全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７２１－７２７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１４０９０４８
王毅,周旭,毕玮,等．思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７２１－７２７
WangY,ZhouX,BiW,etal．Cloningandsequenceanalysisof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４ＧdiphosphatereductasegenecDNAfromPinuskesiya
var．langbianensis[J]．Guihaia,２０１５,３５(５):７２１－７２７
思茅松HDR 基因全长cDNA克隆与序列分析
王　毅１,２,周　旭３,毕　玮１,２,杨宇明２,李　江２,王　娟２∗
(１．云南林业科学院 国家林业局云南珍稀濒特森林植物繁育和保护重点实验室,昆明６５０２０１;２．云南林业学科院,
云南省森林植物培育与开发利用重点实验室,昆明６５０２０１;３．西南林业大学,昆明６５０２２４)
摘　要:１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２ＧEＧ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶(HDR)是甲基ＧDＧ赤藓醇Ｇ４Ｇ磷酸(MEP)途径中的最后一
个酶,在植物萜类生物合成中起主控作用.该研究根据思茅松(Pinuskesiyavar．langbianensis)树皮转录组
数据分析结果,首先获得了思茅松HDR 基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物,提取受伤后的
思茅松树皮的RNA,并运用RTＧPCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的HDR 基因(PkHDR).
生物信息学分析表明:克隆获得的PkHDR１基因cDNA全长序列为１８７６bp,含有１个１４６４bp的开放阅读
框(ORF),编码４８７个氨基酸.同源性分析结果表明:思茅松HDR蛋白与赤松(Pinusdensiflora)HDR蛋白
的相似性高达９９％.亚细胞定位及结构域分析结果表明:思茅松PkHDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A１Ｇ
A６１)及植物 HDR蛋白多个保守的功能位点(A１４３,A２３４,A２８８,A３７１).系统进化分析结果表明:PkHDR蛋
白与赤松 HDR蛋白的亲缘关系最为接近.半定量PCR检测结果表明:树皮的创伤促进思茅松HDR 基因的
表达.该研究成功克隆获得HDR 基因,并确定其与松脂代谢密切相关,为阐明思茅松松脂生物合成机制和
分子育种提供了参考.
关键词:思茅松;HDR;cDNA克隆;基因功能分析;半定量PCR
中图分类号:Q９４３．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７２１Ｇ０７
Cloningandsequenceanalysisof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ
２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４ＧdiphosphatereductasegenecDNA
fromPinuskesiyavar．langbianensis
WANGYi１,２,ZHOUXu３,BIWei１,２,YANGYuＧMing２,
LIJiang２,WANGJuan２∗
(１．KeyLaboratoryofRareandEndangeredForestPlantsofStateForestryAdministration,YunnanAcademyofForestry,
Kunming６５０２０４,China;２．KeyLaboratoryofForestyPlantCultivationandUtilization;YunnanAcademyofForestry
Kunming６５０２０４,China;３．FacultyofForestry,SouthwestForestryUniversity,Kunming６５０２０４,China)
Abstract:１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphatereductase(HDR)catalyzesthelaststepofthe２CＧmethＧ
ylＧDＧerythritolＧ４Ｇphosphate(MEP)pathway,１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇdiphosphatereductaseplaysan
importantroleinregulationofterpenesbiosynthesis．Toexplorethefunctionof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４Ｇ
diphosphatereductaseinPinuskesiyavar．langbianensis,andtostudytheroleof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ
收稿日期:２０１４Ｇ１１Ｇ２５　　修回日期:２０１５Ｇ０３Ｇ３０
基金项目:国家林业公益性行业科研专项(２０１３０４１０５);云南省应用基础研究重点项目(２０１３FA０５４);云南省中青年学术技术带头人后备人才培
养项目(２０１０CI０１６).
作者简介:王毅(１９８１Ｇ),男,四川广安人,博士,助理研究员,主要从事植物学和分子生物学研究,(EＧmail)２２８２５８１８＠qq．com.
∗通讯作者:王娟,博士,教授,长期从事生物多样性保护和竹类植物的微观研究,(EＧmail)schima＠１６３．com.
４Ｇdiphosphatereductaseinregulationofresinbiosynthesis,thetranscriptomeofbarkofPinuskesiyavar．langbianenＧ
siswassequencedbyNextＧGenerationSequencing．First,afragmentof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４ＧdiphosＧ
phatereductasegenewasobtainedfromPinuskesiyavar．langbianensistranscriptomeaftergeneassembleandgene
functionannotation．Thespecialprimersweredesignedaccordingtothefragmentof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)ＧbuteＧ
nylＧ４Ｇdiphosphatereductase．RNAofinjuredbarkwasextractedbyTrizolmethod．ThefullengthgeneofPkHDR
wasclonedfromPinuskesiyavar．langbianensisbyReverseTranscriptionＧPolymeraseChainReaction(RTＧPCR)
andrapidＧamplificationofcDNAends(RACE)．BioinformationanalysisshowedthattheobtainedfulcDNAseＧ
quenceofPkHDRhad１８７６bp．Itwasconsistedof１４６４bpopenreadingframe(ORF)whichencoded４８７amino
acid．HomologyanalysisindicatedthatthededucedPkHDRproteinshared９９％identitieswiththe１ＧhydroxyＧ２Ｇ
methylＧ２Ｇ(E)ＧbutenylＧ４ＧdiphosphatereductasecamefromPinusdensiflora．Subcelularlocalizationandstructural
domainanalysisshowedthatthetransitpeptidesequence(A１ＧA６１)andmultipleconservedfunctionalsites(A１４３,
A２３４,A２８８,A３７１)ofplantHDRproteinwerefoundinthededucedcodingsequenceofPKHDR．PhylogeneticanalＧ
ysisrevealedthattheevolutionaryrelationshipofPkHDRproteinwastheclosesttoPinusdensifloraHDRprotein．
Reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTＧPCR)detectionshowedthatPkHDRgeneexpressionwasupＧ
regulatedbywoundingtreatment．ThefulcDNAofPkHDRfromPinuskesiyavar．langbianensiswasclonedand
thereversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTＧPCR)showedthatPkHDR wasinvolvedinregulationof
resinbiosynthesisinPinuskesiyavar．langbianensis．Theseresultswouldprovideimportantinformationtorevealthe
resinbiosynthesisinPinuskesiyavar．langbianensis．Andthisstudyalsocanbeappliedintheresearchofthehigh
yieldofresinvarietymolecularbreeding．
Keywords:Pinuskesiyavar．langbianensis;１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ２Ｇ(E)Ｇbutenyl４Ｇdiphosphatereductasegene;cDＧ
NAclone;genefunctionanalysis;RTＧPCR
　　松脂是重要的化工原料,其挥发性单萜和挥发
性倍半萜以及非挥发性的二萜广泛应用于化学,食
品和医药等领域(Bohlmannetal．,２００８;Rodrigues
etal．,２０１３).思茅松(Pinuskesiyavar．langbiＧ
anensis)是云南省最主要产脂树种之一,其主要分布
在云南省普洱地区,具有生长快、松脂产量高等优点
(徐明艳等,２０１２).在生产实践中发现思茅松个体
松脂产量差异显著,单株年产量一般３kg,最高可
达１４０kg(徐明艳等,２０１２).这意味着思茅松单位
面积产脂量有巨大的提升空间.我国自２０世纪８０
年代始开展思茅松遗传改良研究,在种源试验、优良
林分选择、优树收集、无性系种子园建设、半同胞子
代测定、早晚期性状相关及遗传变异等方面开展了
研究(张文勇等,２０１０).姜远标等(２００７)尝试利用
现代分子标记辅助思茅松高产脂育种.但目前对思
茅松松脂代谢过程中关键酶的研究尚未见有报道.
所有萜类化合物,包括思茅松松脂主要成分都
是以异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸
(DMAPP)为初始底物,在异戊二烯转移酶(FPP,
GPP,GGPP)作用下生成萜类化合物的各种前体,
在萜烯合酶作用下生成单萜、二萜、倍半萜等
(Thol,２００６).IPP和DMAPP可以通过两个代谢
途径独立合成,即位于细胞质中的甲羟戊酸(MVA)
途径和位于质体中的甲基ＧDＧ赤藓醇Ｇ４Ｇ磷酸途径
(MEP).其中,MEP途径的最终产物通常是单萜、
二萜和四萜类化合物;而 MVA途径的最终产物通
常是倍半萜、三萜类化合物(Lauleetal．,２００３;
Vranováetal．,２０１３).李思广等(２００８)对思茅松
高产脂个体的松脂化学组成特征分析发现思茅松所
产松脂中的主要成分为单萜和双萜化合物,而倍半
萜的含量不到２％.因此,MEP途径对思茅松松脂
代谢具有重要意义.
１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２ＧEＧ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶
(HDR)是甲基ＧDＧ赤藓醇Ｇ４Ｇ磷酸(MEP)途径中的最
后一个酶,通过在大肠杆菌中超表达蓝细菌和植物
中的HDR 基因证明了 HDR是萜类生物合成的限
速酶(Wolffetal．,２００３).相对于 MEP途径中的
另外一个限速酶,脱氧木酮糖Ｇ５Ｇ磷酸合酶(DXS),
HDR在通过 MEP途径提供前体的萜类的生物合
成中起到主控作用(Botelaetal．,２００４).Kimet
al．(２００９)研究赤松松脂代谢时,发现HDR 基因在
转录水平的差异影响着赤松松脂的产量.本文通过
对思茅松转录组数据分析获得思茅松的HDR 基因
序列,利用RTＧPCR和RACE方法获得全长的思茅
２２７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
松HDR 基因,并通过生物信息学方法对基因序列
及推导的氨基酸序列进行分析,为阐明思茅松松脂
生物合成机制和分子育种提供参考.
１　材料与方法
１．１材料
思茅松树皮采集于云南省普洱市景谷县半坡
乡,按当地采松脂步骤,去除粗皮后,将表皮以及形
成层部分割下,迅速放入液氮中,并用液氮保存直到
RNA提取.pESYＧT３克隆试剂盒及感受态细胞均
购自北京全式金公司;LAＧTaq酶、以及 Reverse
TranscriptaseMＧMLV购自大连宝生物公司.
１．２总RNA的抽提
思茅松的树皮、松针、幼枝的 RNA 提取参照
CTABＧLiCl沉淀法(Azevedoetal．,２００３;王雁等,
２０１１).改进的地方主要是在对RNA中的DNA消
化,本实验采用膜上消化的方式去除DNA.方法如
下:将溶解的RNA用DEPC水补足２００μL后,加
入１００μL的无水乙醇,混匀后加入RNASpinColＧ
umn(宝生物,RNA提取试剂盒),按照试剂盒步骤
进行DNA消化,最终用３０μL洗脱液进行洗脱.
１．３思茅松HDR基因的３′RACE
由于转录组数据分析只得到思茅松 HDR的片
段,缺少３′端的基因序列.因此,首先以思茅松树
皮的 RNA 为模板,按照３′ＧFul RACECoreSet
withPrimeScriptRTase(TaKaRa)试剂盒说明书合
成３′端完整的思茅松cDNA第一链.根据获得的
HDR 基因片段序列设计３′RACE引物(表１),对思
茅松HDR 基因片段的３′基因片段进行克隆.
１．４cDNA全长扩增
依据cDNA拼接序列,设计HDR 基因特异引
物PkHDRF０和PkHDRR０(表１),以思茅松树皮的
cDNA为模板,PkHDRF０和PkHDRR０为引物,扩
增思茅松HDR 基因cDNA开放阅读框全长序列.
反应条件为９４℃５min;９４℃３０s,５８℃４５s,７２
℃２min,３０个循环;７２℃延伸１０min.扩增的
PCR产物胶回收后连接到pEASYＧT３载体中.并
测序验证所克隆得到的全长cDNA.
１．５思茅松HDR基因cDNA 序列及其编码蛋白氨
基酸的序列分析
采用 NCBI(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)
Blast工具和DNAMAN软件将思茅松 HDR与数
据库中其他植物HDR基因进行核酸和氨基酸的同
源序列比对,多序列的比对由ClusterW 程序完成.
并用 MEGA４．０．２软件的邻位相连算法(NeighborＧ
joining)１０００次自检举(bootstraping)绘制出进化
树图像.TargetP(www．cbs．dtu．dk/services/TarＧ
getP/)和ChloroP(http://www．cbs．dtu．dk/servＧ
ices/ChloroP/)被用来预测PkHDR蛋白的亚细胞
定位以及叶绿体转运肽的切割位点.
１．６思茅松HDR 基因表达分析
以获得的PkHDR 基因序列为模板设计特异
引物FHDRt和 RHDRt(表１).将样品液氮研磨
后,用CTAB法分别提取思茅松的树皮１(除去粗皮
后立即取样),树皮２(除去粗皮后１２h取样,树皮３
(除去粗皮后２４h取样),树皮４(除去粗皮后３６h
取样).并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后,将
RNA保存在Ｇ８０℃超低温冰箱.cDNA合成参照
ReverseTranscriptaseMＧMLV试剂盒说明书操作
(宝生物工程有限公司,大连),将cDNA保存在Ｇ２０
℃冰箱.以特异引物 FHDRt和 RHDRt检测
PkHDR基因的表达情况,同时以actin为内参.
表１　文中所用引物序列
Table１　Primersusedinthisstudy
名称
Name
序列(５′~３′)
Sequence(５′Ｇ３′)
用途
Purpose
３RACHDRF１ CAATGATGCGTAGATTTGGTGTT
３RACHDRF２ CCACTCAGGAAAGACAAGATGCA
３′RACE
PkHDRF０ ATGGCTCAAGCGTGCGCGGT
PkHDRR０ CTATGCTGCTTGCAGAGCCT
全长cDNA
开放阅读框
克隆
cDNAORF
Clone
FHDFt ACGTGCAGTGCAAATTGCAT
RHDRt ATCAAGCTTCTCCTTTACTA
RTＧPCR
检测
RTＧPCR
detection
Factin ATTGCTGACCGTATGAGCA
Ractin TGAATACTAGCTAGCCTCA
RTＧPCR
内参
RTＧPCR
control
２　结果与分析
２．１３′RACE
采用CTAB提取结合LiCl沉淀法(Azevedoet
al．２００３;王雁等,２０１１),提取思茅松树皮以及松针
的RNA,并用膜上消化的方式除去样本中的DNA,
获得完整且纯度高的RNA(图１).
３２７５期　　　　　　　　　王毅等:思茅松HDR 基因全长cDNA克隆与序列分析
图１　 HDR 基因克隆　M１．Trans２KDNAMarker;M２．
TaKaRa１KMarker;１．３′RACE;２．HDR全长ORF克隆.
Fig．１　PCRproductofHDRgeneclone　M１．Trans２K
DNAMarker;M２．TaKaRa１K Marker;１．３′RACE;２．ORFof
HDRgene．
２．２思茅松HDR 全长cDNA的克隆与序列分析
通过对思茅松树皮转录组数据分析获得１１８５
bp大小的HDR 基因片段,根据该片段设计特异引
物,用RACE技术克隆目的基因的３′cDNA末端,
并进行测序验证,结果表明其大小为６８５bp(图１).
对获得的基因片段序列进行拼接后,获得全长
cDNA序列为１８７４bp.利用软件分析获得cDNA
开放阅读框,并根据该序列设计含有起始密码子的
特异引物PkHDRF０和含终止密码子的特异引物
PkHDRR０,并以思茅松树皮cDNA为模板,PCR扩
增获得１４６４bp的cDNA完整的开放阅读框,并命
名为PkHDR.将此１４６４bp片段与 HDRcDNA
拼接序列进行比对分析,分析结果显示两序列一致,
这表明思茅松HDR 基因cDNA拼接序列正确.其
５′含有４５bp的非编码区,３′端含有３６５bp的非编码
区,这表明成功克隆获得完整的思茅松 HDR基因的
cDNA序列(GenBankAccessionNo．KM３８２１７２).
２．３PkHDR氨基酸序列分析
根据思茅松PkHDR 基因cDNA全长序列推
测其编码４８７个氨基酸残基,该基因推断的蛋白与
赤松(Pinusdensiflora)以及火炬松(P．taeda )
HDR蛋白的相似性为９９％.这说明HDR 基因在
松科中极其保守.以思茅松 HDR氨基酸序列与来
其他四种不同物种的１Ｇ脱氧ＧDＧ木酮糖Ｇ５Ｇ磷酸合酶
氨基酸序列进行序列比对分析,推测出PkHDR蛋
白具有植物HDR蛋白催化过程中必需的４个半胱
氨酸位点(A１４３,A２３４,A２８８,A３７１)(图２).利用
亚细胞定位软件以及叶绿体转运肽的切割位点分析
软件分析显示PkHDR的合成位于叶绿体内,其含
有一个由６１个氨基酸残基构成的叶绿体转运肽(切
割位点已用箭头标注,图２).
２．４PkHDR系统进化树分析
思茅松HDR与其他植物的 HDR氨基酸序列
的系统进化分析表明:思茅松 HDR与松科的１Ｇ脱
氧ＧDＧ木酮糖Ｇ５Ｇ磷酸合酶聚为一类,从系统进化树可
以看出思茅松PkHDR与赤松的HDR 基因及欧洲
云杉(Piceaabies)的HDR的亲缘关系较近(图３).
２．５PkHDR 基因的转录模式分析
利用 PkHDR 基因的特异引物 FHDRt和
RHDRt,通过RTＧPCR检测PkHDR在模拟割脂过
程中导致思茅松树皮受伤后,随着 时 间 变 化
PkHDR 基因表达情况.从图４看出,PkHDR 基
因在创伤后(１２、２４、３６h)的表达量明显高于刚刚创
伤时(０h)的表达量.这说明对树皮的损伤会刺激
PkHDR 基因表达.
３　讨论
思茅松是云南主要的产脂树种,也是中国重要
的产脂树种,其树干富含树脂,其松节油平均含量
２０％,最高可达３２％,松节油中βＧ蒎烯含量高,为全
国之最(徐明艳等,２０１２).在生产实践发现思茅松
个体产脂差异巨大,经过多年研究积累确定思茅松
个体产脂差异主要源于其个体的遗传性状上的差异
(张文勇等,２０１０;李思广等,２００９).思茅松生长周
期漫长的特性,给传统数量性状的研究带来巨大的
挑战.虽然国内已开展无性系种子园建设、半同胞
子代测定、早晚期性状相关及遗传变异等方面的工
作,但并未解决思茅松高产脂机理的问题.大量的
图位克隆结果表明数量性状基因座在基因组上往往
位于控制其性状的代谢通路上的酶基因上或者附近
(谭震波等,１９９６;Mackayetal．,２００９;Zorrilaet
al．,２０１１;Indurietal．,２０１２).因此,反向数量遗传
学研究策略被提出来(Mauricio,２００１),即从候选基
因(通常是与数量性状相关的代谢通路上的关键基
因)出发,首先确定候选基因与数量性状相关性,再
对候选基因上下游序列进行研究,获得数量性状基
因座进而阐明数量性状基因调控机理(Salvietal．,
２００５;Longhietal．,２０１３).特别是近年测序技术
的飞速发展,从候选基因出发,通过比较基因组上的
差异获得大量数量性状基因座(Harmegniesetal．,
４２７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图２　思茅松和其他物种 HDR氨基酸序列比对分析　PdHDR:赤松(Acc５４５６１);PtHDR:火炬松(AB０２６５８８);TmHDR:曼
地亚红豆杉(ABU４４４９０);GbHDR:银杏(ABB７８０９０).所有蛋白序列中的保守氨基酸都用星号标注,有两个变化的氨基酸位点用点标记.
四个保守的半胱氨酸用灰色标注,其形成的键桥参与了酶的催化,叶绿体转运肽切割位点根据比对结果分析用黑色三角形标注.
Fig．２　MultiplealignmentofdeducedaminoacidsequencesofHDRs　PdHDR．Pinusdensiflora(ACC５４５６１);PtHDR．Pinustaeda
(ABO２６５８８);TmHDR．Taxusmedia(ABU４４４９０);GbHDR．Ginkgobiloba(ABB７８０９０)．Aminoacidresiduesconservedamongalsequencesare
markedwithanasterisk;variabilitybetweentwoaminoacidresiduesismarkedwithadot．Fourconservedcysteinresiduesarehighlightedwithgray,
whichsupposedlyparticipateinthecoordinationoftheironＧsulfurbridgeproposedtobeinvolvedinenzymaticcatalysis．DarktriangleindicatesthepuＧ
tativecleavagesitededucedfromthealignmentresult．
２００６;Wangetal．,２０１１;Guggenheimetal．,２０１３).
１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２ＧEＧ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸还原酶
(HDR)是 MEP途径中的末端酶,催化１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲
基Ｇ２ＧEＧ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷酸(HMBPP)发生还原反应生
成IPP和DMAPP.近年通过异源表达以及超表达
实验表明HDR 基因在植物萜类生物合成中有重要
作用(Wolffetal．,２００３;Botelaetal．,２００４;张雯
等,２００８).特别是国外研究人员通过基因表达实验
证明HDR 基因控制着赤松松脂的生物合成(Kim
etal．,２００９),这进一步证明HDR 基因在松脂合成
代谢中起着重要作用.通过比对分析发现思茅松
HDR 基因与赤松HDR 基因的相似度高达９９％,
只有三个氨基酸的差异(A４４,A４７３,A４８２),与火炬
松HDR相似度也高达９８．９７％,只有五个氨基酸的
差异(A２４,A１６１,A４２１,A４７３,A４８２).通过比较思
茅松以及已经公布的其他松科植物 MEP途径中关
键酶基因序列也显示出在蛋白序列具有高度保守
性.这暗示在松科 MEP途径相关酶在进化上趋于
５２７５期　　　　　　　　　王毅等:思茅松HDR 基因全长cDNA克隆与序列分析
图３　PkHDR与其他不同物种间 HDR系统进化树　邻近相接法构建的系统进化树是用 MEGA４软件基于已经在GenBank里
公布的 HDR构建.
Fig．３　PhylogenetictreeoftheHDRs　TheneighborＧjoiningtreewasconstructedusingMEGA４basedonaminoacidof１ＧhydroxyＧ２ＧmethylＧ
２Ｇ(E)Ｇbutenyl４ＧdiphosphatereductasewhichwerepublishedonGenBank．
图４　思茅松PkHDR在树皮创伤后表达情况　用特
异引物扩增基因片段后,并用１％琼脂糖胶检测基因转录情况.
Fig．４　RTＧPCRanalysisofPkHDRexpressionafter
woundingtreatment．　TranscriptswereamplifiedusinggenespeＧ
cificprimers,withthePCRproductsseparatedusing１％agarosegel．
保守,思茅松个体产脂差异是相关基因在转录水平
上的差异导致而不是某个酶活性差异导致.通过
RTＧPCR检测思茅松模拟割脂过程产生创伤后
HDR表达情况发现,创伤能够有效地刺激 HDR表
达(图４).这与生产实践中割脂可以刺激松脂产生
相吻合,说明 HDR表达高低与产脂量正相关.而
对于不同个体在相同处理(创伤)的情况下,表现出
不同的产脂量,这很可能与个体中基因拷贝数以及
关键酶基因所处染色体位置相关,即所对应的数量
性状基因座相关.
本文以普洱市景谷县半坡乡的思茅松“产脂王”
(松脂年产量超过１００kg)为研究对象,首先对其树
皮转录组进行测序,然后通过转录组数据分析获得
HDR 基因序列,并利用RACE等方法获得思茅松
PkHDR 基因全长序列,并将PkHDR完整的开放
阅读框克隆到载体pEASYＧT３中.通过生物信息
学分析确定其为１Ｇ羟基Ｇ２Ｇ甲基Ｇ２ＧEＧ丁烯基Ｇ４Ｇ焦磷
酸还原酶,同时,利用半定量PCR确认创伤正调控
PkHDR 基因表达,证明其与思茅松松脂合成相关.
本研究为未来深入研究思茅松高低产脂机理以及利
用PkHDR 基因培育思茅松新品种奠定基础.
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