤见材料与方法)。转化后的农杆
菌暗培养2 d后, 挑单菌落于YEB液体培养基中, 在
28 ℃、200 r·min-1条件下培养 24 h, 菌液 PCR, 利用
DREB1A基因序列设计引物, 引物序列为上游引物:
5 ATGGCTACTTTTATCCAATTTAATGCTG 3; 下
游引物: 5 CAAAAACTCCATAATGACACATCAA-
CAC 3。反应条件为: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃
30 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环; 72 ℃ 10 min。在 4 ℃下
保存, 在农杆菌中检测到了 DREB1A的目标片段
条带, 证明重组质粒已经成功地导入到了农杆菌中。
3 菊花 ‘神马 ’品种转基因受体再生体系的优化
当不加抗生素的时候, 叶片外植体的再生率可
达 100%; 当Kan的浓度仅为 5 mg·L-1时, 菊花叶片
外植体就已经不能够再生出不定芽, 并且随着Kan
浓度的升高, 外植体受到的伤害程度也越高; 当Kan
浓度大于 5 mg·L-1时, 外植体几乎不产生愈伤组织
魏倩等: ‘神马 ’ 菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化 157
并且 20 d以后边缘就开始白化死亡。
当不加抗生素的时候, 再生芽能够达到 100%
的生根率, 且每个再生芽平均可形成10条以上的不
定根; 当Kan浓度为 5 mg·L-1时, 再生芽的生根率
降为0; 随着外加Kan浓度的升高, 不仅再生芽的生
根率快速下降, 其生成的不定根也很难伸长, 并且
随着时间延长, 再生苗逐渐从顶芽处开始白化直至
整株白化死亡(图 6)。
4 转基因阳性植株的获得与检验
4.1 转基因阳性植株的获得
如图 7所示, 连续筛选 6周之后, 非抗性愈伤
组织不能形成不定芽或者形成不定芽而不能正常生
长, 玻璃化或褐化死亡; 而抗性愈伤组织则能够分
化出不定芽, 且不定芽在选择压下正常生长。待不
定芽长至 2~3 cm后, 切下转入含有Kan的生根培
养基中, 共获得生根抗性苗 38株。将能够正常生
图 6 不同卡那霉素浓度对菊花再生(A)及生根(B)的影响
Fig.6 Effects of different concentrations of Kan on regeneration (A) and rooting (B) of chrysanthemum
图 7 转基因阳性植株的获得
Fig.7 Obtain of putative transgenic lines
A: 非卡那霉素抗性愈伤组织逐渐褐化死亡; B: 卡那霉素抗性愈伤组织与非抗性愈伤组织在培养皿中的生长情况; C: 卡那霉素抗
性愈伤组织分化出不定芽; D : 抗性芽移栽成活情况。
植物生理学报158
根的抗性芽锻炼出瓶, 出瓶的抗性苗生长势强, 等
待进一步的抗性检测。
4.2 转基因阳性植株的分子检测
采用 SDS-酚法提取抗性植株的 DNA, 5 μL
体系进行酶切, 37 ℃放置过夜, 第 2天进行纯化;
PCR反应体系与引物见材料与方法。将获得 38株
抗性植株进行了PCR检测, 其中有8个株系检测到
了与阳性对照相同的 643 bp条带, 部分检测结果见
图8。
PCR分析的结果表明, 非转基因植株和负对
照都没有检测到目标条带, 抗性植株中编号为2、
4、5、9号的植株检测到了目标条带, 初步证明外
源DgDREB1A基因已经整合到切花菊 ‘神马 ’基
因组中。目前, 正在对转基因植株进行进一步的
外源基因的表达分析、抗性检测以及遗传稳定
性检测。
讨　　论
DREB基因是逆境信号传导途径中的一个重
要的转录因子, 目前已从多个物种中克隆到了该家
族基因成员(张梅等 2009; Qin等 2004, 2003; Shen
等 2003; Choi等 2002; Sakuma等 2002)。本实验
通过查阅基因数据库, 获得地被菊花的DREB1A基
因全长序列, 通过设计克隆引物成功的从切花菊
‘神马 ’中获得了DgDREB1A基因。通过与地被菊
花DgDREB1A基因的比对发现, 它们的同源性达到
了98%以上, 说明地被菊花与切花菊虽然在生长形
态上产生了变异, 但是在逆境诱导基因表达方面却
保持了很高的相似性。利用已获得的基因构建了
转基因表达载体, 为转化菊花提高其综合耐性做好
了准备。
目前已报道的菊花遗传转化方法主要是根癌
农杆菌介导法(邵寒霜 1999; Hutchinson等 1992;
Wordragen等 1991)。在菊花的转基因体系中, 抗
性筛选应该贯穿于整个过程, 不仅在外植体再生过
程中需要加入抗生素对再生芽进行筛选, 在抗性芽
生根的过程中同样应该加入抗生素对其进行2次筛
选。因为在初次筛选过程中由于种种原因可能造
成假转化体的生成, 所以我们首先需要确定最适合
的生根选择压, 使得选择压既能有效的选出阳性转
化体, 又不对再生苗的生长造成很大的影响, 所以
本实验也筛选了转化时的最适选择压。
PCR检测结果表明即使在选择压下能够正常生
长的抗性苗也存在着一定比例的假阳性, 分析原因
如下: (1)筛选压过低, 部分非转化苗能够在低选择
压下正常生长; (2)转化细胞中抗性基因的表达释放
的抗性物质对周围非转化细胞产生庇护作用, 使非
转化细胞得以分化成芽; (3)筛选过程中部分外植体
翘起, 翘起的部分逃过了筛选分化成芽等。因此, 在
转基因筛选过程中仍然需要对筛选策略以及筛选过
程进行再优化, 在减少假转化体的同时提高转化率。
菊花遗传背景复杂且高度杂合, 遗传转化普遍
较难, 转化率低, 本实验共侵染外植体 2 820个, 得
图 8 卡那霉素抗性植株的 PCR分析
Fig.8 PCR analysis of the kanamycin resistance lines
M: 分子量标准(DL2000); 1~12: 转基因株系; CK: 非转基因植株; +: DgDREB1A质粒; –: H2O。
魏倩等: ‘神马 ’ 菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化 159
到 PCR阳性植株 8株, 转化率接近 3‰。同源基因
在转化植株中的表达、阳性植株的抗性检测以及
后继工作仍在进行中。
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