全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 11期，2009年 11月 1119
收稿 2009-07-14 修定 　2009-09-21
资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)和
河南省杰出人才创新基金(02 21 00 09 0)。
* 通讯作者(E-mail: xinjian@371.net; Tel: 0371-63558722)。
生长素结构与其活性关系的揭示
杨艳会, 张清哲, 陈军营, 陈新建 *
河南农业大学农学院, 郑州 450002
Elucidation of Relationship between Auxin Structure and Its Activity
YANG Yan-Hui, ZHANG Qing-Zhe, CHEN Jun-Ying, CHEN Xin-Jian*
College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002
提要: 生长素结构与活性之间关系是长期以来悬而未决的一个难题。最近的研究证明, 生长素分子像 “胶水 ”一样将受体
TIR1与效应蛋白Aux/IAA“粘合 ”后, 形成SCFTIR1-生长素 -Aux/IAA复合物, 进而激活泛素连接酶3 (SCFTIR1), 起着促使Aux/
IAA泛素化后的降解, 转录因子ARFs得到活化后, 启动一系列生长素响应基因的转录, 于是植物表现出相应的生长发育状
态。
关键词: 生长素结构; 受体; 作用机理; 分子胶
众所周知, 不论天然的生长素或人工合成的生
长素类似物, 只要其结构均有一个芳香环、一个短
链(1~4个碳)和一个羧基, 就具有生理活性。结构
如此简单的小分子物质, 却有着神奇的“魔力”！它
们是如何发挥作用呢？几十年来, 人们一直在孜孜
不倦地寻找着答案, 但一直扑朔迷离、不得而解。
近年来, 随着生长素受体 TIR1及其效应蛋白Aux/
IAA的发现(Dharmasiri等 2005; Kepinski 和Leyser
2 0 0 5 ) , 对此问题人们已接近解决。2 0 0 7 年
《Nature》上的一篇论文终于揭开了生长素结构
和活性关系的神秘面纱(Tan等 2007): 生长素分子
中的羧基与其受体TIR1 (transport inhibitor response
proterin 1)分子中的精氨酸残基通过盐键和氢键结
合, 生长素分子中的芳香环通过疏水键和范德华力
与其效应蛋白Aux/IAA结合, 形成 SCFTIR1-Auxin-
Aux/IAA复合物, 进而, 生长素分子便像 “分子胶 ”
一样将其受体和底物 “粘合 ”在一起。如此即简单
但又有效的作用方式令人们茅塞顿开。这一具有
里程碑性质的研究成果终于揭开了困扰人们几十年
的生长素结构与活性关系之谜, 引起了人们的关
注。本文就生长素结构与活性关系的相关研究作
简要介绍。
1 生长素分子结构和活性关系的探索历程
生长素结构与活性关系的研究始于20世纪30
年代(Went和 Thimann 1937; Koepflit等 1938), 经
历了一个曲折、漫长和艰难的探索过程。1937年
Went和 Thimann根据具有生长素活性物质的结构
发现它们的分子结构都有着共同的结构特征: 以一
个不饱和的环状结构为中心, 侧链中有一个羧基集
团, 羧基集团与芳香环之间以特定空间结构相连(图
1)。上世纪 50年代, 有两个重要假说即 “两点连接
理论(two point attachment theory)”(Hansch和Muir
1950)和 “分离电荷理论(separation charge theory)”
(Thimann和 Leopold 1955)。“两点连接理论 ”推
测在生长素的活性位点与其芳香环之间应该有一个
共价键; “分离电荷理论”认为生长素的生物活性与
其吲哚环中的N-H单键中氮的电荷相关联。显然
这两种说法难以统一, 也难以令人信服。到了 20
世纪 70~ 80 年代, 以生长素受体结合位点模型
(binding site model)为代表, 掀起了生长素结构与活
性关系研究的高潮。结合位点模型认为 IAA分子
结构中的吡咯环氮以氢键与生长素受体位点的底部
相结合而产生生理活性(Kaethner 1977)。但所有
具有生长素活性物质的分子结构与结合位点模型并
不完全统一(Katekar 1979, 1982; Ketekar和Geissler
1983; Katekar等 1987)。
1994年, Edgerton等(1994)建立了ABP1 (auxin-
binding protein 1)受体结合位点模型。提出生长素
研究通讯 Research Letter
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羧基垂直在芳香环平面上, 羧基中的氧原子直接跨
过该芳香环的观点。1998年, Tomic等(1998)采用
计算机化学与生物统计学方法, 测定了50个化合物
的生长素活性, 并根据其活性将它们分成了 4类:
强、弱、无和抑制生长素活性物质。通过计算
相似性指标进行比较分析, 推测出这些化合物的活
性部分可能是 “倾斜 ”构象。2003年, Bertosa等
采用分子量子相似性测量(molecular quantum simi-
larity measure, MQSM)的方法, 对 100种植物生长
素类物质的化合物 logP和 logD值进行推测, 认为
这些化合物的生物活性影响logP和logD值(Bertosa
等2003)。这些用量子力学的观点以及术语的研究
和描述, 并没有解决人们对生长素结构与活性关系
的认识问题。
以上这些研究均是从生长素结构本身来考虑
的, 并没有找到令人满意的答案, 简单问题反而更
加复杂化。只有找到生长素的受体和效应蛋白后
才能直接观察到生长素、受体和效应蛋白三者的
结合方式和揭示生长素的结构与活性之间关系。
2 生长素的作用机制
2.1 生长素受体及其效应蛋白 泛素 -蛋白酶体系
统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是近年来发现
的真核生物体内蛋白质降解的途径, 在真核生物生
长发育中起关键作用(Liscum 和 Reed 2002)。UPS
系统包括泛素、泛素连接酶和蛋白酶体等成分。
泛素是个小蛋白(76 aa), 其序列高度保守, 当其标
记(泛素化)到靶蛋白上后, 泛素化(或多泛素化, 即
一个蛋白上标记多个泛素)的蛋白即送进蛋白酶体
(proteasome)降解(Gtickman和 Ciechanover 2002)。
泛素化过程涉及到 3个酶: E1、E2和 E3。其中
E 3 , 即泛素连接酶 3 是一个特异性的关键酶
(Kepinski和Leyser 2005)。泛素连接酶3有很多种,
主要分为两大类: 促进细胞分裂复合体(anaphase-
promoting complex, APC)和 SCF复合体(Skp1-
Cdc53/Cul1-F-box protein)。SCF复合体包含 4个
成分, 其中 3个(CUL1、ASK1、RBX1)是通用的,
没有特异性, 且在动物和植物中相当保守。1个是
特异的, 该酶的特定底物由其决定。生长素受体
TIR1是SCF复合体泛素连接酶3中的特异成分, 包
含 TIR1的泛素连接酶中复合体, 写作 SCFTIR1。由
于TIR1是一种赋予SCF酶复合体底物特异性的F-
b o x 蛋白, 因此有的文献将上述酶复合体称为
SCFTIR1复合体(Dharmasiri等 2005; Kepinski和
Leyser 2005; 白华举等 2006)。Kepinski和 Leyser
(2005)用放射性标记的方法证明 [3H]IAA结合在
SCFTIR1复合物上, 同时用蛋白 pull-down技术证明
生长素直接结合在TIR1上, 最终确证TIR1为生长
素的受体(白华举等 2006)。
生长素效应蛋白Aux/IAA是高等植物中普遍
存在的一类蛋白, 其分子量一般在 20~30 kDa, 在
拟南芥中有29个编码Aux/IAA蛋白的基因(Liscum
和 Reed 2002)。Aux/IAA属于早期的生长素反应
基因, 大部分基因的转录受生长素的上调。Aux/
IAA类蛋白含有 4个保守的结构域(I~IV) (Abel等
1995)。其中结构域 II是与 TIR1结合的区域(Gray
等 2001), 结构域 III和 IV是与生长素响应因子
(auxin response factor, ARF)相结合的部位。ARF
是一类转录因子, 它结合于生长素响应基因的启动
图 1 部分生长素的化学结构
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子部位。生长素浓度较低时, Aux/IAA相对稳定,
Aux/IAA蛋白就通过结构域 III和 IV与ARF结合,
使之处于受阻状态, 基因转录受到抑制; 而生长素
浓度升高时, SCFTIR1复合物 TIR1 分子的 LRR
(leucine-rich-repeats)结构域与生长素和Aux/IAA结
构域II之间相结合, 形成SCFTIR1-Auxin-Aux/IAA复
合物, 接着复合物上的Aux/IAA蛋白被泛素化, 然
后被蛋白酶体(proteasome)降解。脱离阻遏蛋白
Aux/IAA 的ARF解除抑制, 成为活化的转录因子,
与之结合的基因即开始转录(图 2)。
图 2 SCFTIR1泛素连接酶在生长素信号传导过程中的作用(Tan 和 Zheng 2008)
生长素缺乏时, Aux/IAAs与生长素响应因子 ARFs结合, 抑制AuxRE基因表达(左); 生长素存在时, SCFTIR1泛素连接酶识别生长
素信号, Aux/IAAs促使蛋白酶体降解(中), ARFs脱离了 Aux/IAAs的结合, ARFs成为活化的转录因子, 促使生长素响应基因表达(右)。
2.2 作为 “分子胶 ”的生长素促使受体和效应蛋白
的 “ 粘合 ” 生长素分子究竟是怎样促进 TIR1和
Aux/IAA相互作用的？这一问题一直是植物学领域
研究的热点。为了深入探索这一问题, T a n 等
(2007)用X-衍射方法直接观察到生长素、TIR1和
Aux/IAA的结合状态。他们先将TIR1与ASK1 (泛
素化酶3的一个成分)蛋白混合形成结晶体, 这一结
晶体是SCF复合物的一个组成部分。TIR1和ASK1
形成的晶体结构大体上呈一个蘑菇状。ASK1 蛋
白与 TIR1的 F-box区域连接在一起, 形成蘑菇的
茎, TIR1中的-COOH末端18个LRRs (leucine-rich-
repeats)结构域形成蘑菇帽, 其中每个LRR由一段α
螺旋(位于外侧)、一段 β折叠(位于内侧)和一段形
成环(loop)的自由肽段(位于上部)组成。从上面往
下看, 蘑菇帽有种又呈马蹄状。在马蹄状中心附
近, 有 3个超长的环(loop), 即环 2、环 12和环 14,
相互围在一起形成一个酒杯状的口袋, 处于蘑菇帽
顶部的中心位置, 其大小正好可以容纳一个生长素
分子, Arg403处在酒杯的底部。生长素中的羧基
与底部的精氨酸残基通过盐键和氢键结合, 生长素
中的芳香环处于酒杯的顶部, 与其效应蛋白 Aux/
IAA的保守序列区域 II通过疏水键和范德华力结
合, 象一个茶杯的盖子一样恰好盖住口袋, 形成
SCFTIR1-Auxin-Aux/IAA复合物, 生长素分子就是这
图 3 生长素作用的结构与机制(Tan 和 Zheng 2008)
a: 拟南芥 SKP1 (ASK1)-TIR1- IP6复合体与生长素和AUX/
IAA结构域 II 结合的晶体结构; b: IP6协助 TIR1感应生长素信
号和生长素促进 TIR1 -AUX/IAA 相互作用的原理图。
样作为 “分子胶 ”通过羧基和受体结合, 通过芳香
环和效应蛋白结合, 将泛素连接酶3和其底物紧紧
地粘合在一起(图 3)。此种酒杯状的口袋可以容纳
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吲哚乙酸, 与吲哚乙酸类似的物质, 如 2,4-D、萘
乙酸等都可以结合, 并已经获得到与这些物质结合
的结晶结构, 从而彻底揭开了生长素结构和活性之
间关系的秘密。
过去人们常认为, 生长素与 TIR1结合后, 可
能导致TIR1的构象改变, 从而有利于与Aux/IAA结
合(Dharmasiri等 2005)。事实上, TIR1与生长素结
合前后构象并没有发生任何改变, 生长素只是填补
了两个蛋白(效应蛋白与受体)疏水沟壑, 从而增强
蛋白之间的相互作用; Aux/IAA与生长素结合后, 其
构象未发生改变。因此认为生长素仅仅是 “粘性 ”
很强的“胶”, 可将两种蛋白紧紧地粘连在一起(Tan
和 Zheng 2008)。
2.3 生长素的不同“粘性”差异 生长素具有“分子
胶 ”的特性, 不同类型的生长素分子有差异, 但其
“分子胶 ”的 “粘性”(活性)是否有差异呢？这一问
题的答案, 在 2005年Kepinski和Leyser(2005)采用
pul l - down a ssa y技术分析不同的生长素促进
SCFTIR1-Aux/IAA形成的活性效应的实验中已经得
到解决。放射性标记的方法证明, 不同的生长素与
SCFTIR1的结合能力不同, 在 SCFTIR1复合体与[3H]
IAA结合的同时分别用 IAA、1-NAA和2,4-D与之
竞争时, 其 IC50 (抑制一半时所需的浓度)分别为
1.2×10-7 mol·L-1、1.3×10-6 mol·L-1和 1.4×10-6 mol·L-1, 说
明 SCFTIR1与 IAA的结合能力大于其它两种。这说
明不同的 “分子胶”的 “粘性”是有差异的, 即天然
的生长素IAA的“粘性”明显高于人工合成的NAA
和 2,4-D。
2.4 作为 TIR1 辅助因子 IP6 的存在 肌醇六磷酸
(inositol hexakiaphosphate, IP6)是生长素受体 TIR1
的结合因子, 也是植物中第一个鉴定出来的 IP6类
辅助因子(Irvine 和 Schell 2001)。TIR1的 LRRs区
域与其它蛋白的 LRRs区域有所不同, 在分子中心
处连接一个 IP6分子, 这是用蛋白 pull-down 技术
纯化 TIR1-ASK1复合体时发现的。研究表明: IP6
紧紧地与TIR1的LRRs区域结合在一起, 位于生长
素结合位点的右下方, 即“酒杯状”口袋的底部, 与
TIR1的 Arg403和Ser438结合, 其作用可能是加固
生长素与 TIR1的结合。IP6是否有一些信号转导
作用还不清楚。TIR1同时和生长素、IP6两个小
分子结合可能是一个特例。
3 抗生长素的活性检测
2008年, Hayashi等用生物化学方法, 以 8个
生长素衍生物(图 4)作为探针, 分别与生长素受体
TIR 1 结合, 并分析其生物学活性( Ha ya s hi 等
2 0 0 8 )。他们采用拟南芥中的生长素报告系统
DR5::GUS (Ulmasov等 1997), 采用蛋白 pull-down
技术和X射线晶体学的方法检测这8个探针生长素
或抗生长素活性的结果表明: 在这些探针中, 烷基
链 α位点 -H分别为甲基、乙基、丙基取代的 3个
探针可以增强TIR1和Aux/IAA的相互作用和促进
Aux/IAA的降解, 说明这3个探针具有 IAA的活性;
烷基链 α位点 -H分别被丁基甚至更长链取代的 5
个探针阻碍TIR1和Aux/IAA的结合, 以及抑制Aux/
IAA的降解, 说明这5个探针具有抗IAA的活性, 其
抗性随着取代的烷基链的加长而增强。抗生长素
可阻碍 SCFTIR1-Auxin-Aux/IAA复合物的形成。
为了进一步验证 “ 分子胶 ” 的作用机制 ,
Hayashi等(2008)用AutoDock程序(Morris 等 1998)
分别用探针 3 (吲哚 -α-丙基 -3-乙酸)、探针 4 (吲
哚 -α-丁基 -3-乙酸)和探针 8 (吲哚 -α-叔丁氧基
羧基己烷基-3-乙酸) (图4)与生长素受体TIR1结合
的晶体结构进行研究的结果表明, 这三个探针与受
体 TIR1结合的方式均同于 IAA与受体 TIR1的结
合, 也同样容纳在TIR1与生长素结合的口袋内, 但
这些探针的烷基链正好朝着结合Aux/IAA的洞口,
处于无规则状态, S-构型比 R-构型更容易与 TIR1
结合, TIR1结合探针前后其构象并不发生变化(Tan
等2007)。为了进一步研究抗生长素探针的生理效
应, 他们在用 0.1~2 μmol·L-1 IAA的同时用不同浓
度(10~50 μmol·L-1)的探针 8 (吲哚 -α-叔丁氧基羧
基己烷基 -3-乙酸)作抗生素活性实验的结果表明:
探针 8 (吲哚 -α-叔丁氧基羧基己烷基 -3-乙酸)的
图 4 α烷基 IAAs (探针)的化学结构
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浓度越高, 抗生长素活性越强。探针 8的抗生长素
活性显然是其分子结构中长而又排列无序的烷基链
阻挠 IAA与其受体 TIR1结合; 探针 8 (吲哚 -α-叔
丁氧基羧基己烷基 -3-乙酸)的烷基链比其它分子
长, 其阻碍 TIR1、生长素和 Aux/IAA的能力强。
链较短的烷基并不影响生长素的“粘性”, 仍有生长
素活性。这样, TIR1与抗生长素探针结合的复合
体晶体结构遂为“分子胶”的作用机制提供了强有
力的证据。
4 结语
揭示生长素结构与活性之间的关系——“分子
胶 ”的作用机制, 解决了多年来一直困扰人们的难
题。从过去的 “两点连接理论 ”、“分离电荷理论”、
“结合位点模型”到目前的“分子胶模型”, 人们终
于认识到: 生长素分子原来是这样直接而简单地将
其受体与底物结合, 形成SCFTIR1-Auxin-Aux/IAA复
合物而发挥其生理效应的。
人们采用 UPS、蛋白 pull-down、同位素标
记、X-射线晶体学和反向遗传学技术等多种技术
终于揭示了生长素结构与活性之间“分子胶”作用
机制, 这一研究成果对今后的许多研究都可能有启
迪作用, 尤其是UPS的作用方式可能为更多的复杂
的生物过程所采用或效仿。
生长素结构与活性之间关系研究中的分子胶
作用机制仍待完善。其中的细节问题尚待深入研
究。如: (1)泛素连接酶介导的生长素感知和信号
转导新模型分布的普遍性。 TIR1几乎存在于所有
植物中, 在不同植物中的作用模式是否相同？拟南
芥中 TIR1有 5个同源蛋白, 即AFB1-5, 他们也是
生长素受体(Dharmasiri 等 2005), 但又都是 F-box
家族的成员, 其活性都可以受小分子受体调节。这
些同源蛋白是否也可用上述 “ 分子胶 ”方式起作
用？它们的效应蛋白是谁？是否还有非TIR1受体
通过其他途径转导生长素信号？(2)TIR1中结合了
IP6分子, IP6的具体作用尚待研究。已经知道,
IP6是其他信号。转导中的信号分子, 它仅仅是作
为 TIR1的辅酶而起作用还是具有信号分子的作
用？总之, 揭开生长素结构与活性之间关系之秘, 是
植物学研究领域中的一大盛事！这一成果将对今后
植物激素的研究起不可估量的推动作用。IP6的
功能和作用机制可能是今后植物生理与分子生物学
领域研究中的热点问题之一。
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